Nghiên cứu tổng hợp hạt nano từ tính fe 3o4 dùng trong tách chiết dna

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO TỪ TÍNH Fe3O4 DÙNG TRONG TÁCH CHIẾT DNA Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Khoa Học Cơ Bản Chủ trì nhiệm vụ: Bùi Trung Thành Thành phố Hồ Chí Minh - 2020 ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO TỪ TÍNH Fe3O4 DÙNG TRONG TÁCH CHIẾT DNA (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 8-1-2020) Cơ quan chủ quản (ký tên đóng dấu) Chủ trì nhiệm vụ (ký tên) Bùi Trung Thành Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc TP Hồ Chí Minh, ngày 23 tháng 12 năm 2019 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC I THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp hạt nano từ tính Fe3O4 dùng tách chiết DNA Thuộc lĩnh vực (tên lĩnh vực): Vật liệu nano từ tính ứng dụng y học Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Bùi Trung Thành Ngày, tháng, năm sinh: 16/2/1968 Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: Thạc sĩ Chức danh khoa học: Giảng viên Chức vụ Điện thoại: Tổ chức: Nhà riêng: Mobile: 0938795801 Fax: E-mail: buitrungthanh@ump.edu.vn Tên tổ chức công tác: Bộ môn Vật Lý, Khoa Khoa Học Cơ Bản, Đại Học Y Dƣợc TP HCM Địa tổ chức: 217 Hồng Bàng, Q 5, TP HCM Địa nhà riêng: 50/15 Đƣờng 13, P Bình Hƣng Hịa, Q Bình Tân, TP HCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ(1): Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Khoa Khoa Khoa Học Cơ Bản Điện thoại: Fax: E-mail: Website: Địa chỉ: Tên quan chủ quản đề tài: Đại học Y Dƣợc thành phố Hồ Chí Minh II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng năm 2017 đến tháng năm 2019 - Thực tế thực hiện: từ tháng năm 2017 đến tháng 12 năm 2019 tiếp cá nhân làm chủ nhiệm đề tài - Đƣợc gia hạn (nếu có): Từ tháng năm 2019 đến tháng 12 năm 2019 Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 95 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học nhà trƣờng: 10 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: 85 tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 7/2017 7/2018 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 7/2017 7/2018 Ghi (Số đề nghị toán) 5 c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đơn vị tính: Triệu đồng Theo kế hoạch Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thơng) Ngun, vật liệu, lƣợng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Tổng NSKH Thực tế đạt Tổng NSKH Nguồn khác 7 Nguồn khác 85 85 85 85 95 10 85 95 10 85 - Lý thay đổi (nếu có): Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Nam Khoa Biotek Co Tên tổ chức tham gia thực Nam Khoa Biotek Co Nội dung tham gia chủ yếu Thiết kế primer, thực xét nghiệm PCR Sản phẩm chủ yếu đạt Khuếch đại DNA tách chiết hạt nano Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số Tên cá nhân Nội dung Tên cá nhân Sản phẩm Ghi đăng ký theo Thuyết minh Bùi Trung Thành tham gia thực Bùi Trung Thành Phạm Hùng Vân Phạm Hùng Vân Nguyễn Việt Quốc Nguyễn Việt Quốc TT tham gia Chủ nhiệm đề tài, chế tạo hạt nano, tách chiết DNA, viết báo cáo đề tài Cố vấn khoa học Thực xét nghiệm PCR chủ yếu đạt Chế tạo đƣợc hạt nano có chức tách chiết DNA chú* Thiết kế primer, định hƣớng nghiên cứu Chẩn đoán bệnh xét nghiệm sinh học phân tử - Lý thay đổi ( có): Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Theo kế hoạch Thực tế đạt Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, (Nội dung, thời gian, TT địa điểm ) kinh phí, địa điểm ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, cơng việc chủ yếu: (Nêu mục .của đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngồi) Số TT Các nội dung, cơng việc chủ yếu (Các mốc đánh Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế Thực tế Người, quan thực giá chủ yếu) Chế tạo hạt nano Fe3O4 Chức hóa hạt nano Tách chiết DNA, xét nghiệm sinh học phân tử hoạch 6/2017 – 6/2018 6/2018 – 12/2018 12/2018 – 3/2019 đạt đƣợc 6/2017 – 6/2018 6/2018 – 6/2019 6/2019 – 9/2019 Viết báo cáo, nghiệm thu 3/2019 – 6/2019 9/2019 – 12/2019 Bùi Trung Thành, Khoa Khoa Học Cơ Bản Bùi Trung Thành, Khoa Khoa Học Cơ Bản Bùi Trung Thành, Khoa Khoa Học Cơ Bản; Phạm Hùng Vân, Nguyễn Việt Quốc, Nam Khoa Biotek Co Bùi Trung Thành, Khoa Khoa Học Cơ Bản - Lý thay đổi (nếu có): III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Đơn vị đo Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt - Lý thay đổi (nếu có): b) Sản phẩm Dạng II: Số TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt đƣợc Ghi - Lý thay đổi (nếu có): c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Tổng hợp hạt nano Fe3O4 phủ silica dùng cho tách Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt đƣợc báo khoa học chiết DNA/RNA tự động ứng dụng chẩn đoán Số lượng, nơi cơng bố (Tạp chí, nhà xuất bản) Tạp chí y học TpHCM, vol 23, 85‒92 (2019) Tổng hợp hạt nano Fe3O4 báo khoa học nhiều kích thƣớc ứng dụng tách chiết DNA từ mẫu sinh học Tạp chí Phát triển khoa học công nghệ – Khoa học tự nhiên, vol 3, 55- 64 (2019) - Lý thay đổi (nếu có): d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Thạc sỹ Tiến sỹ Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt đƣợc Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp: Số TT Tên sản phẩm đăng ký Kết Theo kế hoạch Thực tế đạt đƣợc Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đƣợc ứng dụng vào thực tế Số TT Tên kết ứng dụng Thời gian Địa điểm (Ghi rõ tên, địa nơi ứng dụng) Kết sơ 2 Đánh giá hiệu đề tài mang lại: a) Hiệu khoa học công nghệ: (Nêu rõ danh mục công nghệ mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ cơng nghệ so với khu vực giới…) PCR đƣợc triển khai áp dụng chẩn đoán nhiều nơi, nhiên chất lƣợng xét nghiệm PCR nơi khác cịn nhiều phịng thí nghiệm thực PCR với phƣơng pháp thủ công, đặc biệt bƣớc tách chiết DNA Chính kết xét nghiệm PCR phụ thuộc nhiều không chất lƣợng àm xét nghiệm Sử dụng hạt nano từ tính có thể tự động hóa đƣợc bƣớc tách chiết DNA từ mẫu thử giảm thiểu đƣợc sơ sót q trình làm xét nghiệm nhờ kết xét nghiệm PCR đạt đƣợc chất lƣợng b) Hiệu kinh tế xã hội: (Nêu rõ hiệu làm lợi tính tiền dự kiến nhiệm vụ tạo so với sản phẩm loại thị trường…) Các kit tách chiết DNA sử dụng hạt nano từ tính đƣợc hãng Agentcourt, Promega, AB gene thƣơng mại hóa Tuy nhiên, kit đƣợc sử dụng hệ thống khép kín với giá thành cao mà ngƣời dùng phải sử dụng thiết bị nhƣ thành phần kit nhà sản xuất sản phẩm cung cấp Việc tổng hợp đƣợc hạt nano từ tính có tính hấp phụ tốt DNA, thành phần khác kit cho sản phẩm tách chiết DNA/RNA hoàn toàn tự động mở thiết bị KingFisher phù hợp với điều kiện nƣớc ta Tình hình thực chế độ báo cáo, kiểm tra đề tài: Số TT I II Nội dung Thời gian thực Ghi (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…) Báo cáo tiến độ Lần … Báo cáo giám định kỳ Lần … Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký) Thủ trƣởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký đóng dấu) Bùi Trung Thành MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng ‒ TỔNG QUAN Chƣơng – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Chƣơng – KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 3.1 