Nghiên cứu tổng hợp hạt nano enzyme glucose oxidase fe3o4 từ tính

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA HÓA HỌC −−−−−− Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO ENZYME GLUCOSE OXIDASE – Fe3O4 TỪ TÍNH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN SƢ PHẠM Đà Nẵng, tháng năm 2015 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA HÓA HỌC −−−−−− Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO ENZYME GLUCOSE OXIDASE – Fe3O4 TỪ TÍNH (Khóa luận tốt nghiệp cử nhân sư phạm) Sinh viên thực : NGÔ LỮ THANH Lớp : 11SHH Giảng viên hƣớng dẫn : TS NGUYỄN BÁ TRUNG Đà Nẵng, tháng năm 2015 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐHSP KHOA HĨA −−−−−− CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc −−−−−− NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên Lớp Tên đề tài : NGÔ LỮ THANH : 11SHH : Nghiên cứu tổng hợp hạt nano enzyme glucose – Fe3O4 từ tính Nguyên liệu, dụng cụ thiết bị  Nguyên liệu : FeCl2.4H2O, FeCl3.6H2O, dung dịch NH3, dung dịch đệm photphat, enzyme glucose oxidase, dung dịch glutaraldehyde, dung dịch glucose 5%  Dụng cụ : Bình tam giác 250ml, cốc thủy tinh 100ml, ống sinh hàn thẳng, giá sắt, đũa thủy tinh  Thiết bị : Máy khuấy từ gia nhiệt Nội dung nghiên cứu  Tổng hợp hạt nano oxit sắt từ  Cố định enzyme glucose oxidase lên hạt nano oxit sắt từ  Khảo sát đặc trƣng sản phẩm phƣơng pháp vật lý  Thử hoạt tính enzyme cố định Giáo viên hƣớng dẫn : TS Nguyễn Bá Trung Ngày giao đề tài : 27/4/2014 Ngày hoàn thành : 21/4/2015 Giáo viên hƣớng dẫn (Ký ghi rõ họ, tên) Chủ nhiệm Khoa (Ký ghi rõ họ, tên) Sinh viên hoàn thành nộp báo cáo cho Khoa ngày… tháng …năm Kết điểm đánh giá: Ngày… tháng …năm CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Trong suốt bốn năm học tập rèn luyện dƣới giảng đƣờng Trƣờng Đại học Sƣ phạm – ĐHĐN, với lòng yêu nghề, tận tâm, hết lòng truyền đạt thầy cơ, tơi tích lũy đƣợc nhiều kiến thức nhƣ kỹ cần thiết sống Lời đầu tiên, xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến TS Nguyễn Bá Trung tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện để tơi hồn thành tốt khóa luận Tiếp theo, tơi xin cảm ơn thầy, khoa Hóa học tạo điều kiện thuận lợi, động viên, giúp đỡ thời gian làm khóa luận Cuối cùng, tơi xin cảm ơn tất bạn bè, ngƣời quan tâm, giúp đỡ tơi q trình học tập nhƣ giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Nguồn kiến thức vô tận thời gian thực khóa luận cịn hạn chế nên q trình thực khơng tránh khỏi thiếu xót, tơi xin chân thành cảm ơn góp ý vơ q giá chân thành Quý Thầy Cô Đà Nẵng, ngày 21 tháng năm 2015 Sinh viên thực Ngô Lữ Thanh MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU .4 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4-NPs) 1.1.1 Các phƣơng pháp điều chế hạt nano Fe3O4 .5 1.1.2 Các ứng dụng hạt nano Fe3O4 .8 1.2 Tổng quan enzyme glucose oxidase 14 1.2.1 Giới thiệu enzyme glucose oxidase 14 1.2.2 Ứng dụng GOx 17 1.3 Tổng quan enzyme cố định 18 1.3.1 Định nghĩa[7] 18 1.3.2 Đặc điểm enzyme cố định[7] 19 1.3.3 Ƣu – nhƣợc điểm enzyme cố định[7] 20 1.3.4 Phƣơng pháp cố định enzyme 20 1.3.5 Ứng dụng enzyme cố định 27 Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 