BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đinh Thị Thu Lê NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN ĐỂ CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG VIRUS PVY Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGH[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đinh Thị Thu Lê NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN ĐỂ CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG VIRUS PVY Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đinh Thị Thu Lê NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN ĐỂ CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG VIRUS PVY Ở VIỆT NAM Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS HỒNG ĐÌNH HỊA GS TS NGUYỄN QUANG THẠCH Hà Nội - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học GS.TS Hồng Đình Hịa GS.TS Nguyễn Quang Thạch Các số liệu, kết nêu luận án trung thực, chưa tác giả công bố cơng trình khác Hà Nội, ngày ……… tháng …… năm 2020 Tác giả luận án Đinh Thị Thu Lê i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án tiến sĩ, em nhận giúp đỡ động viên thày, cô tập thể Lời đầu tiên, cho phép em bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Hồng Đình Hịa – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, GS.TS Nguyễn Quang Thạch – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, người thày trực tiếp hưỡng dẫn, định hướng tận tình giúp đỡ em suốt trình thực luận án Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thày, cô môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội dạy dỗ, động viên giúp đỡ em nhiều thời gian nghiên cứu sinh môn Em xin gửi lời cảm ơn đến thày, cô, anh chị bạn Đỗ Thị Thu Hà, Vũ Thị Hằng – Phịng Cơng nghệ phân tử & Công nghệ Vi sinh, Viện Sinh học Nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam ln nhiệt tình giúp đỡ sát cánh bên em trình thực luận án đơn vị Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quan chủ quản – Trường Đại học Mở Hà Nội, khoa Công nghệ Sinh học bố trí thời gian, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Cuối cùng, tơi xin cảm ơn chân thành tới gia đình bạn bè ln động viên tinh thần, khích lệ lúc khó khan để tơi vượt qua hoàn thành luận án Hà Nội, ngày …… tháng … năm 2020 Đinh Thị Thu Lê ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ix MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung khoai tây 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Tình hình sản xuất khoai tây giới Việt Nam 1.2 Giới thiệu khoai tây chế biến chip 1.3 Tìm hiểu virus hại khoai tây 10 1.3.1 Giới thiệu chung 10 1.3.2 Giới thiệu PVY 12 1.3.3 Tác hại PVY đến sản xuất khoai tây 14 1.4 Các hướng nghiên cứu khắc phục bệnh virus hại khoai tây 15 1.4.1 Xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây bệnh 15 1.4.2 Thanh lọc vệ sinh đồng ruộng, nhổ bỏ nhiễm virus 19 1.4.3 Chọn tạo giống kháng bệnh virus 20 1.5 Phương pháp chọn tạo giống khoai tây kháng virus 20 1.5.1 Phương pháp chọn tạo giống truyền thống 21 1.5.2 Phương pháp công nghệ sinh học 22 Chương VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51 2.1 Vật liệu nghiên cứu 51 2.1.1 Các dòng khoai tây nghiên cứu 51 2.1.2 Hóa chất 53 2.1.3 Thiết bị 53 2.2 Nội dung nghiên cứu 54 2.2.1 Nội dung 1: Xác định thông số tối ưu cho quy trình dung hợp khoai tây từ nguyên liệu nhị bội (2n = 2x), tứ bội (2n = 4x) khoai tây dại (pnt2G, trn3G, blb2G) 54 2.2.2 Nội dung 2: Xác định đánh giá thể lai soma tổ hợp dung hợp khoai tây nhị bội (2n = 2x) 56 iii 2.2.3 Nội dung 3: Xác định thể lai soma tổ hợp dung hợp khoai tây dại (2n = 2x) khoai tây trồng (2n = 4x) Đánh