Cấu trúc hạt nano 3.2 Hình dạng hạt nano 3.3 Tính chất từ hạt nano 11 3.4 Chức hóa bề mặt hạt nano Fe3O4 12 3.5 Tách chiết DNA dùng hạt nano Fe3O4/SiO2 13 3.5.1 Sự ảnh hƣởng kích thƣớc hạt nano Fe3O4 13 3.5.2 Sự ảnh hƣởng lƣợng hạt nano 16 3.5.3 So sánh với phƣơng pháp Boom dùng gel silica 17 3.5.4 Độ bền DNA 18 3.5.5 Độ bền, độ ổn định độ nhạy hạt nano 19 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO 22 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Diễn giải (-) Âm tính (+) Dƣơng tính A260, A280 A320 nm Độ hấp thu bƣớc sóng 260, 280 320 nm BET Brunauer–Emmett–Teller Ct Chu kỳ ngƣỡng DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EG Ethylene glycol FTIR Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier GuSCN Guanidinium thiocyanate HBV Virus viêm gan B MK Thang DNA Fe3O4 10 nm Fe3O4 có kích thƣớc 10 nm Fe3O4 32 nm Fe3O4 có kích thƣớc 32 nm Fe3O4/SiO2 Fe3O4 phủ SiO2 Ms Độ bão hòa từ NaAc Sodium acetate trihydrate PCR Polymerase chain reaction PEG Poly(ethylene glycol)-2000 Q Độ tinh DNA/RNA RFU Relative fluorescence units RNA Ribonucleic acid S5, S4, S3, S2, S1, S0, Tên mẫu HBV có nồng độ tƣơng ứng 105, 104, 103, S(-) 102, 101, 100 copies/mL đƣợc tách chiết DNA với hạt nano đƣợc tổng hợp sau T5, T4, T3, T2, T1, T0 Tên mẫu HBV có nồng độ tƣơng ứng 105, 104, 103, T(-) 102, 101, 100 copies/mL đƣợc tách chiết DNA với hạt nano đƣợc tổng hợp trƣớc 10 3.3 Tính chất từ hạt nano Hình 3.4 Đường cong từ hóa nhiệt độ phịng hạt nano Fe3O4 Fe3O4/SiO2 (phía bên trái) với kích thước hạt Fe3O4 a, e) 10; b, f) 32; c, g) 60; d, h) 100 nm Bảng 3.1 Độ từ hóa bão hịa hạt nano Fe3O4 Fe3O4/SiO2 Kích thƣớc hạt Fe3O4 (nm) 10 32 60 100 Ms (emu/g) Fe3O4 60,02 88,82 83,69 80,29 Ms (emu/g) Fe3O4/SiO2 50,90 76,04 75,61 73,28 Hình 3.4 Bảng 3.1 thể đƣờng cong từ hóa độ bão hòa từ (Ms) hạt nano nhiệt độ phịng Giá trị Ms Fe3O4 có kích thƣớc 10 nm đƣợc tổng hợp theo phƣơng pháp đồng kết tủa 60,02 emu/g (Hình 3.4a) nhỏ giá trị Ms hạt Fe3O4 đƣợc tổng hợp theo phƣơng pháp dung môi nhiệt 88,82; 83,69 80,29 emu/g ứng với kích thƣớc 32, 60 100 nm (Hình 3.4b-d) kích thƣớc tinh thể chúng nhỏ Sự khác biệt giá trị Ms hạt nano Fe3O4 đƣợc tổng hợp theo hai phƣơng pháp chủ yếu khác biệt kích thƣớc tinh thể Kích thƣớc tinh thể tăng Ms tăng [27] Tuy nhiên, kích thƣớc tinh thể vƣợt 30 nm khơng cịn siêu thuận từ, nghĩa cịn từ dƣ ngừng tác động từ trƣờng làm hạt phân tán không tốt dung dịch Do nghiên cứu này, tinh thể cấu thành hạt Fe3O4 có kích thƣớc nhỏ giới hạn siêu thuận từ 30 nm [28], nên xem hạt Fe3O4 siêu thuận từ Ngoài ra, giá trị Ms mẫu tổng hợp theo phƣơng pháp 25 dung môi nhiệt lên đến 88,82 emu/g gần với giá trị Ms Fe3O4 khối 92 emu/g Kết qủa Bảng 3.1 Hình 3.4 thể giảm giá trị Ms hạt Fe3O4/SiO2 so với hạt Fe3O4 lớp phủ SiO2 [29] 3.4 Chức hóa bề mặt hạt nano Fe3O4 Hình 3.5 thể phổ FTIR hạt nano Fe3O4/SiO2 Các đỉnh quanh 570 473 cm-1 thuộc dao động Fe-O [8] Ở 473 cm-1 cịn có diện dao động uốn cong Si-O-Si [30] góp phần làm tăng cƣờng độ đỉnh Ngồi ra, đỉnh quanh 1090 804 cm-1 lần lƣợt dao động bất đối xứng kéo căng Si-O-Si, vùng phổ quanh đỉnh 950 cm-1 liên quan đến dao động kéo căng Si-OH [30] Sự xuất đỉnh 3379, 1628 1401 cm-1 dao động kéo căng O-H, uốn cong H-O-H [31] Ngoài ra, đỉnh quanh 1401 cm-1 liên quan đến dao động biến dạng CH2 dao động uốn cong CH3 [32] Sự hình thành lớp phủ silica bề mặt hạt nano Fe3O4 đƣợc dựa phản ứng nhóm OH hạt nano Fe3O4 nhóm OC2H5 TEOS [24] Kết cho thấy hạt nano Fe3O4 với kích thƣớc 10, 32, 60 100 nm đƣợc phủ silica Trong môi trƣờng pH ~ 5, hạt nano