32 2.1 Hóa chất nghiên cứu .32 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 32 2.2.1 Điều chế hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4 – NPs) 32 2.2.2 Phân tích đặc trƣng vật lý hạt nano oxit sắt từ 33 2.2.3 Cố định enzyme glucose oxidase (GOx) lên hạt nano oxit sắt từ 33 2.2.4 Phân tích đặc trƣng hạt nano GOx – Fe3O4 34 2.2.5 Đánh giá hoạt tính enzyme cố định 34 2.2.6 Sơ đồ quy trình thực .35 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Tổng hợp hạt nano oxit sắt từ 36 3.2 Cố định enzyme GOx lên hạt nano oxit sắt từ 36 3.2 Kết phân tích đặc trƣng vật lý hạt nano oxit sắt từ hạt nano GOx – Fe3O4 37 3.2.1 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 37 3.2.2 Kết phổ nhiễu xạ tia X (XRD) 38 3.2.3 Kết đo đƣờng cong từ hóa 39 3.2.4 Phổ hồng ngoại FT – IR 40 3.5 Đánh giá hoạt tính enzyme cố định 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Nguyên tắc phân tách tế bào từ trường .9 Hình 1.2: Ngun lí dẫn truyền thuốc dùng hạt nano từ tính 11 Hình 1.3: Cấu trúc khơng giang GOx 15 Hình 1.4: Cấu trúc phân nửa FAD trung tâm hoạt động GOx thu nhận từ Penicillium amagaskinense 15 Hình 1.5: Sơ đồ hấp phụ enzyme lên chất mang khơng có có điện tích .21 Hình 1.6: Cố định enzyme cách nhốt enzyme chất mang .21 Hình 1.7: Tạo liên kết enzyme chất mang 21 Hình 1.8: Cố định cách tạo liên kết ngang với enzyme .21 Hình 1.9: Nhốt enzyme gel 23 Hình 1.10: Nhốt enzyme sợi có lỗ nhỏ 23 Hình 1.11: Nhốt enzyme sợi mảnh 23 Hình 1.12: Quy trình nhốt enzyme microcapsule 24 Hình 3.1: (a) Dung dịch hỗn hợp muối Fe3+ Fe2+ (b) Dung dịch sau cho tác dụng với ddNH3 36 Hình 3.2: Kết chụp TEM hạt nano oxit sắt từ .37 Hình 3.3: Kết đo đường cong từ hóa 39 Hình 3.4: Kết phổ hồng ngoại FT – IR: (a) Fe3O4 (b) GOx–Fe3O4 40 LỜI MỞ ĐẦU Trong vài thập kỷ trở lại đây, với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme đƣợc sản xuất ngày nhiều đƣợc sử dụng hầu hết lĩnh vực kinh tế Enzyme dần bƣớc làm thay đổi nâng cao hiệu số q trình cơng nghệ chế biến thực phẩm, nơng nghiệp, chăn nuôi, y tế…đáp ứng nhu cầu ngày tăng xã hội Enzyme glucose oxidase (GOx), nằm nhóm enzyme xúc tác cho q trình oxy hóa - khử, đƣợc chiết xuất từ nấm mốc Aspergillus niger, xúc tác cho q trình oxy hóa glucose thành axit gluconic với tham gia oxy nhƣ chất oxy hóa, đồng thời giải phóng H2O2 GOx đƣợc biết đến từ năm 1950, đƣợc sử dụng rộng rãi việc xác định hàm lƣợng glucose tự dịch thể, nguyên liệu thực vật công nghiệp thực phẩm Ngày nay, GOx đƣợc sử dụng nhiều lĩnh vực khác nhau: y dƣợc, hóa học lâm sàn, công nghiệp dệt, công nghệ sinh học,… Sử dụng enzyme tự có số hạn chế nhƣ: giá thành cao, độ ổn định thấp,… nên cố định enzyme lên vật liệu hỗ trợ cách hợp lý Các hạt nano kim loại Co, Ni, Fe có từ tính cao oxit kim loại nhƣng chúng có độ hoạt động tính độc hại cao, không phù hợp cho ứng dụng y sinh Các hạt nano sắt từ có tính oxi hóa ổn định, khả tƣơng thích hệ khơng nƣớc, khơng độc hại Cố định enzyme GOx lên hạt nano sắt từ có nhiều thuận lợi đáng ý: dễ dàng tách enzyme khỏi dung dịch phản ứng từ trƣờng, tái sử dụng enzyme thời gian lâu hơn, … Nghiên cứu enzyme nano từ tính