NGUYỄN THỊ THÙY LINH TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA HÀ NỘI 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KH[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THÙY LINH TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA HÀ NỘI - 2018 U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI an d Ph a NGUYỄN THỊ THÙY LINH rm ac y, VN KHOA Y DƯỢC ol of Me dic ine TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT Sc ho KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA Khóa: QH 2012.Y ThS BS Vũ Vân Nga HÀ NỘI - 2018 Co py rig ht @ Người hướng dẫn: ThS Phạm Thị Hồng Nhung PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U LỜI CẢM ƠN rm ac y, VN Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới ThS Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, ThS Vũ Vân Nga - Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy hướng dẫn bảo tận tình, cho tơi nhiều ý kiến nhận xét quý báu truyền đạt cho tinh thần học hỏi, làm việc nghiêm túc trình tơi thực khóa luận an d Ph a Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Thị Thơm – Giảng viên khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy tận tâm giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi sẵn sàng giải đáp thắc mắc để tơi hồn thành khóa luận Me dic ine Để thực tốt khóa luận này, tơi trân trọng cảm ơn tài trợ Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số QG.16.23 Trong trình học tập, làm việc thực khóa luận, tơi nhận giúp đỡ thầy cô bạn sinh viên làm việc thực tập Phịng thí nghiệm Bộ môn Y dược học sở – Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn ol of Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, toàn thể thầy cô giáo Khoa Y dược- Đại học Quốc gia Hà Nội cho kiến thức quý báu trình học tập trường Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2018 Nguyễn Thị Thùy Linh Co py rig ht @ Sc ho Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên, khích lệ tơi lúc khó khăn q trình thực khóa luận PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Base pair (Cặp bazơ nitơ) ADN Deoxyribo Nucleic Acid (Axit Deoxynucleic) dNTP Deoxynucleotide triphosphate DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography (Sắc kí y, rm ac lỏng cao áp biến tính) Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (Axit ethylene diamine tetraacetic) Ph a EDTA VN bp Hội chứng thận hư HCTHTP Hội chứng thận hư tiên phát Kb kilobase (= 1000 bp) NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm ine an d HCTH dic Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia – Mỹ) Gen mã hóa cho protein podocin NHLBI National Heart, Lung and Blood Instiute (Viện tim, phổi Me NPHS2 máu quốc gia) Optical density (Mật độ quang học) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài ho ol of OD SNP @ SSCP Sc đoạn cắt giới hạn) Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotit) Single strand conformation poly morphism (Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn) Short Tandem Repeat (Các đoạn lặp ngắn) TAE Đệm Tris base/axit acetic/ EDTA UTR Untranslated region (Vùng không dịch mã) Co py rig ht STR PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Trình tự mồi nhân dịng gen NPHS2 20 Bảng Thành phần điều kiện