Fe3O4/SiO2 mang nhóm Si-OH hấp phụ DNA thơng qua liên kết hydro DNA đƣợc giải hấp phụ môi trƣờng pH ~ [33] Hình 3.5 Phổ FTIR hạt nano Fe3O4/SiO2 với kích thước hạt Fe3O4 a) 10, b) 32, c) 60 d) 100 nm 26 3.5 Tách chiết DNA dùng hạt nano Fe3O4/SiO2 3.5.1 Sự ảnh hƣởng kích thƣớc hạt nano Fe3O4 Fe3O4/SiO2 (3 mg) với kích thƣớc hạt Fe3O4 10, 32, 60 100 nm lần lƣợt đƣợc dùng để tách chiết DNA 220 µL mẫu thử gồm 200 µL huyết có HBV (109 copies/mL) 20 µL mẫu chứng nội Độ tinh DNA đƣợc tính Q = (A260 nm – A320 nm) / (A280 nm – A320 nm) với A260, A280 A320 nm ứng với độ hấp thu bƣớc sóng 260, 280 320 nm Kết cho thấy giá trị Q > 1,7 (Bảng 3.2), thực PCR để khuếch đại DNA tách chiết đƣợc [34] Bảng 3.2 Độ tinh DNA tách chiết hạt nano Fe3O4/SiO2 với kích thước hạt Fe3O4 10, 32, 60 100 nm Hạt Fe3O4/SiO2 với kích thƣớc Fe3O4 (nm) Độ tinh Q 10 32 60 100 1,75 1,82 1,79 1,77 Hình 3.6 Sản phẩm PCR điện di gel agarose 2%; MK (marker), thang DNA; giếng chứa HBV (109 copies/mL) chứng nội tách chiết hạt nano Fe3O4/SiO2 với kích thước hạt Fe3O4 tương ứng a) 10, b) 32, c) 60 d) 100 nm; giếng (-) chứa mẫu âm HBV chứng nội tách chiết hạt nano Fe3O4/SiO2 với hạt Fe3O4 10 nm 27 Hình 3.7 Đồ thị RFU phản ứng realtime PCR, giếng chứa HBV (109 copies/mL) tách chiết hạt nano Fe3O4/SiO2 với kích thước hạt Fe3O4 tương ứng a) 10, b) 32, c) 60 d) 100 nm; giếng (-) chứa mẫu âm HBV tách chiết hạt nano Fe3O4/SiO2 với hạt Fe3O4 10 nm Chứng nội đƣợc cho vào mẫu HBV để kiểm tra khả tách chiết DNA hạt nano, sản phẩm tách chiết có DNA chứng nội DNA HBV PCR kỹ thuật khuếch đại đoạn DNA đích thành nhiều DNA, bắt đầu DNA đích mạch đơi DNA, sau n chu kỳ khuếch đại, số DNA thu đƣợc 2n Do đó, bắt đầu với N DNA đích mạch đơi DNA sau n chu kỳ số DNA thu đƣợc N × 2n; nghĩa với số chu kỳ khuếch đại, số DNA đích lớn, số DNA thu đƣợc tăng Hình 3.6 thể sản phẩm PCR đƣợc điện di gel agarose 2%, giếng chứa HBV chứng nội đƣợc tách chiết hạt nano Fe3O4/SiO2 với kích thƣớc hạt Fe3O4 tƣơng ứng a) 10, b) 32, c) 60 d) 100 nm; giếng (-) chứa mẫu âm HBV (0 copies/mL) chứng nội đƣợc tách chiết hạt nano Fe3O4/SiO2 kích thƣớc hạt Fe3O4 10 nm Theo nhà sản xuất kit PCR, đoạn DNA HBV DNA chứng nội đƣợc khuếch đại có kích thƣớc lần lƣợt 259 190 bps Kết cho thấy vạch 259 bps xuất giếng a-d) DNA HBV, không xuất giếng (-); tất giếng xuất vạch 190 bps, sản phẩm khuếch đại đoạn DNA đích chứng nội Kết cho thấy loại hạt nano tách chiết đƣợc DNA mẫu HBV chứng nội tại, DNA đủ tinh cho phép thực PCR Tuy nhiên, quan sát dải 259 bps giếng, khó nhận 28 biết dải giếng sáng Dải sáng ứng với hạt nano tách chiết đƣợc DNA HBV giếng nhiều Realtime PCR kỹ thuật PCR, sản phẩm khuếch đại đƣợc đọc dựa tín hiệu huỳnh quang (RFU, relative fluorescence units) phát từ DNA sao, cho phép xác định số DNA đích mẫu Số DNA đƣợc gia tăng sau chu kỳ, cƣờng độ huỳnh quang phát từ DNA gia tăng đến chu kỳ cƣờng độ huỳnh quang vƣợt qua đƣờng huỳnh quang nền, chu kỳ gọi chu kỳ ngƣỡng (Ct, threshold cycle) [35] Do vậy, số DNA đích lớn giá trị Ct nhỏ ngƣợc lại Fe3O4/SiO2 (3 mg) với kích thƣớc hạt Fe3O4 10, 32, 60 100 nm lần lƣợt đƣợc dùng để tách chiết DNA 200 µL mẫu HBV (109 copies/mL) Và sản phẩm tách chiết đƣợc khuếch đại realtime PCR (Hình 3.7) cho thấy bốn mẫu Fe3O4/SiO2 với hạt Fe3O4 10, 32, 60 100 nm tách chiết DNA sản phẩm khuếch đại tƣơng ứng với đƣờng a-d) với giá trị Ct lần lƣợt 13,39; 14,31; 15,13 15,86 Giá trị 13,39 Ct (Hình 3.7a) nhỏ giá trị Ct hạt nano Fe3O4/SiO2 (Fe3O4 10 nm) tóm bắt đƣợc DNA HBV nhiều nhất, hạt Fe3O4/SiO2 với hạt Fe3O4 32, 60 100 nm Giếng (-) (Hình 3.7(-)), khơng