Chiết tách enzyme và ứng dụng trong phân tíchkim loại nặng

PHẦN MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài: Trước kỷ XVII người ta biết sử dụng q trình enzyme đời sống song có tính chất kinh nghiệm thực tế thông qua hoạt động vi sinh vật Ðó q trình lên men rượu, muối dưa, làm tương nước chấm Ở thời kỳ người ta chưa hiểu chất enzyme trình xảy hoạt động enzyme Cho đến đầu kỷ XIX nhà khoa học khái quát trình hoạt động enzyme tượng phổ biến sống vai trò quan trọng enzyme chuyển hoá chất Đến nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme loại phát triển mạnh mẽ qui mô công nghiệp, hàng năm lượng enzyme sản xuất giới đạt khoảng 300.000 với giá trị 500 triệu USD Thực tế có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán thị trường giới, chế phẩm enzyme phổ biến amylase, protease, catalase, glucoseoxydase, cellulase, lipase… Các chế phẩm khai thác tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp ứng dụng Đến việc nghiên cứu enzyme bước vào giai đoạn với kết hợp nhiều ngành khoa học khác nhau: hoá học protein, lý sinh phân tử, sinh học phân tử… Trong nghiên cứu thu nhận, chiết tách enzyme hay thiết kế định hướng phân tử enzyme ưu việt dạng tự nhiên Sản phẩm từ q trình chiết tách enzyme khơng ứng dụng y học mà ứng dụng nhiều lĩnh vực phân tích kim loại, cơng nghiệp, nơng nghiệp hóa học… Do trình chiết tách thu nhận protein, enzyme giữ vai trị quan trọng khơng ngừng cải tiến để đạt độ tinh cao nhằm phục vụ cho người Kim loại nặng có Hg, Cd, Pb, Cu, Zn, Mn… thường không tham gia tham gia vào q trình sinh hóa thể sinh vật thường tích lũy thể sinh vật, mơi trường Vì vậy, chúng nguyên tố độc hại với sinh vật môi trường Hiện tượng nước bị ô nhiễm kim loại nặng thường gặp lưu vực gần khu công nghiệp, thành phố lớn khu vực khai thác khoáng sản Đồng thời nhiều nhà máy chưa có thiết bị xử lý chất thải nước thải trước xả vào cống rãnh, sông hồ nên làm suy giảm chất lượng nước bề mặt, mơi trường khơng khí mơi trường đất Ơ nhiễm kim loại nặng biểu nồng độ cao kim loại nặng nước Trong số trường hợp, xuất hiện tượng sinh vật chết hàng loạt Chính việc tăng cường biện pháp xác định xác hàm lượng kim loại nặng nước thải nhiệm vụ cần thiết quan tâm nghiên cứu ứng dụng Do chúng tơi lựa chọn đề tài nghiên cứu “Chiết tách enzyme ứng dụng phân tích kim loại nặng” Với mong muốn bước đầu định hình xây dựng quy trình chiết tách, ứng dụng enzyme phân tích kim loại nặng Nội dung nghiên cứu đề tài - Xây dựng quy trình chiết tách enzyme - Nêu ngun lí cảm biến áp dụng phân tích - Nêu ứng dụng enzyme phân tích kim loại nặng PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1: ENZYME VÀ QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH TINH CHẾ ENZYME 1.1 Khái niệm enzyme Các trình hóa học xảy thể sống phản ứng có hiệu cao Đó nhờ tác dụng xúc tác enzyme, enzyme chất xúc tác sinh học protein axit nucleic tổng hợp tế bào sống Enzyme có tính chất ưu việt so với chất xúc tác khác như: hiệu suất cao điều kiện nhiệt độ áp suất bình thường có tính chất đặc hiệu cao Các tính chất giữ nguyên tách enzyme khỏi hệ thống sống, hoạt động bình thường điều kiện invitro (trong ống nghiệm) Đồng thời enzyme làm tăng tốc độ phản ứng mà khơng bị biến đổi sau phản ứng Vì mà enzyme sử dụng rộng rãi thực tế, công nghiệp để khai thác sử dụng hiệu cần có kiến thức định enzyme Enzyme chất protein thu nhận từ ba nguồn: động vật, thực vật, vi sinh vật Do đa dạng cấu trúc, tính chất, chức năng… Nên việc thu nhận tinh chế enzyme phức tạp trình tinh chế dựa vào đặc điểm cấu tạo, tính chất loại enzyme mục tiêu, phải trải qua nhiều công đoạn khác tùy loại enzyme Tuy trình tinh enzyme ứng dụng phương pháp sau: thu dịch chiết (cơ học, lý, hoá), kết tủa (bằng muối, dung môi hữu cơ, điểm đẳng điện), thẩm tách, bước tinh sắc ký (sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng cao áp), kết tinh chế phẩm, đánh giá kết tinh kiểm tra hoạt tính enzyme: xây dựng đường biểu diễn độ hoà tan, điện di (điện di chiều, điện di dựa vào điểm đẳng điện, điện di hai chiều, điện di mao dẫn), siêu ly tâm, khối phổ 1.2 Bản chất hóa học enzyme Nếu tách enzyme khỏi tế bào tiến hành phân tách thành phần hóa học chúng, ta thấy chúng thuộc nhóm: + Nhóm enzyme đơn cấu tử: Thuộc nhóm bao gồm enzyme cấu tạo từ thành phần hóa học protein Những enzyme tạo thành từ protein gọi enzyme đơn cấu tử + Nhóm enzyme đa cấu tử: Thuộc nhóm bao gồm enzyme có thành phần: - Apoprotein hay apoenzyme: Phần protein - Agon: Phần thứ thành phần protein Phần thường chất hữu đặc hiệu có vai trị thúc đẩy trình xúc tác Ở enzyme đa cấu tử, phần apoenzyme đóng vai trị xúc tác thiếu thành phần thứ hai (các chất hữu đặc hiệu) enzyme khơng thể hoạt động Chính thế, chất hữu đặc hiệu gọi chất cộng tác (cofactor) Các chất hữu đặc hiệu gắn chặt với phần protein, gắn lỏng với phần protein Hình 3: Hoạt động enzyme cấu trúc Hình 4: Mơ hình enzyme – chất 1.3 Cấu trúc enzyme Enzyme dạng protein đặc biệt Ngoài cấu trúc giống cấu trúc bình thường protein, enzyme cịn có cấu trúc đặc biệt liên quan đến hoạt động enzyme Khơng phải tồn phần enzyme tham gia vào hoạt động xúc tác, mà có phận đặc biệt mang tính đặc hiệu phân tử protein tham gia xúc tác phản ứng Bộ phận đặc hiệu gọi trung tâm hoạt động enzyme Trung tâm hoạt động enzyme bao gồm: + Những nhóm hóa học, liên kết peptide tiếp xúc trực tiếp với chất + Những nhóm hóa học, liên kết peptide không tiếp xúc trực tiếp với chất có chức trực tiếp q trình xúc tác + Phần cịn lại đóng vai trị khung, giữ cho cấu trúc khơng gian thích hợp với khả xúc tác Nếu bị tác động điều kiện bên nhiệt độ, pH, nồng độ chất, khung biến đổi cấu trúc khơng gian Từ làm thay đổi sâu sắc hoạt tính enzyme Phần phân tử enzyme khơng có liên quan đến hoạt tính enzyme, bị tác động, bị bị biến đổi hồn tồn khơng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Trung tâm hoạt động enzyme thường chứa amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh amino acid serine, histidine, cysteine, lysine, arginine, glutamic acid, aspartic acid, tryptophan Các nhóm hóa học hoạt động có khả gắn với chất để tạo thành phức chất enzyme - chất Những nhóm hóa học hoạt động mạnh bao gồm: + Nhóm NH2 lysine + Nhóm -SH cysteine + Nhóm γ-carboxyl glutamic acid Các gốc amino acid tạo trung tâm hoạt động enzyme thường không nằm cạnh chuỗi polypeptide thẳng (cấu trúc bậc 1) Trong thực tế, chuỗi polypeptide enzyme tồn trạng thái không gian (cấu trúc bậc 3, bậc 4) nên amino acid thường tồn gần theo cấu trúc không gian Do cấu trúc không gian vậy, trung tâm hoạt động tạo thành Trong trung tâm hoạt động enzyme người ta thấy có ion kim loại Các ion kim loại có mặt trung tâm hoạt động enyzme có vai trị xúc tác lớn Ngoài gốc amino acid, ion kim loại, nhà khoa học cho thấy nhóm chức coenzyme coi phần cấu tạo trung tâm hoạt động enzyme 1.4 Phân loại enzyme Năm 1960, hiệp hội hóa sinh quốc tế (IUB) thống phân loại enzyme làm lớp đánh số thứ tự từ đến Các số thứ tự cố định cho lớp Mỗi lớp lại chia làm nhiều tổ, tổ lại chia làm nhiều nhóm, thế, theo hệ thống phân loại, enzyme thường có chữ số: số thứ lớp, số thứ tổ, số thứ nhóm, số thứ enzyme Oxydoreductase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử Transpherase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị Hydrolase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân Liase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước tạo thành liên kết đôi kết hợp phân tử nước vào liên kết đôi Isomerase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa Ligase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu lượng ATP… 1.5 Phương pháp tách tinh chế enzyme 1.5.1 Các phương pháp phá vỡ tế bào Enzyme loại protein tạo thành tế bào, phần lớn chúng tồn tế bào Các enzyme thường khơng có khả di chuyển qua màng sinh học Do đó, việc tách chúng khỏi tế bào diều khó khăn Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào nhiều phương pháp Các phương pháp phá vỡ tế bào thường sử dụng như:  Phương pháp học: nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa thiết bị đồng hóa…  Phương pháp vật lý: dùng sóng siêu âm  Phương pháp hóa học: dùng loại dung mơi, butylic, acetone, glycerol, ethylacetate Có khó khăn tách enzyme khỏi tế bào cần phải lưu ý: + Enzyme có tế bào sinh vật với lượng khơng lớn so với thành phần khác Do đó, việc tách để thu nhận thành phần nhỏ điều khó + Enzyme chất hữu khơng bền, chúng dễ bị biến tính bị tác động yếu tố bên + Enzyme protein, protein enzyme luôn loại protein enzyme lại có tính chất hóa lý giống protein enzyme Do đó, việc tách protein enzyme khỏi loại protein lúc đạt kết tốt khơng phải khơng gặp khó khăn định 1.5.2.Phương pháp gây biến tính chọn lọc Sau phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính để tách enzyme khỏi sinh khối xử lý theo phương pháp Dịch chiết thu người ta gọi chế phẩm enzyme thô Sở dĩ gọi chế phẩm enzyme thơ chế phẩm ngồi enzyme cịn có nước, protein khơng phải enzyme thành phần tế bào Như việc làm enzyme việc loại protein khơng phải enzyme (đôi loại bỏ protein – enzyme không mong muốn), nước, thành phần khác tế bào khỏi enzyme Cơng việc hồn tồn khơng dễ dàng Do việc làm enzyme địi hỏi người làm nghiên cứu enzyme, hiểu biết enzyme phải nắm vững nhiều thao tác kỹ thuật khác để tránh gây tính hoạt động enzyme Để loại bỏ thành phần enzyme ta cần, người ta thực số phương pháp sau: + Phương pháp gây biến tính chọn lọc: phương pháp dựa tác động nhiệt độ, pH làm biến tính chọn lọc loại protein tạp Phương pháp thích hợp với enzyme chịu acid bền nhiệt Người ta đưa nhiệt độ dung dịch enzyme lên 50 – 70 oC pH < Ở điều kiện enzyme không bền nhiệt không chịu pH thấp bị biến tính Sau phương pháp ly tâm phương pháp lọc để loại bỏ thành phần enzyme mà ta mong muốn + Phương pháp kết tủa phân đoạn: dựa sở khả kết tủa enzyme nồng độ muối khác nhau, người ta thường sử dụng (NH 4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme Bằng cách này, người ta số protein tạp giai đoạn đầu q trình làm enzyme Ngồi muối (NH4)2SO4 ra, người ta cịn sử dụng số dung mơi hữu để kết tủa enzyme Phương pháp kết tủa thường làm biến tính nhanh Vì trước tiến hành kết tủa, người ta tiến hành làm lạnh chất kết tủa dung dịch enzyme + Phương pháp hấp thụ chọn lọc: người ta hấp thụ trực tiếp vào dung dịch enzyme, cho dung dịch enzyme chảy qua cột, cột có chứa chất hấp thụ Chất hấp thụ sử dụng rộng rãi hydrocyapatite Người ta thực hai cách sau: hấp thụ enzyme hấp thụ protein tạp Để tránh làm biến tính enzyme, người ta thường thực q trình hấp thụ nhiệt độ 0oC Sau hấp thụ người ta lại tiến hành trình chiết enzyme (quá trình phản hấp thụ) dung mơi thích hợp + Phương pháp sắc ký: dựa sở phản ứng trao đổi protein tan nước tác nhân trao đổi ion, người ta sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion để làm enzyme 1.5.3 Ý nghĩa kĩ thuật tinh công nghệ enzyme Công nghệ enzyme giai đoạn sản xuất chế phẩm enzyme thô kết thúc giai đoạn tạo thành chế phẩm tinh khiết Bắt đầu từ chế phẩm enzyme thô, người ta tiến hành tinh enzyme nhiều kỹ thuật khác Các kỹ thuật tinh thường đưa đến kết quan trọng sau: + Khối lượng chế phẩm enzyme giảm dần qua bước tinh Chế phẩm enzyme thô thường chứa thành phần sau: - Nước chiếm khối lượng lớn - Protein khơng có hoạt tính sinh học - Các tạp chất từ tế bào (nếu nguồn động vật thực vật), môi trường nuôi cấy (nếu nguồn từ vi sinh vật) Enzyme (hay protein có hoạt tính sinh học) Như vậy, trình tinh trình loại bỏ ba phần trên, nhận sản phẩm cuối protein có hoạt tính sinh học Việc loại bỏ thành phần đầu thực giai đoạn mà phải thực qua nhiều giai đoạn khác nhau, giai đoạn ta loại bỏ phần enzyme khỏi hỗn hợp Khi thành phần enzyme loại dần ra, khối lượng chế phẩm giảm theo Như vậy, enzyme tinh theo kỹ thuật khác thu nhận giá trị quan trọng sau: + Giảm khối lượng Trị số có nghĩa cho việc đóng bao bì, vận chuyển, sử dụng bảo quản + Tăng hoạt tính enzyme có ý nghĩa lớn trình sử dụng sau + Tăng giá trị kinh tế thông qua giá thành sản phẩm 1.5.4 Các phương pháp học tách enzyme Các phương pháp học ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào thành phần khác gồm phương pháp: + Phương pháp ly tâm: ly tâm tách vật chất rắn khỏi dung dịch Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường ứng dụng rộng rãi để thu nhận dung dịch enzyme, dung dịch chứa enzyme ngoại bào Enzyme nội bào nằm tế bào sinh vật muốn thu nhận enzyme nội bào ta cần phải tiến hành phá vỡ tế bào Phần lớn enzyme ngoại bào enzyme hòa tan Như tiến hành ly tâm, dung dịch tách khỏi thành phần rắn dung dịch enzyme thô Dung dịch enzyme thơ cịn chứa thành phần sau: Protein có hoạt tính sinh học, chất hịa tan khác, nước Phương pháp ly tâm tách thành phần rắn có tỷ trọng lớn dung dịch Dịch thu chưa phải chế phẩm enzyme tinh khiết mà chế phẩm enzyme thơ, cịn chứa protein khơng hoạt động, nước chất hịa tan khác Để tránh tượng biến tính enzyme, mẫu nghiên cứu, người ta thường tiến hành ly tâm lạnh, cịn sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp, người ta thường tiến hành điều kiện nhiệt độ thấp Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịch enzyme máy ly tâm liên tục Phương pháp ly tâm liên tục có ưu điểm thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục không gây ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme + Phương pháp lọc: Trong cơng nghệ enzyme, sau phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau lên men, người ta thường sử dụng trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme ngoại bào hòa tan Lọc phương pháp tách thành phần rắn khỏi dung dịch Lọc phương pháp thực thường gặp nhiều khó khăn kích thước vật chất tế bào thường nhỏ độ nhớt dung dịch thường cao Cả hai yếu tố làm cản trở trình lọc Tốc độ lọc phụ thuộc lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc, áp suất lọc, độ nhớt dịch lọc… Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng kiểu sau: - Lọc ép: thường sử dụng trường hợp dung dịch cần lọc có khối lượng nhỏ Phương pháp sử dụng để lọc enzyme có hiệu - Lọc chân không: phương pháp ứng dụng nhiều nghiên cứu sản xuất sản phẩm sinh học có hoạt tính Trong lọc chân khơng quay sử dụng nhiều - Lọc theo dòng chảy cắt ngang: năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang Theo đó, dịng dung dịch lọc chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc Phần lọc thoát qua vật liệu lọc xuống phía Phương pháp có ưu điểm làm giảm sức đề kháng q trình lọc vật liệu rắn - Lọc thơng thường: phương pháp lọc thơng thường có từ lâu Hiện nay, số nhà máy sử dụng Phương pháp dần thay phương pháp khác nhanh hơn, có hiệu [2] 1.5.5 Các phương pháp phá vỡ tế bào sinh vật Mục đích việc phá vỡ tế bào giải phóng tồn chất có tế bào Cùng với chất có tế bào giải phóng enzyme nội bào Đối với tế bào động vật tế bào thực vật ta phải tiến hành nghiền nát trước thực q trình trích ly, lọc, cô đặc, làm sấy Đối với tế bào vi sinh vật phải tiến hành tách phương pháp ly tâm phương pháp lọc Phần dịch lọc thu hai phương pháp dịch chế phẩm enzyme ngoại bào Phần sinh khối vi vinh vật sau ly tâm lọc chứa enzyme nội bào Việc phá vỡ tế bào động vật thực vật khơng khó khăn phá vỡ tế bào vi sinh vật phức tạp tế bào vi sinh vật vừa có kích thước nhỏ, vừa có thành tế bào có cấu trúc đặc trưng Do đó, phá vỡ tế bào vi sinh vật địi hỏi phải có phương pháp đặc biệt 1.5.5.1 Phá vỡ tế bào phương pháp học: Mục đích phá vỡ tế bào giải phóng chất có tế bào đảm bảo hoạt tính enzyme nội bào Đối với tế bào động vật (thường sử dụng tồn quan hay mơ bào) có chứa enzyme cần phải trữ nhiệt độ thấp để tránh hoạt tính enzyme Trước trữ lạnh cần loại bỏ mỡ hoạt thành phần khác bám theo mơ bào đó, mẫu cần xử lý nhanh phải thu nhận enzyme thời gian không kể từ giết mổ Đối với tế bào mô thực vật cần phải làm trữ lạnh chưa tiến hành thu nhận enzyme Tế bào động vật thực vật thường dễ phá vỡ phương pháp học Riêng tế bào vi sinh vật, việc phá vỡ tế bào gặp phải khó khăn định: + Thứ nhất: tế bào vi sinh vật có kích thước q nhỏ, việc phá vỡ tế bào phương pháp nghiền khơng có chất trợ nghiền khơng có hiệu + Thứ hai: vi sinh vật thể đơn bào, phát triển môi trường (đơn bào môi trường lỏng) có nhiều chất thủy phân, chúng tạo nhiều enzyme ngoại bào tương ứng Các enzyme ngoại bào hịa tan có hạn mơi trường dễ dàng tách chúng khỏi dung dịch nuôi cấy Do cơng nghiệp, trừ trường hợp phải thu nhận enzyme nội bào người ta tiến hành nghiền tế bào vi sinh vật Phương pháp đồng hóa áp lực cao: phương pháp ứng dụng rộng rãi để phá vỡ tế bào vi sinh vật Huyền phù tế bào vi sinh vật nén với áp suất cao, chúng va chạm mạnh vào vành ống Tế bào bị phá vỡ lực cắt sức nén Phương pháp nghiền ẩm: phương pháp sử dụng rộng rãi công nghiệp sản xuất enzyme Trong trình nghiền, người ta sử dụng viên bi thủy tinh có kích thước 0,2 – 1mm để tăng trình phá vỡ tế bào Trong nhiều trường hợp, người ta không dùng viên bi thủy tinh mà người ta dùng hạt thủy tinh hạt thủy tinh có độ ma sát cao 1.5.5.2 Phá vỡ tế bào phương pháp khơng phải học: Ngồi phương pháp học trên, người ta phá vỡ tế bào phương pháp sau: + Phương pháp hóa học: dựa vào khả tạo áp suất thẩm thấu mạnh, khả oxy hóa mạnh chất hóa học để phá vỡ thành tế bào Phương pháp khơng địi hỏi áp suất cao, phí dễ thực hiện.Tuy nhiên, q trình thực hiện, người ta sử dụng hóa chất nên hóa chất thường lẫn vào hỗn hợp, địi hỏi q trình tách phức tạp Một hóa chất sử dụng nhiều acetone + Phương pháp vật lý: sử dụng siêu âm, thường sử dụng quy mơ phịng thí nghiệm chưa sử dụng công nghiệp Phương pháp vật lý tạo shock nhiệt shock thẩm thấu Nguyên tắc phương pháp đưa nhiệt độ huyền phù tế bào xuống nhiệt độ thấp, nâng nhiệt lên 40 oC thành tế bào bị phá vỡ người ta thu huyền phù tế bào vỡ Phương pháp thường dễ thực hiện, đảm bảo hoạt tính enzyme hiệu suất phá vỡ tế bào không cao Phương pháp sinh học: có phương