phản ứng PCR gen NPHS2 30 Bảng Tổng hợp SNP thuộc gen NPHS2 149 bệnh nhân 32 Bảng Các đột biến sai nghĩa thuộc gen NPHS2 nghiên cứu 33 Bảng Các đột biến vô nghĩa thuộc gen NPHS2 nghiên cứu 33 Bảng Tần số kiểu gen tần số alen SNP xuất alen đột biến 34 Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic ine an d Ph a rm ac y, Bảng PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VN Trang Tỉ lệ mắc hội chứng thận hư số nước Hình 1.2 Cơ chế bệnh học HCTH Hình 1.3 Gen NPHS2 protein podocin Hình 1.4 Tế bào biểu mơ có chân màng đáy cầu thận tương tác protein cấu tạo nên tế bào Hình 1.5 Các đột biến protein podocin mã hóa gen NPHS2 10 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu 23 Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số gel agarose 0,7% 25 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi exon gen NPHS2 27 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR tối ưu nồng độ mồi exon gen NPHS2 28 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR với nồng độ ADN khác exon gen NPHS2 29 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR exon gen NPHS2 sau tối ưu 29 Hình 3.6 Một số kết giải trình tự gen NPHS2 31 ho ol of Me dic ine an d Ph a rm ac y, Hình 1.1 Co py rig ht @ Sc Hình 3.7 Số lượng đột biến exon gen NPHS2 31 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN y, DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT rm ac DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ Ph a CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT an d 1.1.1 Khái niệm đặc điểm dịch tễ học 1.1.2 Cơ chế sinh bệnh học 1.1.3 Biến chứng liệu pháp corticosteroid điều trị HCTHTP ine 1.1.4 Tổng quan gen liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát dic 1.2 TỔNG QUAN VỀ GEN NPHS2 1.2.1 Vị trí, cấu trúc, vai trị gen NHPS2 Me 1.2.2 Đa hình di truyền gen NPHS2 of 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2 Ở BỆNH NHÂN MẮC HCTHTP 11 ol 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN ĐƠN NUCLEOTIT 13 ho CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 Sc 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 @ 2.1.2 Hóa chất 18 2.1.3 Thiết bị 19 ht 2.1.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 2.2.1 Thu thập bảo quản mẫu sinh phẩm 20 2.2.2 Tách chiết kiểm tra chất lượng ADN tổng số 20 Co py rig 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U 2.2.3 Nhân dòng exon gen NPHS2 PCR 21 VN 2.2.4 Xác định kiểu gen exon gen NPHS2 giải trình tự 23 2.2.5 Xác định tần số SNP thuộc gen NPHS2 23 y, 2.3 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU 24 rm ac CHƯƠNG KẾT QUẢ 26 3.1 TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ 26 3.2 NHÂN DÒNG EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG PCR 26 Ph a 3.3 XÁC ĐỊNH KIỂU GEN EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ 30 an d 3.4 TẦN SỐ ALEN CỦA CÁC ĐA HÌNH XUẤT HIỆN TRONG NGHIÊN CỨU 33 CHƯƠNG BÀN LUẬN 34 ine 4.1 VỀ TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH EXON ĐẦU CỦA GEN NPHS2 34 dic 4.2 VỀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ SNP XÁC ĐỊNH ĐƯỢC TRÊN EXON …36 Me KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 4.1 KẾT LUẬN 40 of 4.2 KIẾN NGHỊ 40 ol TÀI LIỆU THAM KHẢO Co py