có HBV nên đƣờng biểu diễn khuếch đại không vƣợt qua đƣờng huỳnh quang Bằng phƣơng pháp BET xác định đƣợc diện tích (bề mặt) riêng hạt nano Fe3O4/SiO2 kết cho Bảng 3.3, kích thƣớc hạt Fe3O4 giảm, diện tích riêng Fe3O4/SiO2 tăng Vì thế, chúng làm tăng khả gắn nhóm chức tăng khả liên kết phân tử sinh học Với lƣợng, hạt nano Fe3O4/SiO2 (Fe3O4 10 nm) tóm bắt đƣợc DNA nhiều diện tích riêng chúng lớn Hạt nano Fe3O4/SiO2 đƣợc tổng hợp từ hạt Fe3O4 có kích thƣớc nhỏ có khả tóm bắt DNA tốt Bảng 3.3 Diện tích riêng hạt nano Fe3O4/SiO2 Kích thƣớc hạt Fe3O4 (nm) Diện tích riêng Fe3O4/SiO2 (m2/g) 10 32 60 100 48,012 33,452 23,185 12,171 29 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 3.5.2 Sự ảnh hƣởng lƣợng hạt nano Lần lƣợt dùng 2, mg hạt Fe3O4/SiO2 (Fe3O4 10 nm) để tách chiết DNA 200 µL mẫu HBV có nồng độ 103, 106 109 copies/mL Sản phẩm tách chiết đƣợc khuếch đại realtime PCR (Hình 3.8) Ở nồng độ HBV 103 copies/mL, sử dụng 2, mg hạt Fe3O4/SiO2 để tách chiết DNA nhận đƣợc đƣờng biểu diễn ứng với giá trị Ct xấp xỉ 33,70; 33,41 33,68 (Hình 3.8.1a-c) Tƣơng tự với nồng độ HBV 106 copies/mL, giá trị Ct nhận đƣợc xấp xỉ 23,84; 23,15 23,41 tƣơng ứng với Hình 3.8.2a-c, nghĩa tách chiết đƣợc số DNA xấp xỉ với mg hạt nano tách chiết đƣợc hầu hết DNA mẫu Tuy nhiên, nồng độ HBV 109 copies/mL, dùng mg hạt nano nhận đƣợc giá trị Ct 13,13 13,15 (Hình 3.8.3b-c) thấp giá trị Ct 14,20 (Hình 3.8.3a) ứng với dùng mg hạt nano tăng lƣợng hạt nano làm tăng diện tích bề mặt dẫn đến tăng số nhóm chức kết tách chiết đƣợc nhiều DNA Kết cho thấy với mẫu có nồng độ HBV cao (109 copies/mL), dùng mg tách chiết đƣợc nhiều DNA so với dùng mg hạt nano Hình 3.8 Đồ thị RFU phản ứng realtime PCR; HBV với nồng độ 103, 106 109 copies/mL tách chiết với lượng hạt nano Fe3O4/SiO2 a) 2, b) c) mg 30 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 3.5.3 So sánh với phƣơng pháp Boom dùng gel silica Hình 3.9 Đường biểu diễn khuếch đại HBV DNA tách chiết a) hạt nano Fe3O4/SiO2 b) gel silica Sử dụng phƣơng pháp dùng hạt nano Fe3O4/SiO2 (3 mg, Fe3O4 10 nm) phƣơng pháp Boom dùng gel silica để tách chiết DNA mẫu thử HBV có nồng độ 108 copies/mL Phƣơng pháp hạt nano Fe3O4/SiO2 gel silica nhận đƣợc giá trị độ tinh Q tƣơng ứng 1,82 1,78 lớn 1,70 đủ tinh để thực PCR Đƣờng biểu diễn khuếch đại (Hình 3.9) HBV DNA cho thấy giá trị Ct phƣơng pháp hạt nano 16,39 chu kỳ (Hình 3.9a) nhỏ giá trị Ct phƣơng pháp gel silica (20,10 chu kỳ) chứng tỏ phƣơng pháp hạt nano tách chiết đƣợc nhiều DNA Quan trọng hơn, độ chênh lệch số Ct hai phƣơng pháp 3,71 chu kỳ lớn 3,32 chu kỳ Do 23,32 ~ 10 nên số DNA mà hạt nano Fe3O4/SiO2 tách chiết đƣợc cao 10 lần so với dùng gel silica 3.5.4 Độ bền DNA Sử dụng hạt nano Fe3O4/SiO2 (3 mg, Fe3O4 10 nm) để tách chiết DNA hai mẫu HBV nồng độ hai thời điểm cách 12 tháng, DNA tách chiết trƣớc đƣợc lƣu -80 oC, hai đƣợc khuếch đại realtime PCR Kết Hình 3.10 cho thấy hai mẫu DNA có giá trị Ct khoảng 18,50 chu kỳ Điều chứng tỏ mẫu DNA tách chiết trƣớc thực PCR, nghĩa 31 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh DNA đƣợc tách chiết hạt nano Fe3O4/SiO2 đạt đƣợc độ bền 12 tháng Hình 3.10 Đường biểu diễn khuếch đại HBV DNA tách chiết hạt nano Fe3O4/SiO2 thời điểm a) sau b) trước 12 tháng 3.5.5 Độ bền, độ ổn định độ nhạy hạt nano Hình 3.11 DNA tách chiết hạt nano Fe3O4/SiO2 tổng hợp cách tháng, khuếch đại PCR đọc điện di agarose 2%; MK thang DNA; giếng T5 – T0 S5 – S0 tương ứng với nồng độ HBV 105 – 100 copies/mL, giếng T(-) S(-) có nồng độ HBV copies/mL, giếng thêm vào chứng IC; đoạn DNA HBV