pháp sử dụng rộng rãi phương pháp tự phân phương pháp thủy phân enzyme đưa từ bên vào + Phương pháp thủy phân tạo điều kiện tối ưu cho số enzyme có khả phân giải số thành phần thành tế bào, enzyme phải enzyme có tế bào tế bào Bình thường enzyme không hoạt động mạnh, điều kiện nhiệt độ, pH, nước bên tế bào mà trùng với mức độ hoạt độ tối ưu chúng, chúng hoạt động mạnh thủy phân thành tế bào, làm chết tế bào + Tự phân trình áp dụng nhiều phá vỡ thành tế bào loại nấm men Người ta thường tiến hành tự phân huyền phù tế bào nấm men nhiệt độ 48 – 52 oC khoảng thời gian – 24 Phương pháp có nhiều nhược điểm q trình thủy phân, enzyme có tế bào không thủy phân chất thành tế bào mà chất có tế bào, chí enzyme bị phá hủy Phương pháp không sử dụng nhiều công nghiệp 1.5.5.3 Các phương pháp cô đặc Dung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều Để xử lý khối lớn dung dịch enzyme phải tốn nhiều cơng sức chi phí cho xử lý cao Mặt khác lượng enzyme có dịch enzyme thơ q ít, hoạt tính enzyme khơng cao Chính phải đặc dung dịch enzyme nhằm mục đích: + Làm tăng hoạt tính enzyme + Làm giảm chi phí cơng sức cho việc xử lý sau + Tăng khả bảo quản enzyme + Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản + Tăng hiệu suất tác động enzyme chất Để đạt mục đích đó, người ta tiến hành cô đặc enzyme phương pháp sau: + Phương pháp nhiệt: sử dụng nhiệt để cô đặc enzyme thường khó khăn enzyme protein nhạy cảm với nhiệt độ Q trình đặc nhiệt trình làm bốc nước, làm cho lượng nước dung dịch giảm đi, hàm lượng enzyme dung dịch tăng lên, hoạt tính enzyme tăng cao Tuy nhiên phải ý đến điều kiện nhiệt độ để khống chế khoảng cho phép hoạt tính enzyme bảo tồn + Phương pháp kết tủa: enzyme phức hợp protein có khả kết tủa với số dung môi Kết tủa muối: muối nồng độ cao tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hịa tan enzyme Trong công nghiệp thường sử dụng muối ammonium sulfate Nhiệt độ tiến hành kết tủa: 35 – 40 oC, nồng độ muối: 20 – 80% Kết tủa dung mơi hữu cơ: dung mơi hữu có ảnh hưởng lớn đến khả hòa tan enzyme, ảnh hưởng solvat hóa phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác phân tử enzyme tăng lên Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng ethanol acetone để kết tủa enzyme Nhiệt độ kết tủa: – 10 oC, tỷ lệ nồng độ dung môi hữu dùng để kết tủa enzyme xác định thực nghiệm cho loại enzyme nồng độ enzyme có dung dịch enzyme Kết tủa enzyme điểm đẳng điện: protein chất lưỡng cực Mức độ hòa tan enzyme phụ thuộc vào pH Kết tủa enzyme điểm đẳng điện thường thực quy mô nhỏ Thời gian tạo điểm đẳng điện thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme Phương pháp siêu lọc: phương pháp sử dụng màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ Người ta thường sử dụng cellulose acetate polymer hữu như: poly sulfone, polyvinylidene polypropylene làm nguyên liệu màng lọc 1.5.5.4 Các phương pháp tinh enzyme Có phương pháp tinh enzyme chính: - Phương pháp kết tinh -Phương pháp điện di -Phương pháp sắc ký + Sắc ký lọc gel + Sắc ký trao đổi ion + Sắc kí lực 1.5.5.5 Tạo sản phẩm enzyme Sau làm sạch, người ta tiến hành thực giai đoạn cuối tạo sản phẩm, đóng bao Chế phẩm enzyme tạo thành loại sản phẩm sau: enzyme dạng dung dịch, enzyme dạng huyền phù, enzyme dạng bột khô, enzyme dạng viên nhỏ Enzyme dạng dung dịch hay dạng huyền phù: có nhược điểm khó bảo quản, người ta thường đưa chúng vào dung dịch chất bảo quản.mặt khác sử dụng người ta phải giữ điều kiện nhiệt độ định, không bảo quản nhiệt độ cao Enzyme dạng bột khô dạng viên nhỏ: thường dễ dàng bảo quản khả bảo quản lâu, ra, chế phẩm enzyme thường dễ vận chuyển CHƯƠNG 2: NGUYÊN LÍ CẢM BIẾN TRONG PHÂN TÍCH 2.1 Cảm biến (Sensor): Cảm biến thiết bị dùng để cảm nhận biến đổi đại lượng vật lý đại lượng khơng có tính chất điện cần đo thành đại lượng đo xử lý Các đại lượng đo (M) thường khơng có tính chất điện (như nhiệt độ, áp suất, trọng lượng…) tác động lên cảm biến cho ta đại lượng đặc trưng (S) mang tính chất điện (như điện tích, điện áp, dịng điện hay trở kháng) chứa đựng thông tin cho phép xác định giá trị đại lượng Đặc trưng (S) hàm đại lượng cần đo (M) S = F(M) Người ta gọi (S) đại lượng đầu phản ứng cảm biến (M) đại lượng đầu vào hay kích thích (có nguồn gốc đại lượng cần đo) Thơng qua đo đạc (S) cho phép nhận biết giá trị (M) 2.2 Cảm biến điện hóa: 2.2.1 Khái niệm chung Cảm biến điện hóa thiết cấu hình để phát diện đo lường mức độ chất phân tích mẫu thơng qua q trình oxy hóa điện hóa giảm phản ứng cảm biến Những phản ứng biến đổi tín hiệu điện mà tương quan với nồng độ, độ tập trung, mức độ chất phân tích mẫu Hình : Cơ chế tương tác cảm biến điện hóa "Điện" electrooxidation electroreduction hợp chất điện cực thông qua nhiều đại lý chuyển điện tử Một hợp chất "cố định" bề mặt tiếp xúc hóa học dính vào bề mặt Đại lý chuyển nhượng điện tử hợp chất mang điện tử chất phân tích điện cực làm việc, trực tiếp, hợp tác với đại lý chuyển điện tử khác Một ví dụ đại lý chuyển điện tử trung gian hịa giải oxi hóa khử Điện cực làm việc điện cực mà chất phân tích (hoặc hợp chất thứ hai có mức độ phụ thuộc vào mức độ chất phân tích) electrooxidized electroreduced có khơng có quan đại lý chuyển điện tử Bề mặt làm việc phần điện cực làm việc phủ lớp truy cập đến đại lý chuyển điện tử cấu hình cho tiếp xúc với chất lỏng có chứa chất phân tích Có nhiều phương pháp để đo tín hiệu điện hóa có tương tác đầu chất cần phân tích phương pháp đo dịng, phương pháp đo thế, phương pháp đo độ dẫn, phương pháp đo phổ tổng trở 2.2.2 Phân loại: -Điên cực hóa trực tiếp: dùng để nhận biết điều kiện phù hợp với mục tiêu bị OXH-K gây tượng tích điện bề mặt điện cực Sự biến đổi điện tích ghi đo dịng điện Độnhạy cao -Điện cực hóa gián tiếp: việc OXH mục tiêu gián tiếp thông qua phân tử điện hóa trung gian, phần tử trung gian lấy enzyme từ base AND mục tiêu chuyển tới điện cực gây nên tượng tích điện điện cực  đo mật độ điện tích điện cực đo dòng