giá khả kháng PVY chúng 56 2.2.4 Nội dung 4: Đánh giá lai backcross (BC1) thể lai soma (khoai tây dại khoai tây trồng) với khoai tây trồng 56 2.3 Phương pháp nghiên cứu 58 2.3.1 Tách tế bào trần 58 2.3.2 Dung hợp tế bào trần 59 2.3.3 Xác định lai đếm độ bội flow cytometry 60 2.3.4 Chiết tách DNA tổng số 60 2.3.5 Xác định lai sinh học phân tử 61 2.3.6 Lây nhiễm nhân tạo PVY 62 2.3.7 Kiểm tra gen kháng PVY lai soma thị phân tử 62 2.3.8 Đánh giá đặc tính nơng sinh học 63 2.3.9 Phân tích tiêu hóa sinh 63 2.3.10 Lai lại (backcross) số tổ hợp khoai tây có triển vọng với khoai tây trồng 65 2.3.11 Các tiêu theo dõi 65 2.3.12 Xử lý số liệu 67 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 3.1 Xác định thông số tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại khoai tây trồng 68 3.1.1 Nghiên cứu thơng số tách tế bào trần dịng khoai tây nhị bội, khoai tây dại, khoai tây trồng phục vụ cho dung hợp tế bào trần 68 3.1.2 Xác định thông số dung hợp tế bào trần 73 3.1.3 Nuôi cấy tái sinh tổ hợp lai sau dung hợp 79 3.2 Xác định đánh giá thể lai soma tổ hợp dung hợp khoai tây nhị bội (2n = 2x) 82 3.2.1 Tạo lai 82 3.2.2 Xác định độ bội thể tái sinh 83 3.2.3 Xác định lai soma đo thị phân tử 85 3.2.4 Đánh giá phẩm chất củ lai soma điều kiện chậu vại 88 3.2.5 Kiểm tra có mặt gen kháng lai soma từ vật liệu nhị bội 90 3.3 Xác định thể lai soma tổ hợp dung hợp khoai tây dại (2n=2x) khoai tây trồng (2n = 4x) Đánh giá khả kháng virus PVY chúng 92 3.3.1 Xác định lai soma khoai tây dại khoai tây trồng đo độ bội thể 93 iv 3.3.2 Xác định lai soma khoai tây dại khai tây thị phân tử 94 3.3.3 Kiểm tra có mặt gen kháng PVY lai soma khoai tây dại khoai tây trồng 95 3.3.4 Đánh giá khả kháng PVY lai soma khoai tây dại khoai tây trồng lây nhiễm nhân tạo 97 3.3.5 Đánh giá lai soma khoai tây dại khoai tây trồng tính trạng nơng sinh học phẩm chất củ 98 3.4 Đánh giá lai backcross (BC1) thể lai soma (khoai tây dại khoai tây trồng) với khoai tây trồng 104 3.4.1 Lai hữu tính lai soma (của khoai tây dại khoai tây trồng) với giống khoai tây trồng chọn lọc lai có đặc tính mong muốn 104 3.4.2 Đánh giá khả kháng PVY lai BC1 triển vọng đồng ruộng kiểm gia có mặt gen kháng PVY thị phân tử 113 3.4.3 Khảo sát diện hẹp dòng lai BC1 triển vọng đồng ruộng 114 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 125 4.1 Kết luận 125 4.2 Đề nghị 125 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 127 CỦA LUẬN ÁN 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO 128 PHỤ LỤC 139 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BA - benzyl amino purine BC1 Backcross CNSH Công nghệ sinh học CT Công thức DAS – ELISA Double Antibody Sandwich – Enzyme linked imunosorbent assay DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme – linked imunosorbent assay FAO Food and Agriculture Organization GA3 Gibberellic Acid IAA Indole-3-acetic acid KLCTB Khối lượng củ trung bình LSD Least significant difference MS Murashige and Skoog NAA Naphthaleneacetic acid NSLT Năng suất lý thuyết NSTT Năng suất thực thu NST Nhiễm sắc thể OD Optical density PCR Polymerase chain reaction PEG Polyethylene glycol PVY Potato virus Y SSR Simple sequence repeat TB Tế bào vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Mười lăm quốc gia sản xuất khoai tây nhiều giới năm 2019 Bảng 1.2 Diện tích, suất sản lượng khoai tây Việt Nam Bảng 1.3 Hệ thống sản xuất cấp giống khoai tây đồng ruộng Canada 16 Bảng 1.4 Tiêu chuẩn ruộng giống khoai tây Việt Nam 18 Bảng 1.5 Thời gian chọn tạo giống khoai tây theo phương pháp truyền thồng 22 Bảng 1.6 Tóm tắt kết q trình chọn tạo giống khoai