chứng IC khuếch đại có kích thước 259 190 bps Các mẫu HBV có nồng độ 105, 104, 103, 102, 101, 100 copies/mL, tất đƣợc thêm vào chứng IC để kiểm tra khả tách chiết DNA hạt nano Fe3O4/SiO2 (3 mg, Fe3O4 10 nm), đƣợc đặt tên tƣơng ứng S5, S4, S3, S2, S1, S0 S(-), DNA chúng đƣợc tách chiết hạt nano Fe3O4/SiO2 vừa đƣợc tổng hợp Các mẫu HBV có nồng độ tƣơng tự, đƣợc thêm vào chứng IC, đƣợc đặt tên tƣơng ứng T5, T4, T3, T2, T1, T0 T(-), DNA chúng đƣợc tách 32 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh chiết hạt nano Fe3O4/SiO2 đƣợc tổng hợp trƣớc tháng DNA tách chiết đƣợc gồm HBV chứng IC đƣợc thực PCR đọc sản phẩm điện di agarose 2% (Hình 3.11) Với kit NK PCR-VB, đoạn đƣợc khuếch đại HBV DNA có kích thƣớc 259 bps đoạn DNA chứng IC 190 bps Kết cho thấy, sản phẩm PCR HBV DNA xuất dải 259 bps giếng T5 – T1, S5 – S1 độ sáng dải giảm dần theo giảm nồng độ HBV Hơn nữa, giảm độ sáng dải 259 bps giếng từ T5 – T1 đƣợc tách chiết với hạt nano Fe3O4/SiO2 tổng hợp trƣớc, giếng từ S5 – S1 đƣợc tách chiết hạt nano Fe3O4/SiO2 tổng hợp sau sáu tháng tƣơng tự Do đó, xem hạt nano Fe3O4/SiO2 đạt đƣợc độ ổn định độ bền Ngoài ra, nồng độ (1 – 9) × 101 copies/mL gọi chung 101 copies/mL (giếng T1, S1) hạt nano Fe3O4/SiO2 tách chiết đƣợc DNA, nghĩa hạt nano Fe3O4/SiO2 đạt đƣợc độ nhạy tách chiết 101 copies/mL Với nồng độ HBV 100 copies/mL tƣơng ứng với giếng T0, S0 T(-), S(-), hạt nano Fe3O4/SiO2 không tách chiết đƣợc HBV DNA 200 μL mẫu thử, không xuất dải 259 bps sản phẩm PCR giếng Trong khi, giếng xuất dải 190 bps sản phẩm PCR chứng IC Sử dụng realtime PCR để khuếch đại DNA tách chiết đƣợc hạt nano Fe3O4/SiO2 (3 mg, Fe3O4 10 nm) nồng độ HBV 105, 104, 103, 102, 101 100 copies/mL, kết Hình 3.12 cho thấy giá trị Ct tăng dần tƣơng ứng 25,08; 28,82; 32,58; 35,27; 39,14 riêng mẫu 100 copies/mL đƣờng biểu diễn khuếch đại không vƣợt qua baseline Ở nồng độ 100 copies/mL, hạt nano Fe3O4/SiO2 không tách chiết đƣợc DNA Ngoài ra, độ chênh lệch số Ct hai nồng độ HBV liên tiếp xấp xỉ 3,32 chu kỳ tƣơng ứng với độ pha loãng 10 Kết Hình 3.11 3.12 hạt nano Fe3O4/SiO2 đạt đƣợc độ nhạy tách chiết 101 copies/mL, độ ổn định độ bền tháng lƣu nhiệt độ phòng 33 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Hình 3.12 Đường biểu diễn khuếch đại HBV DNA với nồng độ 105 – 100 copies/mL, DNA tách chiết hạt nano Fe3O4/SiO2 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Đã tổng hợp đƣợc hạt nano Fe3O4 có kích thƣớc 10, 32, 60 100 nm với độ bão hòa từ tƣơng ứng 60,02; 88,82; 83,69 80,29 emu/g đƣợc xem nhƣ siêu thuận từ Độ bão hòa từ hạt Fe3O4 (88,82; 83,69 80,29 emu/g) gần độ bão hòa từ Fe3O4 khối (92 emu/g) Các hạt Fe3O4/SiO2 tách chiết đƣợc DNA HBV thiết bị tách chiết tự động DNA đủ tinh Fe3O4/SiO2 với hạt Fe3O4 10 nm cho khả tách chiết HBV DNA tốt Ở nồng độ HBV cao (109 copies/mL), dùng mg hạt Fe3O4/SiO2 (Fe3O4 10 nm) cho kết tách chiết HBV DNA tốt so với mg hạt nano loại, nồng độ HBV thấp (103 106 copies/mL) khơng có khác biệt đáng kể Số lƣợng HBV DNA tách chiết đƣợc cao 10 lần so với phƣơng pháp Boom dùng gel silica, DNA đạt đƣợc độ bền 12 tháng Hơn nữa, hạt nano Fe3O4/SiO2 đạt đƣợc độ nhạy tách chiết HBV DNA 101 copies/mL, độ ổn định độ bền tháng lƣu nhiệt độ phòng Kết sở để ứng dụng hạt nano Fe3O4 cho việc tách chiết DNA/RNA (ribonucleic acid) từ mẫu sinh học khác 34 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] P Tartaj, M.ı.d.P Morales, S Veintemillas-Verdaguer, T.G.a.