Enzyme laccase ứng dụng trong tách chiết polyphenol giàu egcg từ chè xanh loại f

Enzyme laccase ứng dụng tách chiết polyphenol giàu EGCG từ chè xanh loại F GVHD: TS.Đỗ Biên Cương NỘI DUNG TỔNG QUAN QUY TRÌNH • Enzyme laccase • Nguyên liệu • Polyphenol • • Phương pháp định lượng polyphenol tổng Phương pháp tách chiết ẢNH HƯỞNG CỦA ENZYME LACCASE • Phân tích hàm lượng EGCG • Hiệu suất thu hồi polyphenol • Thời gian tách chiết polyphenol TỔNG KẾT • Đánh giá chất lượng polyphenol theo phương pháp enzyme TỔNG QUAN Laccase hay gọi p-diphenol: “ dioxygen oxidoreductases (EC 1.10.3.2) thuộc nhóm enzyme oxi hóa đa nhân đồng xúc tác phản ứng khử điện tử O2 tạo thành nước, đồng thời oxi hóa hợp chất hữu Laccase oxi hóa đa dạng hợp chất phenol, polyphenol, aniline, aryl diamine, methoxy phenol, hydroxyindol, benzenethiol, hỗn hợp kim loại vô cơ/hữu nhiều hợp chất khác TỔNG QUAN Polyphenol thành phần quan “ trọng nhất, định đến màu sắc, hương vị tính chất dược lý nước chè pha Thành phần polyphenol chè hợp chất catechin Tỷ lệ chất thành phần hỗn hợp polyphenol chè không giống mà thay đổi theo giống, tiêu chuẩn mùa vụ thu hái, điều kiện vĩ độ, thổ nhưỡng, kỹ thuật canh tác, TỔNG QUAN Phương pháp định lượng polyphenol tổng: Sử dụng phương pháp Lowenthal Phân tích hàm lượng EGCG (Epigallocatechin gallat) – chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh EGCG phân tích định tính định lượng hệ thống HPLC Alliance series 2695, detector PDA 2996 Điều kiện phân tích: - Cột tách: Sunfire -C18 RP (4.6 x 150 mm), 5µm; - Pha động: Kênh A: H2O + 0,1% axit focmic; Kênh B: Methanol - Tốc độ dòng ml/phút, chạy gradient từ 100/0; 85/15; 50/50; 30/70 đến 0/100 (v/v) - Detector PDA: bước sóng 273 nm - Chất chuẩn: EGCG hãng Sigma (≥ 98%) - Thể tích tiêm 5µl - EGCG chuẩn (Merck) cân xác 25 mg cho vào bình định mức (25 ml) sau thêm MeOH vạch ta dung dịch gốc Pha loãng dung dịch gốc thành dung dịch có nồng độ 0,1; 0,2; 0,4; 0,5; 1,0 mg/ml, sau chạy dung dịch có nồng độ qua hệ thống HPLC với cột phân tích: Sunfire -C18 RP (4.6 x 150 mm), 5µm - Các nồng độ EGCG chuẩn 0,1; 0,2; 0,4; 0,5; 1,0 mg/ml đo lặp lại lần, kết thu có ổn định cao giá trị tích phân (diện tích pic) thời gian lưu QUY TRÌNH NGUYÊN LIỆU M ẫu chè loại F, trồng Tân Cương - Thái Nguyên Một số tiêu chất lượng xác định: Độ ẩm 9,5%; Hàm lượng polyphenol tổng 15,4% hàm lượng EGCG tổng polyphenol 47,89% Enzyme laccase thô: tách từ dịch nuôi cấy nấm linh chi Ganoderma lucidum (giống cấp Viện Di truyền nông nghiệp cung cấp) Giống nấm hoạt hóa trở lại mơi trường PDA giữ giống ống thạch nghiêng 4-8 độ C Để sản sinh enzyme laccase thô, G lucidum ni cấy canh trường PDA lỏng có bổ sung chất cảm ứng ABTS 0,1% (2,2 azinobis-(3ethylbenzenthiazoline-6- sulfonic acid) Dịch enzyme laccase thơ thu sau q trình lọc ly tâm xác định hoạt độ enzyme 185 UI/ml dựa vào ABTS bước sóng 420 nm QUY TRÌNH cChè khơ nghiền PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH POLYPHENOL - Chiết ( 85 độ C/ 4h; NL/nước : 1/10 Phân đoạn nước/diclometan ( 2/1; lần Thu pha nước - Phân đoạn nước/ethyl acetate (2/1; lần) Thu