hƣớng mới, nƣớc ta chƣa có nhiều cơng trình nghiên cứu quy trình cố định enzyme GOx lên hạt nano oxit sắt từ Chính vậy, tơi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp hạt nano enzyme Glucose oxidase – Fe3O4 từ tính” Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4-NPs) Cuối thập niên 80, công nghệ nano bắt đầu phát triển thu đƣợc thành tựu to lớn không nghiên cứu mà ứng dụng nhiều lĩnh vực Việc ứng dụng hạt nano oxit sắt siêu thuận từ vào chẩn đốn trị bệnh có nhiều thành triển vọng cao Hai loại oxit sắt dùng nhiều y sinh học maghemite (Fe2O3 –γ) magnetite (Fe3O4) Trong đó, magnetite vật liệu đƣợc sử dụng phổ biến hơn.[12] Fe3O4 oxit hỗn hợp FeO.Fe2O3 có cấu trúc spinel nghịch, thuộc nhóm ceramic từ, đƣợc gọi ferit (công thức chung MO.Fe2O3, M Fe, Co, Mn, Ni,…).[5] Khi kích thƣớc nano, chúng đƣợc xem hạt đơmen có tính siêu thuận từ Các hạt siêu thuận từ mở tiềm lớn cho ứng dụng y sinh: làm tác nhân tăng độ tƣơng phản máy cộng hƣởng từ hạt nhân, phân tách chọn lọc tế bào, hiệu ứng đốt nhiệt phân phát thuốc,…[12] 1.1.1 Các phương pháp điều chế hạt nano Fe3O4 Hạt nano điều chế theo nguyên tắc:  Vật liệu khối đƣợc nghiền nhỏ đến kích thƣớc nano (top – down) gồm phƣơng pháp nghiền, biến dạng nhƣ nghiền hành tinh, nghiền rung  Hình thành hạt nano từ nguyên tử (bottom – up) gồm phƣơng pháp vật lý (phún xạ, bốc bay,…) phƣơng pháp hóa học (đồng kết tủa từ dung dịch kết tủa từ khí hơi,…).[5] 1.1.1.1 Phương pháp nghiền Phƣơng pháp nghiền đƣợc phát triển từ sớm để chế tạo hạt nano từ tính dùng cho ứng dụng vật lý nhƣ truyền động từ mơi trƣờng khơng khí vào buồng chân khơng, làm chất dẫn nhiệt toa áp suất cao,… Trong nghiên cứu vật liệu từ, vật liệu từ tính oxit sắt Fe3O4, đƣợc nghiền với chất hoạt hóa bề mặt (axit Oleic) dung mơi (dầu, hexane) Chất hoạt hóa bề mặt giúp cho trình nghiền đƣợc dễ dàng đồng thời tránh hạt kết tụ với Sau nghiền, sản phẩm phải trải qua trình phân tách hạt phức tạp để có đƣợc hạt tƣơng đối đồng Ƣu điểm phƣơng pháp đơn giản tạo đƣợc vật liệu với khối lƣợng lớn Việc thay đổi chất hoạt động bề mặt dung mơi khơng làm ảnh hƣởng nhiều đến q trình điều chế Tuy nhiên, phƣơng pháp tạo hạt nano có tính đồng khơng cao khó khống chế trình hình thành hạt nano.[11] 1.1.1.2 Phương pháp đồng kết tủa Đây phƣơng pháp thƣờng dùng để tạo hạt oxit sắt Có cách để tạo oxit hydroxit sắt bị oxy hóa phần chất oxy hóa già hóa hỗn hợp dung dịch có tỷ phần hợp phức Fe2+ Fe3+ dung môi nƣớc Phƣơng pháp thứ thu đƣợc hạt nano có kích thƣớc từ 30nm – 100nm Phƣơng pháp thứ tạo hạt nano có kích thƣớc từ 4nm – 15nm Bằng cách thay đổi độ pH nồng độ ion dung dịch mà ngƣời ta thu đƣợc hạt nano với kích thƣớc mong muốn đồng thời làm thay đổi điện tích bề mặt hạt hình thành Cơ chế tổng hợp hạt nano Fe3O4 nhƣ sau: với tỷ lệ hợp phần Fe3+/Fe2+ = 2, mơi trƣờng có pH = – 14 điều kiện thiếu oxy Fe3+ + H2O  Fe(OH)x3-x (thơng qua q trình proton) Fe2+ + H2O  Fe(OH)y2-y (thơng qua q trình proton) Fe(OH)x3-x + Fe(OH)y2-y Fe3O4 (thơng qua q trình dehydrat hóa, pH > 9, nhiệt độ khoảng 60oC) Tổng hợp phƣơng trình ta có phƣơng trình sau: Fe3+ + Fe2+ + OH- Fe3O4 + H2O Mặc dù phƣơng pháp đồng kết tủa phƣơng pháp