-C ˜no, C.J Serna, The preparation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine, J Phys D: Appl Phys., 36, R182–R197 (2003) [2] K Turcheniuk, A.V Tarasevych, V.P Kukhar, R Boukherroub, S Szunerits, Recent advances in surface chemistry strategies for the fabrication of functional iron oxide based magnetic nanoparticles, Nanoscale, 5, 1-52 (2013) [3] M Faraji, Y Yamini, M Rezaee, Magnetic Nanoparticles: Synthesis, Stabilization, Functionalization, Characterization, and Applications, J Iran Chem Soc., 7, 1-37 (2010) [4] A Tari, R.W Chantrell, S.W Charles, J Popplewell, The Magnetic Properties and Stability of A Ferrofluid Containing Fe3O4 Particles, Physica 97B, 57-64, (1979) [5] P Poizot, S Laruelle, S Grugeon, L Dupont, J.-M Tarascon, Nanosizedtransition-metaloxidesas negative-electrode materials for lithium-ion batteries, Nature, 407, 496-499 (2000) [6] M Mahmoudi, A Simchi, M Imani, P Stroeve, A Sohrabi, Templated growth of superparamagnetic iron oxide nanoparticles by temperature programming in the presence of poly(vinyl alcohol), Thin Solid Films, 518, 4281-4289 (2010) [7] E Umut, Surface Modification of Nanoparticles Used in Biomedical Applications, Intech, DOI: 10.5772/55746 (2013) [8] K Can, M Ozmen, M Ersoz, Immobilization of albumin on aminosilane modified superparamagnetic magnetite nanoparticles and its characterization, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 71, 154-159 (2009) [9] X Liu, L Zhang, J Zeng, Y Gao, Z Tang, Superparamagnetic nano 35 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh immunobeads toward food safety insurance, Journal of Nanoparticle Research, 15, (2013) [10] M.R Ghazanfari, M Kashefi, S.F Shams, M.R Jaafari, Perspective of Fe3O4 nanoparticles role in biomedical applications, Biochem Res Int, 2016, 1–32 (2016) [11] P.H Vân, PCR real-time PCR vấn đề áp dụng thƣờng gặp, NXB Y Học, (2009) [12] K Wilson, J Walker, Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology, Cambridge University Press, New York, (2010) [13] K Obata, O Segawa, M Yakabe, Y Ishida, T Kuroita, K Ikeda, B Kawakami, Y Kawamura, M Yohda, T Matsunagac, H Tajima, Development of a novel method for operating magnetic particles, magtration technology, and its use for automating nucleic acid purification, Journal of Bioscience and Bioengineering, 91, 500–503 (2001) [14] J Akutsu, Y Tojo, O Segawa, K Obata, M Okochi, H Tajima, M Yohda, Development of an integrated automation system with a magnetic bead-mediated nucleic acid purification device for genetic analysis and gene manipulation, Biotechnol Bioeng, 86, 667-671 (2004) [15] R Boom, C.J Sol, M.M Salimans, C.L Jansen, P.M.W.V Dillen, J.V.D Noordaa, Rapid and simple method for purification of nucleic acids, Journal of Clinical Microbiology 28, 495-503 (1990) [16] Y Hou, X Han, J Chen, Z Li, X Chen, L Gai, Isolation of PCR-ready genomic DNA from Aspergillus niger cells with Fe3O4/SiO2 microspheres, Separation and Purification Technology, 116, 101-106 (2013) [17] G Ligang, L Zhili, H Yunhua, J Haihui, H Xiaoyun, M Wanyong, Preparation of core–shell Fe3O4/SiO2 microspheres as adsorbents for purification of DNA, Journal of Physics D: Applied Physics, 43, 445001 36 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh (2010) [18] M Schuller, T.P Sloots, G.S James, C.L Halliday, I.W.J Carter, PCR for clinical microbiology, Springer, Netherlands, 14-15 (2014) [19] R Massart, Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media, IEEE Trans on Magn., MAG-17, 1247-1248 (1981) [20] R El-kharrag, A Amin, Y.E Greish, Low temperature synthesis of monolithic mesoporous magnetite nanoparticles, Ceramics International, 38, 