rig ht @ Sc ho PHỤ LỤC PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U VN ĐẶT VẤN ĐỀ Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic ine an d Ph a rm ac y, Hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) bệnh cầu thận mạn tính thường gặp trẻ em yếu tố nguy dẫn đến suy giảm chức thận [14, 65] Cho đến nay, phương pháp điều trị bệnh chủ yếu liệu pháp corticosteroid, thuốc ức chế miễn dịch ghép thận Theo tiêu chuẩn lâm sàng, HCTH phân loại dựa vào đáp ứng bệnh nhân với liệu pháp corticosteroid gồm hai nhóm: nhạy cảm kháng corticosteroid [14, 38] Phần lớn bệnh nhân mắc HCTHTP thường cảm thụ với liệu pháp này, nhiên việc điều trị kéo dài corticosteroid gây nhiều tác dụng phụ hội chứng Cushing, tăng huyết áp, đục thủy tinh thể, glaucoma, loãng xương, chậm phát triển thể chất [12] Bên cạnh đó, tỉ lệ khơng nhỏ (10 – 20% trường hợp) bệnh nhân mắc HCTHTP kháng corticosteroid có nguy cao tiến triển thành bệnh thận giai đoạn cuối [58] Nhiều trường hợp kháng corticosetorid chứng minh đột biến gen gây ảnh hưởng tới chức biệt hóa tế bào podocyte (tế bào biểu mơ có chân màng đáy cầu thận) Bệnh có tỷ lệ tái phát cao, diễn biến điều trị lâu dài tạo lo lắng, chán nản tiêu tốn nhiều tiền cho bệnh nhân gia đình người bệnh [6] Trên giới, nhiều cơng trình nghiên cứu HCTHTP thực để xác định nguyên nhân, chế biểu bệnh tính di truyền bệnh Những nghiên cứu áp dụng tiến di truyền học phân tử vài năm qua chứng minh có nhiều gen liên quan đến HCTHTP kháng corticosteroid, đột biến gen NPHS2 mã hóa cho protein podocin đóng vai trị quan trọng [49, 60] Các nhà khoa học xác định tổng cộng 89 đột biến điểm exon gen NPHS2, 56 đột biến tập trung từ exon đến exon chứng minh có liên quan chặt chẽ tới HCTHTP [41] Vì vậy, việc xác định đột biến gen NPHS2 nhằm tìm hiểu mối liên quan di truyền với đáp ứng thuốc hỗ trợ bác sĩ lâm sàng định phác đồ điều trị thích hợp cho bệnh nhân, hạn chế nhiều biến chứng thuốc giảm PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma rm ac y, VN U chi phí điều trị [43] Đây xu hướng tối ưu hóa điều trị theo cá thể, tích hợp xét nghiệm di truyền học phác đồ điều trị bệnh nhân Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu đa hình thái gen NPHS2 quy trình phân tích gen Từ nhu cầu lâm sàng tính cấp thiết nghiên cứu xây dựng phương pháp chẩn đoán, điều trị bệnh nhân mắc HCTHTP, tiến hành đề tài “Phân tích gen NPHS2 mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát” Ph a Mục tiêu nghiên cứu: an d - Xây dựng quy trình phân tích đa hình di truyền nằm exon đến exon thuộc gen NPHS2 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP Việt Nam - Xác định tần số đa hình gen NPHS2 149 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP Việt Nam ine Nội dung nghiên cứu: Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic - Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dòng exon đến exon thuộc gen NPHS2 - Giải trình tự xác định đa hình gen NPHS2 - Áp dụng quy trình phân tích gen để khảo sát tần số kiểu gen tần số alen 149 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP Việt Nam PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT 1.1 y, 1.1.1 Khái niệm đặc điểm dịch tễ học Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic ine an d Ph a rm ac Hội chứng thận hư biểu thường gặp bệnh cầu thận nguyên phát, diễn biến kéo dài nhiều năm với đợt bột phát, xen lẫn thời kỳ thuyên giảm Đây hội chứng lâm sàng sinh hóa xuất nhiều bệnh tổn thương cầu thận đặc trưng phù, protein niệu cao, protein máu giảm, rối loạn lipid máu đái mỡ [6] Hội chứng thận hư tiên phát HCTH khơng có ngun nhân rõ ràng, khởi phát sớm tháng tuổi, với hình thái bệnh lí tổn thương cầu thận: tổn thương tối thiểu, xơ cứng hyalin hoá cục phần tăng sinh gian mạch lan toả Bệnh hay gặp tuổi tiền học đường học đường (5 – 10 tuổi) [8] Hội chứng thận hư kháng steroid (Steroid-resistant nephrotic syndrome - SRNS) định nghĩa tình trạng bệnh nhân mắc hội chứng thận hư không đạt thuyên giảm sau điều trị đầy đủ theo liệu pháp corticosteroid tiêu chuẩn Hội chứng thận hư kháng corticosteroid chiếm khoảng 10% - 15% hội chứng thận hư trẻ em có xu hướng tiến triển đến giai đoạn cuối bệnh thận vòng 10 năm [44] Khi bệnh nhân cần điều trị lọc máu ghép thận với chi phí cao Tỷ lệ mắc HCTHTP thay đổi theo tuổi, giới, chủng tộc, địa dư địa Tuổi mắc bệnh trung bình trẻ em Việt Nam 8,7 ± 3,5 (tuổi học) số nghiên cứu giới cho thấy tuổi mắc bệnh thấp thường gặp trẻ em trước tuổi học Trẻ nam gặp nhiều trẻ nữ (tỷ lệ 2:1) Về chủng tộc, trẻ em Châu Á bị bệnh nhiều Châu Âu (với tỷ lệ 6:1); trẻ em Châu Phi mắc HCTHTP, trẻ em da đen mắc HCTHTP thường bị kháng corticosteroid [52] Ở Mỹ, tỉ lệ mắc hàng năm ước tính 2,0 – 2,7/100.000 ca, tỉ lệ mắc 16/100.000 người Tại Anh, hàng năm tỉ lệ mắc trẻ em gốc Á (Đông Nam Á, Nhật, Ấn Độ) cao gấp lần trẻ em châu Âu (Hình 1.1 thể tỉ lệ mắc HCTH số nước giới) Ở nước ta, khoa Nhi PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma dic ine an d Ph a rm ac y, VN U bệnh viện đa khoa tỉnh, số trẻ em mắc hội chứng thận hư (HCTH) chiếm khoảng 0.5 – 1% tổng số bệnh nhi điều trị nội trú chiếm 10 – 30% tổng số bệnh nhi bị bệnh thận Tại Bệnh viện Nhi Trung Ương số bệnh nhân bị thận hư chiếm gần 2% tổng số bệnh nhân chiếm 40% tổng số bệnh nhân khoa thận [1, 10] Me Hình 1.1 Tỉ lệ mắc hội chứng thận hư số nước giới [27] of 1.1.2 Cơ chế sinh bệnh học Co py rig ht @ Sc ho ol Cơ chế sinh bệnh học HCTHTP đến chưa biết đầy đủ Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy có rối loạn chức tế bào lympho T dẫn đến rối loạn đáp ứng miễn dịch Các protein đặc biệt Albumin xuất nước tiểu biến đổi cấu trúc màng lọc, mở rộng lỗ lọc điện tích âm màng đáy Một số bệnh nhân mang điện tích dương huyết tương phân tử protein trung hịa điện tích âm thành mao mạch cầu thận Ngồi số nghiên cứu cịn cho thấy có vai trò yếu tố di truyền chế sinh bệnh học HCTHTP Gần người ta thấy thay đổi phân tử creatin bộc lộ chân lồi tế bào biểu mơ có chân, đặc biệt nephrin, podocin α-actin có vai trị gây xuất protein niệu [4] Hình 1.2 mơ tả chế gây albumin từ máu nước tiểu HCTH PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U VN y, rm ac Ph a an d Hình 1.2 Cơ chế bệnh học HCTH [53] Hầu hết bệnh nhân bị HCTH kháng corticosteroid không rõ nguyên nhân Tuy nhiên 1/4 đến 1/3 trường hợp HCTH kháng corticosteroid trẻ em HCTH bẩm sinh chứng minh nghiên cứu có nguyên nhân gen làm ảnh hưởng tới biệt hóa chức tế bào podocyte [33] ine 1.1.3 Biến chứng liệu pháp