đơn giản nhƣng hạt nano hình thành chúng kết tụ mạnh Các hạt kết tụ làm hạn chế khả ứng 1.3.5.3 Trong nghiên cứu khoa học[7] Trƣớc tiên enzymecố định cơng cụ nghiên cứu hóa sinh quan trọng Năm 1967, điện cực enzyme đƣợc chế tạo để xác định nồng độ glucose nhờ glucose oxidase cố định Điện cực enzyme điện cực oxy bề mặt có gel poly acrylamide Nhúng điện cực vào dung dịch có glucose chất oxy khuếch tán vào gel chứa enzyme Nhƣ vậy, biến đổi dòng điện hệ thống điện cực phụ thuộc vào tấc độ phản ứng nồng độ glucose  Kaetsu dùng điện cực urease để đo nồng độ urea máu, dùng cholesterol oxidase đo nồng độ cholesterol  Clark dùng điện cực alcohol oxydoreductase để xác định nồng độ cồn  Ngồi enzyme cịn dùng vào nhiều mục đích khác nhƣ: hoạt hóa zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, sử dụng phƣơng pháp sắc ký lực để tinh chế số chất có khả liên kết đặc biệt với enzyme Ngày có nhiều qui trình sử dụng chế phẩm tế bào cố định để xử lý nƣớc thải đạt hiệu  Các nghiên cứu màng enzyme cố định ngày tăng, kết đạt đƣợc phụ thuộc nhiều vào tính chất màng dùng để gắn enzyme  Trên sở nghiên cứu tính chất enzyme cố định góp phần giải nhiều vấn đề lớn khác nhƣ:  Giải thích tồn diện chức xúc tác sinh học tế bào sống điều hòa hoạt động enzyme tế bào  Điều hịa tính thấm màng khuếch tán qua màng  Đặc tính phản ứng enzyme giới hạn phân cách phase màng, môi trƣờng kỵ nƣớc, môi trƣờng nƣớc màng tế bào  Ngày nay, việc nghiên cứu enzyme cố định đƣợc tiến hành theo hƣớng ngày phức tạp dần, mơ hình từ enzyme riêng lẻ đến hệ thông nhiều enzyme, 30 tiến đến tạo cấu trúc phân tử có trật tự bao gồm nhiều phức hệ enzyme Nghiên cứu trình xúc tác nhờ hệ thống phức tạp giúp hiểu biết đầy đủ chế trình trao đổi chất tế bào 31 Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Hóa chất nghiên cứu Nƣớc cất sử dụng nghiên cứu nƣớc cất lần Các hóa chất đƣợc sử dụng thuộc loại tinh khiết phân tích, khơng cần tinh chế lại, bao gồm: muối FeCl2.4H2O, muối FeCl3.6H2O, dung dịch NH3, muối NaH2PO4.2H2O, muối Na2HPO4.12H2O, enzyme glucose oxidase, glutaraldehyde 25% Dung dịch đệm photphat (pH 6.0 ph 7.0) đƣợc chuẩn bị cách hòa tan muối Na2HPO4 NaH2PO4 vào nƣớc cất theo tỷ lệ nồng độ định Dung dịch glutaraldehyde 4% (trong đệm photphat pH 7.0) đƣợc chuẩn bị cách hòa tan muối Na2HPO4 NaH2PO4 vào nƣớc cất (theo tỷ lệ nồng độ định), thêm 16ml dung dịch glutaraldehyde Sau định mức đến 100ml Dung dịch enzyme glucose oxidase 0,5mg/ml (trong đệm photphat pH 6.0) đƣợc chuẩn bị cách hòa tan enzyme glucose oxidase rắn vào 20ml dung dịch đệm photphat (pH 6.0) đƣợc sử dụng sau pha chế 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Điều chế hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4 – NPs) Có nhiều phƣơng pháp khác để tổng hợp hạt nano oxit sắt từ nhƣng với mục tiêu thu đƣợc hạt nhỏ, đồng thuận tiện, sử dụng phƣơng pháp đồng kết tủa hai dung dịch muối FeCl2 FeCl3 Quy trình tổng hợp đƣợc thực nhƣ sau: Hòa tan FeCl2.4H2O FeCl3.6H2O (theo tỷ lệ mol : 2) vào 50ml nƣớc cất khuấy khoảng 30 phút với khí Ar để tạo mơi trƣờng trơ Sau đó, cho từ từ giọt dung dịch NH3 vào dung dịch phản ứng đƣợc khuấy máy khuấy từ dung dịch