tây thơng qua dung hợp protoplast lồi Solanum (1985 - 2016) 31 Bảng 2.1 Các vật liệu thu thập, nguồn gốc, độ bội tính trạng mong muốn phục vụ cho lai soma 51 Bảng 2.2 Trình tự nhiệt độ gắn mồi sử dụng phân tích PCR chọn lọc lai soma khoai tây dại khoai tây trồng 61 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ macerozyme cellulase dung dịch enzyme đến mật độ tế bào trần dòng khoai tây nhị bội (Tế bào trần /ml môi trường) 68 Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian ủ mẫu dung dịch enzyme đến mật độ tế bào trần thu 71 Bảng 3.3 Ảnh hưởng tuổi in vitro đến mật độ tế bào trần thu từ mẫu 72 Bảng 3.4 Ảnh hưởng tần số dung hợp số lần tạo xung điện đến khả tạo mô sẹo tổ hợp B186 (+) B208 tổ hợp trn3G (+) Delikat 73 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ Ca2+ đến khả kết dính thành hàng tế bào q trình dung hợp (tế bào/hàng) khả tế bào phân chia sau dung hợp.75 Bảng 3.6 Ảnh hưởng mật độ protoplast đến kết dung hợp xung điện tổ hợp nhị bội B186 (+) B208 77 Bảng 3.7 Ảnh hưởng mật độ protoplast đến kết dung hợp xung điện tổ hợp khoai tây dại khoai tây trồng Trn3G (+) Delikat 78 Bảng 3.8 Sự phân chia tổ hợp lai nhị bội tổ hợp lai khoai tây dại khoai tây trồng môi trường nuôi cấy khác 79 Bảng 3.9 Ảnh hưởng môi trường tái sinh khác đến khả tạo chồi tổ hợp lai 81 Bảng 3.10 Kết dung hợp, nuôi cấy tái sinh tổ hợp lai nhị bội sau dung hợp 83 Bảng 3.11 Kết xác định độ bội lai sau dung hợp 83 vii Bảng 3.12 Kết xác định lai soma tổ hợp dung hợp 85 Bảng 3.13 Một số tiêu hóa sinh dịng lai soma khoai tây dòng nguyên liệu 89 Bảng 3.14 Kết nuôi cấy tái sinh chồi tổ hợp lai khoai tây dại khoai tây trồng sau dung hợp 93 Bảng 3.15 Kết tái sinh phân tích độ bội thể tổ hợp lai khoai tây dại khoai tây trồng sau dung hợp 93 Bảng 3.16 Kết sử dụng marker phân tử xác định lai soma 95 Bảng 3.17: Kết mức độ kháng bệnh lai soma 4x sau lây nhiễm nhân tạo 97 Bảng 3.18 Đánh giá đặc tính nơng sinh học lai soma điều kiện chậu vại 101 Bảng 3.19 Kết lai hữu tính lai soma khoai tây trồng tứ bội 104 Bảng 3.20 Khả nảy mầm hạt lai BC1 105 Bảng 3.21 Đánh giá khả kháng bệnh virus lai BC1 giai đoạn 106 Bảng 3.22 Bảng đánh giá hình thái kiểu sinh trưởng lai BC1 107 Bảng 3.23 Bảng đánh giá suất hình thái củ lai BC1 108 Bảng 3.24 Tình hình sinh trưởng, phát triển vật liệu khảo sát sau 60 ngày trồng 110 Bảng 3.25 Các yếu tố cấu thành suất dịng/giống khoai tây khảo sát 111 Bảng 3.26 Đặc tính nơng sinh học dịng/giống khoai tây khảo sát điều kiện đồng ruộng 115 Bảng 3.27 Thời gian sinh trưởng qua giai đoạn dòng/giống khoai tây 117 Bảng 3.28 Kết đánh giá tình hình sinh trưởng, phát triển lai BC1 giống khoai tây trồng vụ đông xuân 2017-2018 118 Bảng 3.29 Các yếu tố cấu thành suất dòng/giống khoai tây khảo sát 119 Bảng 3.30 Đặc điểm hình thái củ khoai tây dịng/giống khảo sát 120 Bảng 3.31 Đánh giá cảm quan chất lượng củ qua ăn nếm dòng/giống khoai tây 121 Bảng 3.32 Đánh giá hàm lượng chất khơ dịng/ giống khoai tây 122 viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống sản xuất khoai tây giống Viện Sinh học Nông nghiệp 19 Hình 1.2 Sơ đồ lai khoai tây 23 Hình 1.3 Cơ chế làm câm gene nhờ RNAi 47 Hình 1.4 Sử dụng chuyển gen amiRNA để tạo kháng virus 48 Hình 2.1 Các loài khoai khoai tây dại nhị bội thu thập từ CHLB Đức 53 Hình 3.1 Hình ảnh tế bào trần dòng khoai tây khác với enzyme phù hợp 70 Hình 3.2 Chất lượng tế bào sau dung hợp hình thành macrocallus tần số lần xung khác 74 Hình 3.3 Hình ảnh tế bào phân tạo hàng dung dịch dung hợp dung hợp có nồng độ Ca2+ khác trình dung hợp tổ hợp B186 (+) B208 76 Hình 3.4 Hình ảnh phân chia tế bào sau ngày nuôi cấy 79 Hình 3.5 Dung hợp nuôi cấy tổ hợp lai sau dung hợp 82 Hình 3.6 Hình ảnh độ bội dòng khoai tây “bố mẹ” lai 84 Hình 3.7 Xác đinh lai soma tổ hợp A15 (+) A56 với cặp mồi STM 3023 86 Hình 3.8 Xác định lai soma tổ hợp B186 (+) B208 với cặp mồi STM 3023 87 Hình 3.9 Sự khác số lượng kích thước củ số dịng lai soma sau 88 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu GP 122406 liên kết chặt với gen Rysto bố mẹ nhị bội lai soma 91 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR cắt với enzym cắt giới hạn EcoRV 92 Hình 3.12 Hình ảnh độ bội thể dòng khoai tây “bố mẹ” lai 94 Hình 3.13 Minh họa kết điện di cho phân tích thị phân tử STM2022 để xác định kiểu gen dị hợp nhân tổ hợp lai trn 3G (+) Rasant 94 Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi GP 122406 ADN lai soma dòng bố mẹ khoai tây dại khoai tây trồng 96 Hình 3.15 Kết điện di kiểm tra gen kháng virus PVY dòng lai soma dòng bố mẹ khoai tây dại khoai tây trồng 96 Hình 3.16 Đánh giá đặc tính nơng sinh học lai soma dịng bố mẹ 98 Hình 3.17 Đánh giá tính trạng suất phẩm chất củ lai soma dòng bố mẹ: A- Atlantic; B- 254/1; C- pnt2G 98 ix Hình 3.18 Các biến dị lai soma 99 Hình 3.19 Hạt nảy mầm đến giai đoạn thật hạt lai BC1 106 Hình 3.20 Kết điện di kiểm tra gen kháng virus PVY chạy cặp mồi GP 122406 113 Hình 3.21 Kết điện di kiểm tra gen kháng virus PVY sau cắt enzyme giới hạn EcoRV 113 Hình 3.22 Màu sắc vỏ củ, thịt củ dịng/giống khảo sát 121 x MỞ ĐẦU Khoai tây (Solanum tuberosum L.) trồng quan trọng chương trình an ninh lương thực giới sau ngô, lúa mỳ gạo Theo thống kê tổ chức Nông lương giới (FAOSTAT, 2019), diện tích khoai tây giới năm 2017 đạt 19,30 triệu ha, suất trung bình đạt 20,11 tấn/ha, với tổng sản lượng 388,2 triệu Trong đó, diện tích khoai tây châu Âu chiếm 29,1% sản lượng chiếm 31,9%; diện tích châu Á chiếm 51,9% sản lượng chiếm 48,8% (FAOSTAT, 2016) Tại Việt Nam, khoai tây trồng lý tưởng cho vụ Đông Đồng Sơng Hồng, nhiên diện tích trồng nước 20.480 với suất 14,8 tấn/ha, sản lượng 303 nghìn (FAOSAT, 2017) Có nhiều nguyên nhân mặt kinh tế lẫn kỹ thuật dẫn đến hạn chế phát triển khoai tây Việt Nam Về mặt kinh tế, nguyên nhân trồng khoai tây hiệu so với trồng khác đầu hạn chế (trừ khoai tây chế biến) Về mặt kỹ thuật, ngun nhân chủ yếu tượng thối hóa giống gây virus Bệnh virus hại khoai tây phổ biến, dễ lan truyền thông qua môi giới truyền bệnh (cơn trùng trích hút) Khoai tây trồng nhân giống củ, bị nhiễm virus toàn củ bị lây nhiễm Củ giống bị nhiễm virus trồng cho suất, chất lượng thấp Đây tượng thối hóa giống khoai tây gây virus [1] Có nhiều loại virus hại khoai tây, PVY 10 loại virus phổ biến gây tổn thất suất nghiêm trọng nước nhiệt đới trồng khoai tây [2] Ước tính 1% củ giống bị nhiễm PVY giảm suất khoảng 180kg/ha tương ứng 18 $/ha [3] Hàng loạt chiến lược làm giảm hậu bệnh virus hại khoai tây triển khai như: thay giống nhiễm virus giống hàng năm, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật tiêu diệt vector truyền bệnh Trong đó, việc sản xuất giống virus biện pháp phổ biến thực hầu trồng khoai tây quy mô lớn (Pháp, Đức, Hà Lan,…) Việc sản xuất giống virus phải qua nhiều công đoạn phức tạp nuôi cấy mô nguyên liệu bệnh, nhân trồng vật liệu điều kiện cách ly, sản xuất củ giống vùng chuyên sản xuất giống tốn chi phí, nhân lực thời gian Trong giải pháp khắc phục bệnh virus hại khoai tây, nói biện pháp hiệu có tính bền vững việc tạo sử dụng giống kháng virus Phương pháp chọn tạo giống khoai tây kinh điển phương pháp lai tạo Phương pháp vấp phải khó khăn mặt di truyền NST khoai tây tứ bội (2n=4x=48) Bộ genome