627-634 (2012) [21] H Deng, X Li, Q Peng, X Wang, J Chen, Y Li, Monodisperse magnetic single-crystal ferrite microspheres, Angew Chem, 117, 2842– 2845 (2005) [22] H Sun, X Zeng, M Liu, S Elingarami, G Li, B Shen, N He, Synthesis of size-controlled Fe3O4@SiO2 magnetic nanoparticles for nucleic acid analysis, Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 12, 267-273 (2012) [23] W Stöber, A Fink, E Bohn, Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range, J Colloid Interface Sci, 26, 62-69 (1968) [24] J Zhao, M Milanova, M.M.C.G Warmoeskerken, V Dutschk, Surface modification of TiO2 nanoparticles with silane coupling agents, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 413, 273-279 (2012) [25] K Nishio, M Ikeda, N Gokon, S Tsubouchi, H Narimatsu, Y Mochizuki, S Sakamoto, A Sandhu, M Abe, H Handa, Preparation of size-controlled (30–100 nm) magnetite nanoparticles for biomedical applications, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 310, 2408– 2410 (2007) [26] J Zheng, Z.Q Liu, X.S Zhao, M Liu, X Liu, W Chu, One-step 37 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh solvothermal synthesis of Fe3O4@C core-shell nanoparticles with tunable sizes, Nanotechnology, 23, 165601 (2012) [27] Â.L Andrade, M.A Valente, J.M.F Ferreira, J.D Fabris, Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 324, 1753-1757 (2012) [28] J Ge, Y Hu, M Biasini, W.P Beyermann, Y Yin, Superparamagnetic magnetite colloidal nanocrystal clusters, Angew Chem Int Ed Engl, 46, 4342-4345 (2007) [29] P.I Girginova, A.L Daniel-da-Silva, C.B Lopes, P Figueira, M Otero, V.S Amaral, E Pereira, T Trindade, Silica coated magnetite particles for magnetic removal of Hg2+ from water, J Colloid Interface Sci, 345, 234240 (2010) [30] M Klotz, A Ayral, C Guizard, C Ménager, V Cabuil, Silica coating on colloidal maghemite particles, J Colloid Interface Sci, 220, 357-361 (1999) [31] R.C Paul, R.C Narula, S.K Vasisht, Some compounds of iron(III) with bidentate bases, Transition Metal Chemistry, 2, 152-154 (1977) [32] K Li, Z Zeng, J Xiong, L Yan, H Guo, S Liu, Y Dai, T Chen, Fabrication of mesoporous Fe3O4@SiO2@CTAB–SiO2 magnetic microspheres with a core/shell structure and their efficient adsorption performance for the removal of trace PFOS from water, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 465, 113-123 (2015) [33] K.A Melzak, C.S Sherwood, R.F.B Turner, C.A Haynes, Driving forces for DNA adsorption to silica in perchlorate solutions, Journal of Colloid and Interface Science, 181, 635–644 (1996) [34] K.M Elkins, Determination of DNA quality and quantity using UV-vis spectroscopy, Forensic DNA Biology, 2013, 59-62 (2013) 38 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh [35] K Mullis, F Faloona, S Scharf, R Saiki, G Horn, H Erlich, Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction, Cold Spring Harb Symp Quant Biol., 51, 263-273 (1986) 39 ... bps giếng từ T5 – T1 đƣợc tách chiết với hạt nano Fe3 O4/SiO2 tổng hợp trƣớc, giếng từ S5 – S1 đƣợc tách chiết hạt nano Fe3 O4/SiO2 tổng hợp sau sáu tháng tƣơng tự Do đó, xem hạt nano Fe3 O4/SiO2... THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC I THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp hạt nano từ tính Fe3 O4 dùng tách chiết DNA Thuộc lĩnh vực (tên lĩnh vực): Vật liệu nano từ tính ứng dụng y... đƣợc chế tạo từ hạt Fe3 O4 10, 32, 60 100 nm lần lƣợt đƣợc dùng để tách chiết DNA Ngoài ra, liều lƣợng 2, mg hạt nano Fe3 O4/SiO2 đƣợc chế tạo từ hạt Fe3 O4 10 nm đƣợc dùng cho lần tách chiết đƣợc