chuyển sang màu đen Tiếp tục khuấy dung dịch 85oC vòng 60 phút Hạt nano oxit sắt từ thu đƣợc sau tách từ trƣờng rửa lại nhiều lần nƣớc cất đến mơi trƣờng trung tính 32 2.2.2 Phân tích đặc trưng vật lý hạt nano oxit sắt từ  Phân tích đặc trưng kích thước hình dạng hạt nano oxit sắt từ Kích thƣớc hình dạng hạt nano oxit sắt từ đƣợc xác định ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Mẫu đƣợc nhỏ tâm lƣới đồng làm khơ qua đêm trƣớc đo  Phân tích cấu trúc tinh thể hạt nano oxit sắt từ Cấu trúc tinh thể hạt nano oxit sắt từ đƣợc xác định nhiễu xạ tia X Dung dịch nano oxit sắt từ đƣợc ly tâm với tốc độ cao, thu lấy phần không tan, sấy khô, sau để tiến hành đo nhiễu xạ tia X  Phân tích từ tính hạt nano oxit sắt từ Từ tính hạt nano oxit sắt từ đƣợc xác định cách đo đƣờng cong từ trễ Dung dịch nano oxit sắt từ đƣợc ly tâm với tốc độ cao, thu lấy phần không tan, sấy khô, sau để tiến hành đo đƣờng cong từ trễ  Phân tích liên kết có hạt nano oxit sắt từ Các liên kết đƣợc xác định phƣơng pháp phân tích theo phổ hồng ngoại Dung dịch nano oxit sắt từ đƣợc ly tâm với tốc độ cao, thu lấy phần khơng tan, sấy khơ, sau tiến hành chụp phổ hồng ngoại FT – IR 2.2.3 Cố định enzyme glucose oxidase (GOx) lên hạt nano oxit sắt từ Để tiến hành cố định enzyme lên hạt nano oxit sắt từ ta sử dụng phƣơng pháp tạo liên kết ngang glutaraldehyde Quy trình cố định enzyme GOx đƣợc tiến hành nhƣ sau: Cho dung dịch glutaraldehyde 4% vào nano oxit sắt từ Sau đó, hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy liên tục khoảng nhiệt độ phịng Dùng từ trƣờng ngồi tách hạt nano khỏi dung dịch phản ứng rửa lại nhiều lần nƣớc cất Tiếp tục thêm dung dịch enzyme GOx (0.5mg/ml, pH 6.0) khuấy liên tục điều kiện thƣờng Các hạt nano oxit sắt từ với GOx đƣợc tách từ tính rửa lại vài lần dung dịch đệm (pH 6.0) 33 2.2.4 Phân tích đặc trưng hạt nano GOx – Fe3O4  Phân tích cấu trúc tinh thể hạt nano GOx – Fe3O4 Cấu trúc tinh thể hạt nano GOx – Fe3O4 đƣợc xác định nhiễu xạ tia X Dung dịch nano GOx – Fe3O4 đƣợc ly tâm với tốc độ cao, thu lấy phần khơng tan, sấy khơ, sau để tiến hành đo nhiễu xạ tia X  Phân tích từ tính hạt nano GOx – Fe3O4 Từ tính hạt nano GOx – Fe3O4 đƣợc xác định cách đo đƣờng cong từ trễ Dung dịch nano GOx – Fe3O4 đƣợc ly tâm với tốc độ cao, thu lấy phần khơng tan, sấy khơ, sau để tiến hành đo đƣờng cong từ hóa  Phân tích liên kết có hạt nano GOx – Fe3O4 Các liên kết đƣợc xác định phƣơng pháp phân tích theo phổ hồng ngoại Dung dịch nano GOx – Fe3O4 đƣợc ly tâm với tốc độ cao, thu lấy phần khơng tan, sấy khơ, sau để tiến hành chụp phổ hồng ngoại FT – IR 2.2.5 Đánh giá hoạt tính enzyme cố định Để đánh giá khả xúc tác phản ứng oxi hóa glucose hạt nano GOx – Fe3O4 so với enzyme GOx tự ta tiến hành nhƣ sau: Cho khoảng 0,5g GOx – Fe3O4 vào 100ml dung dịch glucose 1,25% Khuấy liên tục máy khuấy từ khảng điều kiện thƣờng Sau đó, tách hạt GOx – Fe3O4 từ tính lấy phần dung dịch đo hàm lƣợng glucose lại Sau tiến hành phản ứng oxi hóa glucose với xúc tác enzyme GOx tự hạt nano GOx – Fe3O4, hàm lƣợng glucose lại đƣuọc xác định cách xét nghiệm sinh hóa bệnh viên Hồn Mỹ - Tp Đà Nẵng 34 2.2.6 Sơ đồ quy trình thực FeCl3.6H2O