corticosteroid điều trị HCTHTP Thần kinh, tâm thần: rối loạn tâm thần, trầm cảm Tim mạch: tăng huyết áp, suy tim bù Tiêu hóa: bệnh lý dày – tá tràng (loét, chảy máu, thủng), viêm tụy Nội tiết: hội chứng Cushing, chậm phát triển trẻ em Chuyển hóa: tăng glucose máu, đái tháo đường, kali Co py rig ht - @ Sc ho ol of Me dic Những chứng rối loạn miễn dịch sở để sử dụng corticosteroid thuốc ức chế miễn dịch khác điều trị HCTHTP Khi chưa có corticosteroid, tỉ lệ lớn bệnh nhân bị HCTH chết tiến triển đến bệnh thận giai đoạn cuối nhanh chóng Từ năm 1950, corticosteroid sử dụng điều trị HCTH giúp giảm tỉ lệ tử vong trẻ em bị HCTH xuống cịn khoảng 3% Corticosteroid có tác dụng giảm viêm cầu thận điều trị HCTHTP, từ triệu chứng bệnh giảm hồn toàn Với trẻ bị HCTH giai đoạn đầu, 90% trẻ đáp ứng với liệu pháp corticosteroid [45] Tuy nhiên, bệnh có khả tái phát cao, cần theo dõi lâu dài tuân thủ phác đồ cách xác Mặt khác, điều trị corticosteroid thời gian dài gây nhiều biến chứng nghiêm trọng [12, 45]: PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma rm ac y, VN U - Cơ xương khớp: loãng xương, hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi, yếu cơ, nhược - Mắt: Glaucoma, đục thủy tinh thể bao - Da: trứng cá, teo da, ban, tụ máu, đỏ mặt, chậm liền sẹo - Nhiễm khuẩn - Tai biến ngừng thuốc đột ngột: suy thượng thận cấp ho ol of Me dic ine an d Ph a Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu HCTHTP thực hiên cho thấy tỉ lệ bệnh nhân HCTH kháng thuốc 10 – 20% có xu hướng ngày tăng [11, 31] Theo kết nghiên cứu Lê Nam Trà cộng 42 trẻ bị HCTHTP kháng corticosteroid điều trị methylprenisolon liều cao truyền tĩnh mạch, tỉ lệ thuyên giảm hoàn toàn 33,3%, thuyên giảm phần 30,9% không đáp ứng 35,7% [8] Những nghiên cứu phân tích đột biến gen mã hóa tổng hợp protein tham gia cấu trúc màng lọc cầu thận phần chứng minh giả thiết nguyên nhân gây kháng thuốc gen Bằng chứng di truyền khả đáp ứng không đáp ứng với corticosteroid bệnh nhân mắc hội chứng thận hư ngày công nhận [30] Vấn đề chế dẫn đến việc bệnh nhân ban đầu đáp ứng với corticosteroid sau lại kháng với corticosteroid (hiện tượng kháng corticosteroid muộn) đặt Vì vậy, xét nghiệm gen di truyền ngày trở thành công cụ có giá trị việc xác định đột biến gen có liên quan đến hội chứng thận hư di truyền tính kháng steroid, từ có hướng điều trị hiệu tương lai tránh trường hợp sinh thiết thận không phù hợp [13] Co py rig ht @ Sc 1.1.4 Tổng quan gen liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát Hơn hai thập kỉ qua, sở phân tử HCTH kháng corticosteroid nghiên cứu trường hợp mắc HCTH kháng corticosteroid có tính chất gia đình trường hợp ngẫu nhiên Các đột biến gen mã hóa cho protein tế bào biểu mơ có chân (podocyte) mơ tả nguyên nhân HCTH kháng corticosteroid di truyền Đến nay, đột biến 10 gen (NPHS1, NPHS2, PLCE1, CD2AP, ACTN4, TRPC6, INF2, MYO1E, PTPRO ARHGDIA) liên quan đến dạng khác HCTH kháng corticosteroid mô tả 11 gen khác xác định có liên PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Sc ho ol of Me dic ine an d Ph a rm ac y, VN U quan (WT1, LMX1B, LAMB2, ITGB4, SCARB2, COQ2, PDSS2, MTTL1, SMARCA, MYH9 NXF5) [23] Kết nghiên cứu thực giới gen sau nguyên nhân phổ biến HCTH kháng corticosteroid: - Đột