điện 2.2.3.Nguyên tắc điện cực điện hóa -Điện cực enzyme chê tạo dạng màng enzyme mà mặt cua màng tiếp xúc với mơi trường nghiên cứu (cơ chất), cịn mặt tiếp xúc với vùng đo -Phản ứng OXH Khử chất enzyme xúc tác xảy lớp màng enzyme -Kết thay đổi lượng tự điện cực thu nhận nhận truyền qua hệ thống đo dạng dòng điện điện thể 2.2.2 Ưu điểm -Chọn lọc tối ưu -Chính xác tuyệt vời đo lường -Đáp ứng nhanh -Độ ổn định cao -Phạm vi ứng dụng lớn -Mọi cảm biến hiệu chỉnh trực tiếp giá trị lưu nhớ điện tử cục Tức cảm biến sử dụng Cấu trúc kỹ thuật chất lượng cao đảm bảo ổn định dài lâu độ trôi thời gian thấp -Các cảm biến phát chất phân tích với nồng độ thấp Hình : Cảm biến điện Hình 2: Máy cảm biến điện hóa 2.3.Cảm biến quang học: Nguyên lý hoạt động: Khi chiếu nguồn sáng thích hợp vào cảm biến, tính chất dẫn điện cảm biến thay đổi, làm mạch tín hiệu cảm ứng thay đổi theo Như thông tin ánh sáng chuyển thành thơng tin tín hiệu điện Đầu phát cảm biến phát nguồn sáng phía trước Nếu có vật thể che chắn, nguồn sáng tác động lên vật thể phản xạ ngược lại đầu thu, đầu thu nhận tín hiệu ánh sáng chuyển thành tín hiệu điện Tuỳ theo lượng ánh sáng chuyển về, mà chuyển thành tín hiệu điện áp, dịng điện khuyếch đại thành tín hiệu (Hình 5) 2.3.1 Nguyên tắc đo cảm biến quang dịch chuyển Ánh sáng từ nguồn sáng tập trung thấu kính hội tụ chiếu thẳng vào vật Tia sáng phản xạ từ vật tập trung lên dụng cụ cảm biến vị trí (PSD: position sensing device) thấu kính thu Nếu vị trí vật (khoảng cách đến thiết bị đo) thay đổi, hình ảnh vị trí vật hình thành PSD khác trạng thái cân hai ngõ PSD thay đổi ảnh vị trí vật hình thành PSD khác trạng thái cân PSD thay đổi Nếu ngõ A B, tính A/(A+B) sử dụng giá trị thích hợp để tăng hệ số “K” Offset “C” A Khoảng dịch chuyển = (K-C) A B Giá trị đo lường độ rọi (độ sáng) ngõ dịch chuyển A B, cường độ ánh sáng nhận đươc khoảng cách đến vật thay đổi kết ngõ tuyến tính tương ứng thay đổi khoảng cách thay đổi vị trí 2.3.2 Phân loại cảm biến Cảm biến quang thu phát độc lập (Thought Beam) Cảm biến quang phát thu chung (Retro Replective) Cảm biến quang khuyếch đại (Diffuse Replective) Cảm biến quang phản xạ giới hạn (Limited Reflective) 2.4 Cảm biến màu: Cảm biến màu phân tách ánh sáng phản xạ từ đối tượng thành thành phần đỏ, xanh xanh da trời Mỗi thành phần đánh giá xác định xem có thuộc phạm vi cảm nhận thiết lập trước cho màu riêng biệt Tiếp cận hiệu giám sát màu có độ đồng ứng dụng dệt may, công nghiệp nhựa trình cho màu đồng khác Một kênh nhạy màu cho phép ta thiết lập đặc tuyến vật thể cần phát với lối riêng biệt, với giá trị lưu nhớ cảm biến Thời gian đáp ứng cho cảm biến khoảng 300 µs kích thước điểm sáng lên tới 25 mm Cảm biến màu lấy tích phân tồn diện tích điểm sáng Vì thế, khoảng sáng có hai màu, cảm biến "xem xét" độ tổ hợp màu hơn phân tích màu riêng biệt Đây cân nhắc quan trọng ứng dụng nơi mà điểm cần phân tích có họa tiết dạng mảng màu hạt gỗ nhiều màu sắc nỉ làm ghế xe ôtô Trong ứng dụng vậy, cảm biến cho nguồn sáng với điểm sáng lớn lớn với khả cho phép lấy tín hiệu diện tích lớn phù hợp Giao diện người sử dụng (GUI) với tính đặc biệt tồn tính cho phép hiển thị thời gian thực, truy cập thiết lập độ nhạy cho màu, điều khiển cảm biến nói chung Những ứng dụng phân loại sản phẩm thường dựa vài màu bản, thực với cảm biến màu đơn giản Những ứng dụng phức tạp cần phần điều khiển thông minh cho cảm biến với đầy đủ tính Hình 4: Chương trình ứng dụng cho phép điều khiển thiết lập cảm biến từ đơn giản tới phức tạp kênh Nhiệm vụ phát bàn chải đánh phân loại màu khác E3MC loại sensor màu, dễ dàng nhận biết màu vật theo u cầu (có chức Teach) Tín hiệu E3MC nối với điều khiển để phân loại, xác định lỗi … CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH KIM LOẠI NẶNG 3.1 Khái niệm kim loại nặng Kim loại nặng kim loại có khối lượng riêng dao động từ = 3,5 g/cm sử dụng từ năm 1936–1996 Tuy nhiên, theo quan điểm gần đây, kim loại có khối lượng riêng >3 g/cm3 gọi kim loại nặng Các kim loại nặng bao gồm: Kim loại diện với lượng 100 phần triệu (100 µg/g) gọi kim loại vết gọi thiết yếu khi: (1) Hiện diện phận khỏe mạnh; (2) Xuất tế bào sinh ra; (3) Có cân tự nhiên máu; (4) Điều khiển trình tiết; (5) Biết chức sinh học Như vậy, hầu kết kim loại nặng kim loại vết số số ta biết chức sinh học, số chưa rõ 3.2 Cơ chế ảnh hưởng gây độc kim loại nặng lên tế bào Sinh vật cần kim loại thiết thiếu để trì sống Tuy nhiên, vượt nhu cầu kim loại nặng tích lũy sinh học gây độc cho tế bào Do đó, cân thể khả chịu đựng quan trọng để trì sống để làm cho độ độc cấp tính giảm bớt mức thấp mà Cd As điển hình Kim loại nặng tương tác làm biến đổi nội bào liên kết với nội bào hình thành nên enzyme phân hủy protein, tăng tổng hợp protein dị thường chế gây độc thường gặp nhiều kim loại nặng Về đặc tính bản, kim loại khơng thể phân hủy thành hợp phần nhỏ để gây độc, chúng thường gắn kết với hợp chất hữu Hệ thống enzyme thể khơng có chức khử độc gây kim loại nặng Những kim loại gây ung thư thường không liên kết với enzyme Ngược lại, kim loại nặng không yêu cầu hoạt hóa sinh học, mà phân tử hữu trải qua trình bổ sung vào hệ thống enzyme tạo biến đổi 3.3 Độc tính kim loại nặng Kim loại nặng có Hg, Cd, Pb, As, Sb, Cr, Cu, Zn, Mn, v.v thường không tham gia tham gia vào q trình sinh hóa thể sinh vật thường tích lũy thể chúng Vì vậy, chúng nguyên tố độc hại với sinh vật Hiện tượng nước bị ô nhiễm kim loại nặng thường gặp lưu vực nước gần khu công nghiệp, thành phố lớn khu vực khai thác khống sản Ơ nhiễm kim loại nặng biểu nồng độ cao kim loại nặng nước Trong số trường hợp, xuất hiện tượng cá thuỷ sinh vật chết hàng loạt Nguồn gây ô nhiễm kim loại nặng + Nguồn tự nhiên: Kim loại nặng phát nơi đá, đất xâm nhập thủy vực qua q trình tự nhiên, phong hóa, xói mịn, rửa trơi + Nguồn nhân tạo: q trình sản xuất cơng nghiệp (như khai khống, chế biến kim loại nặng, chế biến sơn, thuốc nhuộm…), nước thải sinh hoạt, nơng