FeCl2.4H2O 50ml H2O Dd hỗn hợp 3+ 2+ Fe Fe 30ml ddNH3 dd màu đen Chụp TEM Fe3O4 – NPs 30ml dd GA 4% Đo XRD Chụp FT–IR GA – Fe3O4 NPs Đo đƣờng cong từ trễ 20ml enzyme 0,5mg/ml Emzym cố định GOx – Fe3O4 NPs Glucose 1,25% Sản phẩm Xác định hàm lƣợng glucose 35 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tổng hợp hạt nano oxit sắt từ Với mục tiêu điều chế hạt nano oxit sắt từ có kích thƣớc khoảng 10 – 20nm, tiến hành điều chế hạt nano oxit sắt từ theo quy trình 2.2.1 Cho vào bình phản ứng 50ml nƣớc cất, sục khí Argon khuấy liên tục vịng 15 phút Sau đó, cho 0.01mol FeCl2.4H2O 0.02mol FeCl3.6H2O vào bình phản ứng, tiếp tục khuấy muối tan hết Ngay sau đó, cho từ từ giọt dung dịch NH3 (khoảng 30ml) vào hỗn hợp phản ứng dung dịch chuyển hoàn toàn sang màu đen Sự biến đổi màu dung dịch đƣợc thể hình 3.1 Tiếp tục khuấy hỗn hợp phản ứng 80oC khoảng 60 phút Cuối cùng, dùng từ tính để tách hạt nano oxit sắt từ khỏi hỗn hợp phản ứng rửa lại nhiều lần nƣớc cất đến đạt mơi trƣờng trung tính Hình 3.1: (a) Dung dịch hỗn hợp muối Fe3+ Fe2+ (b) Dung dịch sau cho tác dụng với ddNH3 3.2 Cố định enzyme GOx lên hạt nano oxit sắt từ Để tổng hợp hạt nano enzyme GOx – Fe3O4 từ tính, chúng tơi sử dụng phƣơng pháp tạo liên kết ngang, sử dụng glutaraldehyde làm cầu nối Chúng tiến hành cố định enzyme GOx lên hạt nano oxit sắt từ theo quy trình 2.2.3 Cho 30ml dung dịch Glutaraldehyde 4% vào 0,5g nano oxit sắt từ Sau đó, hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy liên tục khoảng nhiệt độ phòng Dùng từ tính tách hạt nano khỏi dung dịch phản ứng rửa lại nhiều lần nƣớc cất 36 Tiếp tục thêm 20 ml dung dịch enzyme GOx (0,5mg/ml, pH 6.0) khuấy liên tục điều kiện thƣờng Các hạt nano oxit sắt từ với GOx đƣợc tách từ tính rửa lại vài lần dung dịch đệm (pH 6.0) 3.2 Kết phân tích đặc trƣng vật lý hạt nano oxit sắt từ hạt nano GOx – Fe3O4 3.2.1 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Chúng tiến hành chụp ảnh TEM cho mẫu nano oxit sắt từ với mong muốn xác định rõ ràng kích thƣớc hình dạng hạt Hình ảnh chụp TEM đƣợc thể hình 3.2 Từ kết TEM cho thấy hạt nano sắt từ có dạng cầu Đồng thời, phía dƣới ảnh TEM có thang đo 100nm, ta chọn hạt nano ảnh TEM so sánh kích thƣớc với thang đo chuẩn ảnh ta thấy hạt nano oxit sắt từ có kích thƣớc khoảng từ 10 – 20nm Hình 3.2: Kết chụp TEM hạt nano oxit sắt từ 37 3.2.2 Kết phổ nhiễu xạ tia X (XRD) Mục đích phép đo xác định đặc trƣng cấu trúc tinh thể hạt nano oxit sắt từ GOx – Fe3O4 Mẫu nano oxit sắt từ GOx – Fe3O4 sau tổng hợp đƣợc rửa vài lần tiến hành sấy khơ Sau mẫu đƣợc đem đo phổ nhiễu xạ tia X Kết đo phổ đƣợc thể hình 3.3 Kết cho thấy có đỉnh peak đặc trƣng Fe3O4 xuất lần lƣợt góc 2θ lần lƣợt 30,13o; 35,65o; 43,12o; 53,65o; 57,16o; 62,86o Các đỉnh nhiễu xạ cực đại ứng với đỉnh chuẩn cấu trúc oxit sắt từ dạng nano Trong kết đo nhiễu xạ tia X không xuất đỉnh nhiễu xạ lạ, chứng tỏ có pha oxit sắt từ cấu trúc tinh thể Sau cố định enzyme GOx lên hạt nano Fe3O4, phổ nhiễu xạ tia X xuất đỉnh peak đặc trƣng góc 2θ nhƣng cƣờng độ phản xạ bề mặt bị giảm đỉnh peak đặc trƣng Điều cho thấy q trình cố định enzyme GOx khơng làm thay đổi pha hạt Fe3O4 nhƣng làm thay