biến gen NPHS1 mã hóa nephrin tế bào podocyte, thường gặp lứa tuổi nhỏ, đặc biệt HCTH bẩm sinh thể Phần Lan [31, 36] - Đột biến gen NPHS2 mã hóa protein podocin tế bào podocyte, thường gặp lứa tuổi lớn HCTH kháng thuốc có tính chất gia đình Đột biến gen NPHS2 gặp khoảng từ 10 – 30 % trẻ bị HCTH kháng thuốc Châu Âu Trung Đông, ngược lại tỉ lệ lại trẻ em Mỹ gốc Phi [37, 54, 60, 69] - WT1 mã hóa cho di truyền ức chế protein khối u liên quan đến phát triển thận hệ sinh dục Đột biến gen WT1-Wilm’tumor gặp tất trường hợp bị HCTH tiên phát kháng corticosteroid [36, 59] - Gen gặp LAMB2 mã hóa lamin beta 2, PLCE1 mã hóa phospholipase C epsilon TRP6 mã hóa cho kênh dẫn truyền canxi nằm màng lipid tạo thành phức hệ với podocin quy định chế cảm nhận màng lọc cầu thận [36] - Đột biến gen NPHS3 đột biến gen epsilon phospholipase C (PLCE1 hay NPHS3) thường kết hợp với HCTH bẩm sinh xơ hóa gian mạch lan tỏa [35] - Các gen khác gồm ACTN4 mã hóa alpha-actinine 4, TRPC6 mã hóa cho kênh dẫn truyền canxi nằm màng lipid INF2 mã hóa protein điều hịa actin, gen gây HCTH di truyền trội với xơ hóa cầu thận cục thường xuất trẻ vị thành niên người trẻ tuổi [68] Co py rig ht @ Trên sở nghiên cứu này, đột biến gen NPHS2 mô tả nguyên nhân quan trọng chế kháng thuốc bệnh nhân mắc HCTHTP tìm thấy quần thể khác với tần số mức độ biểu khác [20, 25] Vì vậy, nghiên cứu chúng tơi lựa chọn phân tích gen NPHS2 bước đầu cho nghiên cứu mối liên quan đột biến tìm thấy với đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, đáp ứng điều trị tiên lượng bệnh nhân người Việt Nam mắc HCTHTP PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U 1.2 TỔNG QUAN VỀ GEN NPHS2 1.2.1 Vị trí, cấu trúc, vai trị gen NHPS2 dic ine an d Ph a rm ac y, Gen NPHS2 người xác định vị trí vào năm 2000, có độ dài khoảng 25 kb vai dài nhiễm sắc thể số (1q25-q31) bao gồm exon [21] (Hình 1.3) Co py rig ht @ Sc ho ol of Me Hình 1.3 Gen NPHS2 protein podocin A Vị trí gen NPHS2 nhiễm sắc thể số B Cấu trúc đoạn exon intron gen NPHS2 mã hóa protein Podocin Các exon kí hiệu hình chữ nhật màu đen, intron thể đường gạch nối exon UTR vùng không dịch mã C Cấu trúc protein podocin (Nguồn: Genetics in Medicine) NPHS2 mã hóa cho protein podocin, biểu tế bào podocyte cầu thận Podocyte tế bào biểu mơ biệt hóa bao quanh mặt ngồi màng lọc cầu thận (Hình 1.4) Những tế bào phân ngón thành chân bám vào mặt ngồi màng đáy, khe chân giả tạo lỗ lọc đường kính khoảng n Å cho dịch lọc qua Podocin protein màng, cấu tạo từ 383 axit amin trọng lượng 42 kD, thuộc họ stomatin có cấu trúc giống kẹp tóc, hai đầu phân tử protein podocin nằm tế bào chất Podocin tồn dạng oligo màng lipid kép tập trung nhiều khe màng lọc cầu thận, nơi tương tác với protein khác CD2AP hay nephrin [20] PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U VN y, rm ac Ph a an d ine dic of Me Hình 1.4 Tế bào biểu mơ có chân màng đáy cầu thận tương tác protein cấu tạo nên tế bào (Nguồn: Diagnostic Pathology: Kidney diseases E-Book by Robert B Colvin, Anthony Chang) Co py rig ht @ Sc ho ol 1.2.2 Đa hình di truyền gen NPHS2 Kruglyak Nickerson (2001) ước tính hai hệ gen người bình thường trung bình giống trình tự nucleotit tới 99,9% Trong phần khác biệt di truyền cịn lại đến 90% đa