lớp ethyl acetate - Cô đặc chân không - Sấy đông khô Bột polyphenol Chè vụn nghiền nhỏ đến rây 1,5mm sau nạp vào bình chiết Sử dụng dung dịch axit citric có pH = (dung dịch/nguyên liệu chè = 10/1; l/kg) Gia nhiệt đến 85 độ C trì khuấy liên tục nhiệt độ Sau giờ, dịch chiết để nguội xuống nhiệt độ phòng, lọc thu riêng phần dịch nước phần bã Dịch lọc chiết phân bố với diclometan (v/v = 2/1; lần), thu riêng phần dịch nước phần dịch diclometan Sau cùng, dịch nước chiết lặp lại với ethyl acetate (v/ v = 2/1; lần) Dịch chiết ethyl acetate gộp lại, làm khan Na2SO4 khan cô chân không màng mỏng để thu nhận “polyphenol tổng” thu hồi ethyl acetate Enzyme laccase có khả chia cắt đặc hiệu thành phần cấu trúc bao quanh tế bào thực vật, làm cho trình tiếp xúc dung mơi chất chiết trở nên dễ dàng 3 ẢNH HƯỞNG CỦA ENZYME LACCASE Ảnh hưởng việc xử lý enzyme đến hiệu suất thu hồi polypheno ẢNH HƯỞNG CỦA ENZYME LACCASE Ảnh hưởng việc xử lý enzyme đến thời gian chiết xuất polyphenol TỔNG KẾT Đánh giá chất lượng polyphenol thu theo phương pháp enzyme Mẫu không sử dụng enzyme xác định hàm lượng EGCG polyphenol tổng 42,66% với mẫu sử dụng enzyme 42,31% 10 TỔNG KẾT TỔNG KẾT Việc tiền xử lý nguyên liệu chè xanh enzyme laccase làm tăng đáng kể hiệu suất thu hồi polyphenol (hiệu suất > 95% so với 83,63% không sử dụng enzyme) Đồng thời, q trình sử dụng enzyme khơng làm biến đổi chất lượng EGCG - thành phần nhạy cảm có hoạt tính tốt polyphenol từ chè xanh 11 LINK, TÀI LIỆU THAM KHẢO 1,http://thuvienso.bvu.edu.vn/bitstream/TVDHBRVT/19850/1/ Tong-Thi-Ngoc-Be.pdf 2, Hồng Thị Bích & cs, 2016 Investigation of inenzyme treatments to assist extraction of essential oil from the leaves and branches of Cinamomum cassia collected in Yen Bai province Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Tập 54 (2C), 479- 485 3, Trần Bạch Dương & cs, 2014 Xây dựng thử nghiệm quy trình cơng nghệ sản xuất nguyên liệu dược phẩm epigallocatechin gallat (EGCG) từ chè xanh 4, NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG THỦY PHÂN LÁ CHÈ XANH BẰNG ENZYME VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ CHIẾT TÁCH POLYPHENOL EFFECTS OF ENZYMATIC HYDROLYSIS ON ISOLATION YIELD OF POLYPHENOL FROM VIETNAM GREEN TEA (CAMELLIA SINENSIS) LEAVES Lành Thị Ngọc1,*, Phạm Thị Ngọc Mai1, Nguyễn Quang Tùng2, Đào Thị Kim Dung3, Đỗ Thị Thanh Trung3, Trần Quốc Toàn 12 THANK YOU ❤ Các bạn có câu hỏi khơng nhỉ?? 😒 ... gallat (EGCG) từ chè xanh 4, NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG THỦY PHÂN LÁ CHÈ XANH BẰNG ENZYME VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ CHIẾT TÁCH POLYPHENOL EFFECTS OF ENZYMATIC HYDROLYSIS ON ISOLATION YIELD OF POLYPHENOL FROM VIETNAM... M ẫu chè loại F, trồng Tân Cương - Thái Nguyên Một số tiêu chất lượng xác định: Độ ẩm 9,5%; Hàm lượng polyphenol tổng 15,4% hàm lượng EGCG tổng polyphenol 47,89% Enzyme laccase thô: tách từ dịch... liệu chè xanh enzyme laccase làm tăng đáng kể hiệu suất thu hồi polyphenol (hiệu suất > 95% so với 83,63% không sử dụng enzyme) Đồng thời, q trình sử dụng enzyme khơng làm biến đổi chất lượng EGCG