đổi bề mặt tinh thể Fe3O4, chứng tỏ đƣợc phần gắn kết của enzyme lên bề mặt Fe3O4 Hình 3.2: Phổ nhiễu xạ tia X hạt nano Fe3O4 và GOx-Fe3O4 38 3.2.3 Kết đo đường cong từ hóa Tiến hành đo đƣờng cong từ hóa mẫu nano oxit sắt từ GOx – Fe3O4 nhiệt độ phịng sử dụng hệ thiết bị từ kế mẫu rung Mục đích phép đo xác định tính chất từ từ độ bão hòa mẫu nano oxit sắt từ GOx – Fe3O4 Kết đo đƣợc thể hình 3.3 80 60 40 20 GOx-MNPs -15000 -10000 -5000 5000 10000 15000 MNPs -20 -40 -60 -80 Hình 3.3: Kết đo đường cong từ hóa Kết cho thấy mẫu nano oxit sắt từ GOx – Fe3O4 lực kháng từ gần 0, nhƣ ta kết luận hạt nano oxit sắt từ có tính siêu thuận từ nhƣ việc cố định enzyme GOx không làm ảnh hƣởng nhiều đến tính siêu thuận từ hạt nano oxit sắt từ Đƣờng cong đƣờng đối xứng, từ độ bão hịa (tính theo emu/g) tƣơng đối cao, cụ thể đồ thị ta thấy, từ độ bão hòa hạt nano oxit sắt từ 64,5emu/g GOx – Fe3O4 55emu/g Nhƣ ta thấy, việc cố định enzyme làm giảm từ tính hạt nano oxit sắt từ, nhiên, từ tính hạt nano GOx – Fe3O4 tƣơng đối cao 39 3.2.4 Phổ hồng ngoại FT – IR Để xác định gắn kết phân tử enzyme GOx lên hạt nano oxit sắt từ, lấy mẫu nano oxit sắt từ GOx – Fe3O4 sấy khô tiến hành chụp phổ hồng ngoại FT – IR Kết chụp phổ hồng ngoại đƣợc thể hình 3.4 Hình 3.4: Kết phổ hồng ngoại FT – IR: (a) Fe3O4 (b) GOx–Fe3O4 Các dải phổ IR số sóng thấp (từ 500 cm-1 đến 700 cm-1) liên quan đến dao động liên kết Fe─O oxit sắt Peak hấp thụ đặc trƣng hạt nano Fe3O4 khoảng 584 cm-1 Peak hấp thụ khoảng 3440cm-1 peak đặc trƣng nhóm ─OH bề mặt hạt Fe3O4 Xuất peak hấp thụ 1637 cm-1, đặc trƣng cho dao động liên kết C=N Điều chứng tỏ enzyme GOx đƣợc gắn lên hạt nano Fe3O4 cách tạo liên kết C=N với phân tử glutaraldehyde theo phƣơng trình: R─CH=O + H2N─Enzyme R─CH=N─Enzyme + H2O Mặt khác, xuất đỉnh peak đặc trƣng số sóng 1414,35 (tƣơng ứng với dao động liên kết N−H) khẳng định gắn kết phân tử enzyme lên hạt nano oxit sắt từ 40 3.5 Đánh giá hoạt tính enzyme cố định Để chắn gắn kết phân tử enzyme hạt nano oxit sắt từ, đồng thời so sánh khả xúc tác cho phản ứng oxi hóa glucose GOx – Fe3O4 với enzyme GOx tự ta tiến hành theo quy trình 2.2.5 Cho khoảng 0,5g GOx – Fe3O4 vào 100ml dung dịch glucose 1,25% Khuấy liên tục máy khuấy từ khoảng điều kiện thƣờng Sau đó, tách hạt GOx – Fe3O4 từ tính lấy phần dung dịch đo hàm lƣợng glucose lại Sau tiến hành phản ứng oxi hóa glucose với xúc tác enzyme GOx tự hạt nano GOx – Fe3O4, hàm lƣợng glucose lại đƣợc xác định cách phân tích lƣợng glucose cịn lại mẫu Kết xét nghiệm hàm lƣợng glucose đƣợc thể hình 3.5 hình 3.6 Qua kết phân tích cho thấy, xúc tác phản ứng hạt nano GOx – Fe3O4, hàm lƣợng glucose lại mẫu 44,31 mmol/g Chúng tơi tiến hành tính tốn dựa số liệu thu đƣợc để đánh giá khả xúc tác phản ứng oxi hóa glucose hạt nano GOx – Fe3O4 so với enzyme GOx tự  Tính tốn:  Nồng độ glucose ban đầu: 0,0125g/ml  Xúc tác phản ứng oxy hóa glucose enzyme cố định: Nồng độ glucose sau oxi hóa = Hiệu suất phản ứng oxi hóa glucose với xúc tác enzyme GOx tự do: H% = Kết cho thấy, enzyme GOx đƣợc gắn kết lên hạt nano Fe3O4 cịn hoạt tính xúc tác q trình oxi hóa glucose 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Enzyme