hình đơn nucleotit (single nucleotit polymorphism, viết tắt SNP) [46] SNP đột biến thay nucleotit trình tự ADN với tần số lớn 1% quần thể Nhiều nghiên cứu đến cho thấy hầu hết SNP phổ biến có hai alen khoảng 2/3 SNP hệ gen người có nguồn gốc đột biến đồng hốn SNP có ý nghĩa quan trọng loại biến dị di truyền phổ biến ổn định, 99,9% trình tự hệ gen giống biến đổi phần cịn lại coi có ảnh hưởng lớn đến việc cách mà người có phản ứng khác với bệnh tật, với nhân tố môi trường vi khuẩn, vi rút, độc tố hóa chất, thuốc liệu pháp điều trị khác PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Me dic ine an d Ph a rm ac y, VN U Các SNP nằm vùng mã hóa gen làm thay đổi cấu trúc chức protein dịch mã mục tiêu thường phân tích nhằm chẩn đốn bệnh lý giải cho việc người lại đáp ứng khác với loại thuốc điều kiện mơi trường Các điểm đa hình nucleotit cho thấy tiềm không giới hạn việc nghiên cứu tác động chúng đến đường sinh bệnh học [61, 64] Mặc dù tác động SNP riêng rẽ đến hình thành bệnh tương đối yếu tổ hợp chúng làm tăng đáng kể nguy gây bệnh Cùng với liên quan đến khả đáp ứng thuốc, khả hấp thụ, chuyển hóa thuốc phân tử khác [66] Vì vậy, việc nghiên cứu mối liên hệ SNP với hình thành bệnh cần thiết nhằm tìm thị di truyền đặc trưng cho quần thể Do có cấu trúc đơn giản, thay đổi nucleotit nên kĩ thuật sinh học phân tử phân tích nhanh chóng hiệu kiểu gen hàng trăm hay hàng ngàn cá nhân cho hàng trăm hay hàng ngàn SNP [47] Các nhà di truyền học hy vọng tương lai hồn thiện đồ SNP có liên quan đến bệnh lý, tiến đến việc giải mã chức gen cá thể giúp tiên lượng nguy mắc bệnh, từ có lời khun thích hợp vấn đề phòng bệnh cá thể Co py rig ht @ Sc ho ol of Nhiều dạng đa hình gen NPHS2 xác định, chủ yếu SNP (Hình 1.5) Hình 1.5 Các đột biến podocin (Nguồn: Weber et al: Podocin gene mutation screening) 10 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ho ol of Me dic ine an d Ph a rm ac y, VN U Các nhà khoa học xác định 89 đột biến điểm exon gen NPHS2, 56 đột biến tập trung từ exon đến exon chứng minh có liên quan chặt chẽ tới HCTHTP; 33 đột biến tập trung exon chưa tìm mối liên quan chặt chẽ với HCTHTP [41, 42] Bên cạnh nghiên cứu exon, có số nghiên cứu đột biến intron NPHS2, nhiên chưa có mối liên hệ rõ ràng đột biến intron gen với HCTHTP kháng thuốc [34, 41] Sáu mươi bảy biến thể đa hình NPHS2 công bố gồm 22 SNP thuộc vùng mã hóa, có SNP làm thay đổi axit amin 14 SNP không làm thay đổi axit amin 45 đột biến lại nằm vùng khơng mã hóa gồm 13 thay đổi intron, 26 thay đổi vùng promoter thay đổi vùng UTR Đột biến p.R229Q (c.686G>A) thay nucleotit G thành A vị trí 686 exon dẫn đến thay đổi axit amin arginine thành glutamine [21] Vì vậy, đặc điểm sinh học chuỗi peptit mã hóa thay đổi Nghiên cứu invitro cho thấy podocin giảm đáng kể liên kết với nephrin [63] Tỷ lệ xuất alen p.R229Q (c.686G> A) phụ thuộc vào dân tộc: 0,030,13 châu Âu [25, 42, 63], 0,005-0,025 cá nhân từ gốc Phi Châu [29, 55, 63] Các biến thể p.A61V (c.182C> T) p.A242V (c.725C> T) SNP làm thay đổi protein mã hóa chủ yếu cá nhân người Mỹ gốc Phi, với tần suất tương đối 0,015 0,076 (NHLBI Exome Sequencing Project) Năm 2011, Ren Q Yu Sy nghiên cứu 35 bệnh nhân nhi 30 người đối chứng khỏe mạnh phát SNP: 288C>T thể dị hợp exon 