nghiệp (hóa chất bảo vệ thực vật) Ngun nhân chủ yếu gây ô nhiễm kim loại nặng q trình đổ vào mơi trường nước thải cơng nghiệp nước thải độc hại không xử lý xử lý khơng đạt u cầu Ơ nhiễm nước kim loại nặng có tác động tiêu cực tới mơi trường sống sinh vật người Kim loại nặng tích lũy theo chuỗi thức ăn thâm nhập thể người Nước mặt bị ô nhiễm lan truyền chất ô nhiễm vào nước ngầm, vào đất thành phần môi trường liên quan khác Để hạn chế ô nhiễm nước, cần phải tăng cường biện pháp xử lý nước thải công nghiệp, quản lý tốt vật ni mơi trường có nguy bị nhiễm nuôi cá, trồng rau nguồn nước thải Kim loại nặng có độc tính kim loại có tỷ trọng lớn gấp lần tỷ trọng nước Chúng kim loại bền (không tham gia vào q trình sinh hóa thể) có tính tích tụ sinh học (chuyển tiếp chuỗi thức ăn vào thể người) Chúng bao gồm Hg, As, Pb, Cd, Mn, Cu, Cr… Các kim loại nặng xâm nhập vào thể sinh vật gây độc tính 3.4 Các phương pháp phân tích kim loại nặng 3.4.1 Phương pháp quang phổ khối plasma cảm ứng (ICP-MS) Thuật ngữ ICP (Inductively Coupled Plasma) dùng để lửa plasma tạo thành dòng điện có tần số cao (cỡ MHz) cung cấp máy phát Radio Frequency Power (RFP) Ngọn lửa plasma có nhiệt độ cao có tác dụng chuyển nguyên tố mẫu cần phân tích thành dạng ion MS (Mass Spectrometry) phép ghi phổ theo số khối hay xác theo tỉ số số khối điện tích (m/z) Từ xuất plasma cảm ứng với tính ưu điểm vận hành hẳn nguồn hồ quang tia điện cơng cụ dần phát triển thành tổ hợp ICP ghép với khối phổ kế Hai ưu điểm bật ICP – MS có độ phân giải cao dễ tách nhiễu ảnh hưởng lẫn phát hầu hết nguyên tố bảng tuần hồn Phương pháp phân tích dựa nguyên tắc bay hơi, phân tách, ion hóa nguyên tố hóa học chúng đưa vào mơi trường plasma có nhiệt độ cao Sau ion phân tách khỏi nhay theo tỷ số khối lượng/ điện tích (m/z) chúng, thiết bị phân tích khối lượng có từ tính độ phân giải cao phát hiện, khếch đại tín hiệu đếm thiết bị điện tử kĩ thuật số Phương pháp ICP – MS đời vào năm 80 kỉ trước ngày chứng tỏ kĩ thuật phân tích có ưu điểm vượt trội so với kĩ thuật phân tích khác như: quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), quang phổ phát xạ plasma cảm ứng (ICP-AES hay ICP-OES)… Phương pháp ICP-MS hẳn kĩ thuật phân tích kim loại nặng khác điểm sau: có độ nhạy cao, độ lặp lại cao, xác định đồng thời hàng loạt kim loại thời gian phân tích ngắn [6] *Ưu điểm phương pháp phân tích ICP-MS Phép đo phổ ICP-MS kỹ thuật mới, đời cách không lâu phát triển nhanh sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác như: trình sản xuất nhiên liệu hạt nhân, xác định đồng vị phóng xạ, nước làm lạnh sơ cấp ngành hạt nhân (chiếm tỉ trọng 5%), phân tích nguồn nước, nước biển, nước bề mặt, đất, bùn, đất ho hoang, phân tích định dạng Hg, As, Pb Sn nghiên cứu bảo vệ môi trường (48%), q trình hóa học, chất nhiễm bẩn Si Wafers công nghiệp sản xuất chất bán dẫn (33%), máu, tóc, huyết thanh, nước tiểu, mơ y tế (6%), đất đá, trầm tích, nghiên cứu đồng vị phóng xạ địa chất (2%), hóa chất (4%), dấu vết đạn, đặc trưng vật liệu, nguồn gốc, chất độc khoa học hình (1%) phân tích thực phẩm (1%)… 3.4.2 Phương pháp Vơn-ampe hịa tan 3.4.2.1 Ngun tắc chung phương pháp von-ampe hồ tan Q trình phân tích theo phương pháp von-ampe hoà tan gồm giai đoạn: giai đoạn làm giàu giai đoạn hoà tan Giai đoạn làm giàu: Chất phân tích tập trung lên bề mặt điện cực (dưới dạng kim loại hợp chất khó tan) Điện cực làm việc thường điện cực giọt thuỷ ngân treo (HMDE), cực đĩa quay vật liệu trơ (than thuỷ tinh, than nhão tinh khiết) cực màng thuỷ ngân bề mặt cực rắn trơ (MFE),hoặc điện cực mằng Bismut điện cực paste cacbon Giai đoạn hồ tan: Hồ tan chất phân tích khỏi bề mặt điện cực làm việc cách quét theo chiều xác định (anot catot) đồng thời ghi đường von-ampe hoà tan kĩ thuật điện hố Nếu q trình hồ tan trình anot, lúc phương pháp gọi von-ampe hoà tan anot (ASV) ngược lại q trình hồ tan q trình catot phương pháp gọi von-ampe hoà tan catot (CSV) Đường von-ampe hồ tan thu có dạng peak Thế đỉnh (Ep) cường độ dịng hồ tan (Ip) phụ thuộc vào yếu tố như: điện ly, pH, chất tạo phức, chất điện cực làm việc, kỹ thuật ghi đường von-ampe hoà tan Trong điều kiện xác định, Ep đặc trưng cho chất điện hoá chất phân tích dựa vào Ep phân tích định tính Ip tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích dung dịch theo phương trình: Ip=K.C Trong k hệ số tỷ lệ Như qua việc đo cường độ dòng hòa tan ta xác định nồng độ chất phân tích 3.4.2.2 Phương pháp phân tích vơn-ampe hịa tan định lượng Gồm có phương pháp đường chuẩn phương pháp thêm tiến hành phương pháp phân tích cực phổ 3.4.2.3 Ứng dụng phương pháp Phương pháp có khr xác định nhiều kim loại có nồng độ nhỏ, nồng độ thường xác định 10-6 đến 10-8 mol/l, với sai số - 15% nững điều kiện tối ưu *Ưu điểm: - Có khả xác định đồng thời nhiều kim loại nồng độ cỡ vết siêu vết - Thiết bị nhỏ gọn, giá thành rẻ, dễ thiết kế để nối với thiết bị phân tích khác - Có quy trình phân tích đơn giản 3.4.3 Phương pháp phân tích đo điện 3.4.3.1 Cơ sở phương pháp Phương pháp phân tích đo điện phương pháp xác định nồng độ ion dựa vào thay đổi điện cực nhúng vào dung dịch phân tích Phương pháp dựa phương trình Nerst với việc mô tả mối quan hệ điện cực với họt độ cấu tử hay nồng độ cấu tử hệ oxy hóa khử thuận nghịch RT a axh RT oxh  oxh E x  E0  ln  E0  ln nF a kh nF kh  kh Trong đó: E0 điện oxy hóa khử tiêu chuẩn hệ R số khí lý tưởng T nhiệt độ tuyệt đối F số Faraday aoxh, akh hoạt độ dạng oxy hóa dạng khử γoxh, γkh hoạt độ dạng oxy hóa dạng khử [oxh], [kh] nồng độ dạng oxy hóa dạng khử 3.4.3.2 Các phương pháp phân tích đo điện a) Phương pháp đo điện cực Ta ghép điên cực thị với điện cực so sánh chọn trước tạo thành pin galvanic, sau đo sức điện động pin galvanic tạo thành b) Phương pháp chuẩn độ diện Ta nhúng điện cực điện cực thay đổi theo thành phần nghiên cứu, tiến hành định phân chất nghiên cứu dung dịch dung dịch chuẩn Trong q trình định phân nồng độ ion nghiên cứu