cố định bƣớc bƣớc phát triển cao công nghệ sinh học, làm tăng hiệu sử dụng enzyme, dễ dàng tách enzyme khỏi hỗn hợp phản ứng, ngƣng q trình phản ứng thời điểm nào, sử dụng nhiều lần, độ bền vững ổn định cao so với enzyme tự Việc nghiên cứu cố định enzyme xây dựng đƣợc quy trình cố định enzyme lên chất mang oxit sắt từ cho kết ban đầu để đánh giá hoạt tính enzyme cố định so với enzyme tự Trong thời gian tới cần có nghiên cứu sâu sắc ảnh hƣởng pH, nhiệt độ đến khả gắn kết enzyme nhƣ hoạt tính enzyme sau cố định Cần có nghiên cứu đƣa đƣợc mơ hình thí nghiệm cân đối hƣớng tới ứng dụng rộng rãi đời sống sản xuất 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tiếng Anh [1] Fatemeh Mahdizadeh, Afzal Karimi, Leili Ranjbarian, Immobilization of Glucose Oxidase on Synthesized Superparamagnetic Fe3O4 Nanoparticles; Application for Water Deoxygenation, International Journal of Scientific & Engineering Research Volume 3, 2012 [2] Gilles K Kouassi, Activity of glucose oxidase functionalized onto magnetic Nanoparticles, BioMagnetic Research and Technology, 2005 * Tiếng Việt [3]http://vietsciences.free.fr/thuctap_khoahoc/thanhtuukhoahoc/chetaohatnanooxyts attutinh.htm [4]http://www.mientayvn.com/Cao%20hoc%20quang%20dien%20tu/Tai_lieu_cua_ BMVLUD/Nano_tu_va_cong_nghe_nano/Nano_tu/N_Nano_tu_long_trong_y_kho a_va_sinh_hoc.pdf [5] Lê Thị Hồng Diễm, Chế tạo hạt nano Fe3O4 khảo sát số tính chất đặc trưng, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, 2009 [6] Ngơ Đại Nghiệp, Enzyme cố định ứng dụng, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học, 2013 [7] Nguyễn Bảo Dƣ, Công nghệ cố định enzyme ứng dụng, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, 2011 [8] Nguyễn Hồng Hải, Ứng dụng hạt nano từ tính oxit sắt [9] Siyi Pan, Immobilization of β-glucosidase onto magnetic nano particles and Evaluation of the enzymetic properties, Bioresource.com, 2013 [10] ThS Lê Thanh Hải, Công nghệ sinh học, Trƣờng Cao đăng Kinh tế Cơng nghệ Tp Hồ Chí Minh, Khoa Cơng nghệ Sinh học, 2013 43 [11] Trần Mậu Danh, Chế tạo ứng dụng hạt nano từ tính tron y sinh, Báo cáo Hội nghị Vật lý toàn quốc toàn quốc lần thứ VI, 2005 [12] Trần Thị Dung, Chế tạo nghiên cứu tính chất từ hạt nano Fe3O4 ứng dụng y sinh, tạp chí khoa học ĐHQGHN, Khoa học tự nhiên công nghệ, 2007 [13] Trần Thị Phƣơng Thúy, Nghiên cứu tổng hợp, đặc trưng vật lý lai tạo Chitosan/oxit sắt ứng dụng hấp phụ Niken (II) xử lý nước thải chứa kim loại nặng, Trƣờng Đại học Phƣơng Đông, 2009 [14] Trần Văn Hoàng, Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốcAspergillus ninger, 2014 44 ... đề tài: ? ?Nghiên cứu tổng hợp hạt nano enzyme Glucose oxidase – Fe3O4 từ tính? ?? Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4- NPs) Cuối thập niên 80, công nghệ nano bắt... 36 3.1 Tổng hợp hạt nano oxit sắt từ 36 3.2 Cố định enzyme GOx lên hạt nano oxit sắt từ 36 3.2 Kết phân tích đặc trƣng vật lý hạt nano oxit sắt từ hạt nano GOx – Fe3O4 ... với không dùng hạt nano từ tính. [8] 1.2 Tổng quan enzyme glucose oxidase 1.2.1 Giới thiệu enzyme glucose oxidase Glucose oxidase (GOx) enzyme xúc tác cho q trình oxi hóa  - D – glucose thành