2, 945T>C thể đồng hợp 1038A>G thể dị hợp exon [56] Sc 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2 Ở BỆNH NHÂN MẮC HCTHTP Co py rig ht @ Trên giới, nhà nghiên cứu tiến hành phân tích đa hình di truyền gen NPHS2 nhóm bệnh nhân mắc hội chứng thận hư khác Năm 2000, Boute cộng lần đầu phân tích đột biến gen NPHS2 phát đột biến gen lặn nhiễm sắc thể thường bệnh nhân người Mỹ với HCTH kháng thuốc [21] Các nghiên cứu trước tần số đột biến gen NPHS2 quần thể khác cho thấy chủng tộc đóng vai trị quan trọng Các đa hình di truyền gen NPHS2 cơng bố có ảnh hưởng 11 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Me dic ine an d Ph a rm ac y, VN U khác đến đặc điểm lâm sàng protein niệu xuất sớm, tiến triển nhanh đến bệnh thận giai đoạn cuối khác biệt thể mô bệnh học [19, 44, 65] Tuy nhiên, khơng có đồng thuận exon ảnh hưởng đến HCTH hay đột biến exon có hại [32] Năm 2007, Berdeli nghiên cứu đột biến gen NPHS2 295 trẻ em Thổ Nhĩ Kì mắc HCTHTP kháng thuốc thấy: 41 bệnh nhân (chiếm tỉ lệ 13,8%) có tiền sử gia đình 254 bệnh nhân (chiếm 86,2%) trường hợp ngẫu nhiên Phân tích exon gen NPHS2 phương pháp giải trình tự thấy có 53 đột biến, 37 đột biến Tỷ lệ phát đột biến 24,7% tất bệnh nhân, 29,2% nhóm có tiền sử gia đình 24% nhóm ngẫu nhiên [18] Trong nghiên cứu Basiratnia cộng năm 2013 99 trẻ em mắc hội chứng thận hư Tây Nam Iran, sau phân tích kết hai nhóm nhóm kháng corticosteroid (49 bệnh nhân) nhóm nhạy cảm với corticosteroid (50 bệnh nhân), đề xuất phác đồ điều trị cho nhóm trẻ em mắc HCTH kháng thuốc dựa xác định đột biến gen NPHS2 [51] Joshi cộng năm 2013 nghiên cứu biểu đa dạng đột biến gen NPHS2 chủng người quốc gia khác Từ đề xuất tiếp cận có hệ thống để kiểm tra di truyền cho bệnh nhân mắc HCTH kháng thuốc nhằm hỗ trợ bác sĩ việc lựa chọn điều trị thích hợp [40] Co py rig ht @ Sc ho ol of Mặc dù vậy, có số nghiên cứu phân tích exon khác gen NPHS2 đối tượng bệnh nhân mắc HCTH lại khơng tìm thấy đột biến gen Nghiên cứu Dedi Rachmadi cộng năm 2015 đối tượng bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư kháng steroid Indonesia phân tích đa hình di truyền exon 1, phương pháp giải trình tự gen mối liên quan với biểu lâm sàng Kết cho thấy khơng có mối tương quan đa hình di truyền gen NPHS2 xác định với biểu lâm sàng bệnh nhân (p>0,05) không tìm thấy đột biến Tuy nhiên, tác giả đưa kết luận nghiên cứu có 28 59 mẫu giải trình tự thành cơng hạn chế thời gian tài [28] Vì exon khác gen mã hóa cho protein podocin đóng vai trị chế sinh bệnh học hội chứng thận hư kháng 12 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ... NGUYỄN THỊ TH? ?Y LINH rm ac y, VN KHOA Y DƯỢC ol of Me dic ine TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT Sc ho KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH... ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2 Ở BỆNH NHÂN MẮC HCTHTP Co py rig ht @ Trên giới, nhà nghiên cứu tiến hành phân tích đa hình di truyền gen NPHS2 nhóm bệnh nhân mắc hội chứng thận hư khác Năm 2000,... máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát? ?? Ph a Mục tiêu nghiên cứu: an d - X? ?y dựng quy trình phân tích đa hình di truyền nằm exon đến exon thuộc gen NPHS2 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP Việt