thay đổi đưa đến thay đổi điện dung dịch Lúc đầu thay đổi điện không lớn, điểm gần tương đương, điện đo Ex thay đổi đột ngột Sự thay đổi Ex trình định phân biểu diễn dạng đồ thị E – V Nhờ ta xác định điểm tương đương Nguy ên tố Ag Đối tượng PP phân Điện Dd mềm tích cực làm việc Quặng kẽm VAHT-A - Chì tinh khiết, chì tái VAHT-A Tm Pt NH4Cl + HNO3 0,1M Độ nhạy NH4OH ppm ppm sinh VAHT-A Tm KCNS - Dung dịch điện cực bạc clorua As - Nước tự nhiên VAHT-C Tóc, máu VAHT-C Nước tiểu ĐTHT-A Thịt hộp,HNO3, H3PO4Zn, S - NaCl, ZnCl2 Hg tĩnh Hg tĩnh Tm HCl 1M + KI 0,2M + 0,01 ppm CuCl2+ 5.10-4M 0,01 ppm nt HCl 1M + CuCl2 5.10-6M + AuCl35.10-8M Au - Quặng VAHT-A Tm HCl 2M; Kbr 1M + 0,01 NaH2PO4 0,5M + NaF 0,5 M(pH ~ 3) Bi -Quặng molipden CBSV Giọt Hg HCL 1M 10ppm Cd -Nước - Tm TT TT Giọt Hg NH4CL 1M + NH4OH 0,5M NACL 1M(PH~2);NACH3COO 5,510m/l 0,01 ppm ppm 10 ppm tự -Kẽm tinh -Quặng kẽm nhiên VAHT-2 VAHT.A VAHT.A khiết CP (pH = H2SO4 0,5 (NH4)2SO4 0,5 NH4OH 4M 4,5) M M + Co Thép,Ni kim loại,quặng CPSV mangan, đất CP trồng trọt, bột tan, phấn hoa Giọt Hg Giọt Hg DMG10-4M + TA0, 15M 1- 10ppm + NaH2PO4 1M (pH~9) Cu -Gỗ -Kẽm Giọt Hg TT TT TT NH4CL 1M + NH4O4 4M H2SO4 0,3M HCL 0,1M; NACL 1M(pH~2) NACH3COO(Ph=4.5) -nt- CPSV CPX-2 Giọt Hg NHCL 0,5M+NHOH 10 ppm 0,5M+ KCN 0,2M biển CP CPBV Giọt Hg Giọt Hg KOH 1M + TA 0,2M 100 ppm NAOH 5M + TA0,1M 10 ppmM Tm,TT TM,TT NH4CL KCNS -nt- tinh Nước tự Lưu huỳnh Cr -Thép quặng cromit Fe -Tro rong -Thiếc tinh khiết Hg Cp khiết VAHT-A VAHT-A nhiên VAHT-A -Thịt, tinh dầu VAHT.A -Dung dịch điện VAHT.A cực calomen 3.4.4 Phương pháp Rơnghen 3.4.4.1 Nguyên tắc + 10 ppm 0,01ppm 0,001 ppm 0,1 ppm NH4OH; 0,2 ppm 1M Dựa vào tỷ lệ cường độ vạch Rơnghen dặc trưng với nồng độ nguyên tố nghiên cứu mẫu Tuy nhiên phụ thuộc cường độ vạch phổ pghoor Rownghen phức tạp nhiều so với phổ phát xạ, nên người ta dùng phương pháp phương pháp đo so sánh Trong phương pháp nội chuẩn, người ta so sanhs cường độ vạch nguyên tố nghien cứu với nguyên tố chọn làm chuẩn, chất chuẩn đưa vào mẫu với nồng đọ biết xác Vạch so sánh cần kích thích gần với kế kích thích vạch nghiên cứu, nghĩa chúng có dộ dài sóng gần nhau, khơng q gần để có thẻ ảnh hưởng đến việc đo cường độ vạch Tỉ lệ cường độ vach nguyên tố xác định vạch chất chuẩn tuân theo hệ thức I nc C  K nc I ch C ch Trong đó: Inc, Ich – cường độ vạch nghiên cứu vạch chuẩn Cnc, Cch – nồng độ nghiên cứu nồng độ chất chuẩn có mẫu K- hệ số xác định thực nghiêm Tỉ lệ cường độ vạch tỉ số nồng độ nghien cứu mẫu nghiên cứu mẫu chuẩn 3.4.4.2 Ứng dụng Có phạm vi ứng dụng rộng rãi nhiều ngành khoa học, kỹ thuật, hoạt động kinh tết, cơng nghiệp Áp dụng để phân tích đối tượng thuộc ngành địa chất, mỏ, xác ddonhj thành phần khoáng vật, nguyên liệu cho ngành luyên kim Phương pháp ứng dụng có hiệu để xác định chat bẩn sản phẩm môi trường -Ưu điểm: +Phân tích chất có nồng đọ lớn (hàng chục %) đến tạp chất có nồng độ bé (10-2 - 10-3) +Sai số trung bình bé – 5%, điều kiện tốt sai số bé 0.5% +Đây phương pháp dễ tự động hóa +Khơng cần phân hủy mẫu phân tích -Nhược điểm: có độ nhạy khơng cao 3.4.5 Phương pháp phân tích trắc quang 3.4.5.1 Cơ sở Dùng để xác định hàm lượng chất phân tích theo độ hấp thụ ánh sáng dựa sở chuyển lượng kích thích hệ electron thành chuyển động nhiệt Theo phương pháp cấu tử cần định lượng chuyển thành hợp chất hấp thụ ánh sáng để suy hàm lượng chất cần xác định Hợp chất hấp thụ ánh sáng tốt hợp chất có màu chất có màu chất có khả hấp thụ chọn lọc vùng ánh sáng định (vùng khả kiến) Để có hợp chất có màu, chất cần phân tích cho tác dụng với thuốc thử thích hợp hay hợp chất hấp thụ ánh sáng thích hợp Nếu tạo hợp chất khơng tan dung mơi sử dụng để hòa tan kết tủa chiết tách Qúa trình đo hấp thụ dựa sở hấp thj ánh sáng tuân theo định luật Bouguer – Lambert – Beer A = lg (I0/I) = .l.C Trong đó: I0, I cường độ chùm sáng trước sau mẫu nghiên cứu (erc.cm2/sec) ε hệ số tắt phân tử (cm2.mmol-1) l độ dày lớp vật chất mà ánh sáng truyền qua (cm) C nồng độ chất nghiên cứu (mol/l) Dựa vào việc xác định cường độ I0, I ta suy nồng độ chất nghiên cứu 3.4.5.2 Các phương pháp phân tích định lương trắc quang a) Phương pháp dãy tiêu chuẩn Dựa sở: nguyên tố cần xác định có khả tạo màu màu thay đổi theo lương nguyên tố b) Phương pháp chuẩn độ điện tử Lấy cốc so màu, để dung dịch nghiên cứu vào cốc 1, chế hóa với thuốc thử pH cần thiết để chuyển cấu tử cần định lượng X thành hợp chất màu Cốc chưa lượng thuốc thử chất (muối, axit, ) cốc Pha lỗng để thể tích cốc Sau vừa khuấy vừa cho dung dịch tiêu chuẩn cấu tử cần phân tích đến màu cốc Từ suy hàm lượng cấu tử cần xác định thông qua thể tích mẫu chuẩn dùng Phương pháp dùng cho phản ứng tạo phức màu tức thời ự tạo màu không gắn với q trình hóa học phụ c) Phương pháp đừng chuẩn Ta cần pha ột dãy dung dịch chuẩn gồm có dung dịch chất nghiên cứu có hàm luowngc chất nghiên cứu xác định, lượng chất thử, pH, muối Định mức đến thể tích định Sau tiến hành đo mật độ quang A mẫu từ tiến hành vẽ đồ thị lien hệ A C ta đường chuẩn Tiến hành pha chế dung dịch cần phân tích từ đường chuẩn ta suy nòng độ chất cần nghiên cứu -Ưu điểm: xác định hàng loạt mẫu nhanh, kinh tế kết xác -Nhước điểm: kết phụ thuộc vào độ xác máy hấp thụ ánh sáng dung dịch tuân theo định luật Beer 3.4.6 Phương pháp đo phổ UV- VIS 3.4.6.1.Nguyên tắc phương pháp Nguyên tắc phương pháp chiếu vào cuvet có bề dày định chưa dung dịch mẫu hợp chất cần phân tích hấp thụ xạ λ tạo phổ hấp thụ UV-VIS 3.4.6.2 Phân tích định lượng theo phổ UV-VIS a) Phương pháp định lượng đơn giản Phương pháp dựa sở, nguyên tố cần xác định có khả tạo màu màu thay đổi theo lượng nguyên tố Phương pháp đơn giản không cần máy đo phổ cho nồng độ gần giống chất phân tích, độ xác khơng cao phụ thuộc vào khả quan sát so sánh mắt người Phương pháp áp dụng cho chất tạo phức có màu rõ bền mẫu thời gian định b) Phương pháp dựa vào đường chuẩn Dựa vào phương trình sở phép đo định lượng theo phổ hấp thụ phân tử UV-VIS : Aλ = k.Cxb Trong đó: Aλ độ hấp thụ quang cảu chất đo phổ cuvet Cx nồng độ chất dung dịch mẫu cuvet k hệ số thực nghiêm phụ thuộc vào hệ số hấp phụ phân tử ε chất b b số phụ thuộc vào chất chất Ở cần ý mẫu phải có điều kiện với mẫu phân tích chất môi trường pH,… -Ưu điểm: thuận tiện cho hàng loạt mẫu chất loạt đối tượng mẫu, nhanh chóng, hiệu suất cao -Nhược điểm: với hàm lượng nhỏ thành phần hóa học phức tạp nhieeud trường hợp khơng thể pha chế dãy màu chuẩn phù hợp với mẫu phân tích 3.4.7 Phương pháp khác xác định kim loại nặng Ngoài phương pháp ICP-MS, nhiều phương pháp khác phương pháp trọng lượng, chuẩn độ, phương pháp điện hóa, trắc quang, quang phổ hấp thụ nguyên tử (F-AAS, GF-AAS, CV-AAS), huỳnh quang tia X (XRF), kích hoạt nơtron (NAA), quang phổ phát xạ plasma cảm ứng (ICP-AES)… Các phương pháp sử dụng tùy thuộc theo đối tượng mẫu phân tích, hàm lượng kim loại nặng mẫu, điều kiện cụ thể phịng thí nghiệm, yêu cầu độ xác kết phân tích Phương pháp huỳnh quang Một chất hấp thụ lượng giới hạn làm kích thích hệ electron phân tử Khi trạng thái kích thích, phân tử tồn 10  s , trở trạng thái ban đầu giải phóng lượng hấp thụ Khi lượng giải tỏa phát dạng ánh sáng gọi tượng phát quang Hóa học phân tích sử dụng tượng để định tính định lượng chất gọi phương pháp phân tích huỳnh quang Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) Phương pháp AAS viết tắt từ phương pháp phổ hấp thu nguyên tử (Atomic Absorption Spectrophotometric) Các nguyên tử trạng thái bình thường chúng khơng hấp thụ hay phát xạ lượng chúng trạng thái tự dạng đám nguyên tử chúng hấp thụ hay xạ lượng Mỗi nguyên tử hấp thu xạ định tưng ứng với xạ mà chúng phát trình phát xạ chúng Khi nguyên tử nhận lượng chúng chuyển lên mức lượng cao gọi trạng thái kích thích Q trình gọi trình hấp thu lượng nguyên tử tự trạng thái tạo phổ ngun tử Phổ sinh q trình gọi phổ hấp thu nguyên tử Tức chiếu chùm tia sáng có bước sóng xác định ứng với tia phát xạ nhạy nguyên tố cần xác định vào đám nguyên tử tự nguyên tử tự hấp thụ lượng tia chiếu vào tạo phổ hấp thụ nguyên tử Đo phổ ta xác định nguyên tố cần phân tích Trong phương pháp q trình chuyển hóa chất thành (nguyên tử hóa mẫu) quan trọng Tùy thuộc vào kĩ thuật nguyên tử hóa mà ta có phương pháp với độ nhạy khác Đây phương pháp sử dụng phổ biến để phân tích kim loại nặng Hầu hết kim loại nặng xác định kĩ thuật Có thể xác định trực tiếp kim loại kĩ thuật lửa (F-AAS) không kỹ thuật nguyên tử khơng lửa dùng lị graphit (GF-AAS) cho phép xác định định kim loại nặng với giới hạn phát cỡ ppb hay nhỏ Kỹ thuật hấp thụ nguyên tử hóa lạnh (CV-AAS) sử dụng hệ hydrua hóa cho phép xác định nguyên tố có khả tạo hợp chất hydrua với độ chọn lọc, độ nhạy cao Phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử (AES) Trong điều kiện bình thường, ngun tử khơng thu không phát lượng, cung cấp lượng cho nguyên tử nguyên tử chuyển lên trạng thái kích thích Trạng thái không bền, nguyên tử tồn thời gian cực ngắn 10  s , chúng có xu hướng trở trạng thái ban đầu bền vững giải phóng lượng mà hấp thu dạng xạ quang học Bức xạ phổ phát xạ nguyên tử Các nguồn kích thích phổ phát xạ lửa đèn khí, hồ quang điện dòng xoay chiều chiều, tia lửa điện, plasma cảm ứng Nhìn chung phương pháp có độ nhạy cao, tốn mẫu, có khả phân tích đồng thời nhiều nguyên tố mẫu nên thuận lợi để phân tích lượng vết kim loại độc đối tượng khác KẾT LUẬN Qua q trình tìm hiểu, thảo luận chúng tơi thu số kết sau: - Đề cương nghiên cứu bước đầu xây dựng quy trình chiết tách enzyme - Nêu nguyên lý cảm biến áp dụng phân tích - Nêu ứng dụng enzyme phân tích kim loại nặng TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Trần Đình Toại, Đỗ Ngọc Lanh, Mai Hữu Tuyên, Nguyễn Thị Vân Hải, Nguyễn Thu Hoài, 1998, Nghiên cứu phương pháp sinh học sử dụng enzyme để đánh giá môi trường bị nhiễm kim loại nặng, Tuyển tập báo cáo khoa học – Trung tâm nhiệt đới Việt – Nga, – sinh thái nhiệt đới công nghệ sinh học, 1998, tr 155 – 167 [2] Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải, Động học trình xúc tác sinh học, NXB Khoa học kĩ thuật, Hà Nội, 2002 [3]file:///D:/ENZYME/Bai%20giang%20Cong%20nghe%20enzyme.pdf.http://luanvan.net.vn/luanvan/thu-nhan-va-tinh-che-enzyme-49882/ (tách tinh chế enzyme) [4] http://d.violet.vn/uploads/resources/562/653371/preview.swf (khái niệm enzyme) [5] http://123doc.vn/document/207847-tien-hanh-nghien-cuu-cac-quy-trinh-xu-ly-mau-sinh-vat-chithi-tim-ra-quy-trinh-xu-ly-mau-tot-nhat-ung-dung-cho-viec-phan-tich-xac-dinh-tong-hamluong-.htm?page=6) (ĐỘC TÍNH KIM LOẠI NẶNG + CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KIM LOẠI NẶNG) [6] Phạm Luận (1998), “Cơ sở lý thuyết phương pháp phân tích phổ khối lượng nguyên tử phép đo ICP-MS” [7] Lâm Minh Triết Diệp Ngọc Sương (2000), Các phương pháp phân tích kim loại nước nước thải Nhà xuất KH & KT, TP Hồ Chí Minh [8] Trần Tứ Hiếu (1999), Phân tích quang trắc Trường đại học khoa học – tự nhiên, Hà Nội [9] Phạm Luận (1996), Cơ sở lí thuyết phép đo phổ hấp thụ phân tử UV-VIS, Trường đại học khoa học – tự nhiên, Hà Nội [10] Nguyễn Việt Huyến (1999), Cơ sở phương pháp phân tích điện hóa, Trường đại học khoa học - tự nhiên, Hà Nội [11] http://luanvan.net.vn/luan-van/thu-nhan-va-tinh-che-enzyme-49882/ [12] file:///D:/ENZYME/Bai%20giang%20Cong%20nghe%20enzyme.pdf ... nguyên tố mẫu nên thuận lợi để phân tích lượng vết kim loại độc đối tượng khác KẾT LUẬN Qua trình tìm hiểu, thảo luận chúng tơi thu số kết sau: - Đề cương nghiên cứu bước đầu xây dựng quy trình... đổi ion + Sắc kí lực 1.5.5.5 Tạo sản phẩm enzyme Sau làm sạch, người ta tiến hành thực giai đoạn cuối tạo sản phẩm, đóng bao Chế phẩm enzyme tạo thành loại sản phẩm sau: enzyme dạng dung dịch,... diện phận khỏe mạnh; (2) Xuất tế bào sinh ra; (3) Có cân tự nhiên máu; (4) Điều khiển trình tiết; (5) Biết chức sinh học Như vậy, hầu kết kim loại nặng kim loại vết số số ta biết chức sinh học,