tứ bội (2n=4x=48) tạo tỷ lệ phân ly lớn sau lai tạo, q trình chọn lọc gặp khó khăn với quần thể lớn trước tìm lai có tính trạng mong muốn để phát triển thành giống Thông thường tạo giống khoai tây thời gian chọn lọc đòi hỏi 10 - 12 năm [4] Chuyển gen kháng bệnh, gen mang tính trạng mong muốn vào trồng áp dụng chương trình chọn tạo giống nhiều trồng Cơng nghệ rút ngắn thời gian chọn tạo giống khoai tây so với phương pháp chọn tạo giống kinh điển Tuy nhiên, lo ngại an toàn sinh học thể GMO (Genetically Modified Organism) nên kỹ thuật chuyển gen vấn đề còn nhiều tranh luận Trước bối cảnh này, việc sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chuyển tích hợp gen mong muốn lên giải pháp có tính khả thi cao Dung hợp tế bào trần tạo giống khoai tây Wenzel et al., vào năm 1979 trải qua 40 năm phát triển, kỹ thuật ngày hoàn thiện Với kỹ thuật i) tạo lai soma trì tính trạng mong muốn cho đời sau nguồn vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống, ii) chuyển gen tích hợp nhiều gen từ vật liệu dung hợp, iii) tái tổ hợp genome nhân tế bào tế bào chất, iv) tránh luật lệ liên quan đến chuyển gen [5] Trên giới, nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây gần sử dụng nguồn khoai tây dại dại S Tarnii, S Pinnatisectum, S bulbocastanum [6], dòng khoai tây nhị bội [7, 8] làm vật liệu nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY thông qua dung hợp tế bào trần Nhằm góp phần nghiên cứu tạo giống khoai tây (nhất khoai tây có khả chế biến) mang tính kháng bệnh virus PVY, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY Việt Nam” thực Mục tiêu Ứng dụng thành công kỹ thuật tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần, xác định lai soma, chọn lọc lai backcross (BC1) để tạo nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY có đặc tính nơng sinh học mong muốn Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tập trung thực đối tượng dòng khoai tây nhị bội (2n = 2x = 24), khoai tây dại (2n = 2x = 24) kháng virus PVY, giống khoai tây trồng (2n = 4x = 48) Thời gian thực hiện: tháng 5/2015 đến tháng 12/2018 Địa điểm nghiên cứu: Các nội dung nghiên cứu tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần chọn lọc lai soma thực Viện Sinh học Nông nghiệp (Học viện Nông nghiệp Việt Nam); lai BC1 lai tạo đánh giá Sapa; nghiên cứu đánh giá tính kháng virus đặc tính nơng sinh học soma lai BC1 thực Viện Sinh học Nông nghiệp (Học Viện Nông nghiệp Việt Nam) đồng ruộng Quế Võ - Bắc Ninh Những đóng góp đề tài 1) Khẳng định thông số tách, nuôi cấy, dung hợp, tái sinh, xác định lai soma phục vụ cho nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây dung hợp tế bào trần vật liệu khoai tây nhị bội (A15, A16, A56, B186, B208), khoai tây dại (Solanum tarnii, Solanum pinatisectum, Solanum bulbocastanum) khoai tây tứ bội (Rasant, Delikat, Atlantic) 2) Chứng minh góp phần khẳng định khả trì tính kháng bệnh virus PVY từ dịng nhị bội khoai tây trồng Solanum tuberosum khả chuyển đặc tính kháng bệnh virus từ lồi khoai tây dại Solanum tarnii, Solanum pinatisectum, Solanum bulbocastanum sang khoai tây trồng tứ bội Solanum tuberosum qua dung hợp tế bào trần 3) Đã tạo dòng khoai tây 47/7, 47/26, 81-2, 131/11 sản phẩm dung hợp hai dòng nhị bội Solanum tuberosum dòng BC1 13.1300.3; BC1 13.1305.6 sản phẩm lai lại lai soma khoai tây dại khoai tây trồng Các dịng vừa có khả kháng bệnh virus PVY vừa mang đặc tính nơng sinh học q sử dụng cho chương trình tạo giống khoai tây kháng virus PVY có suất cao, phẩm chất tốt Ý nghĩa khoa học đề tài Đề tài chứng minh góp phần khẳng định khả trì tính kháng virus cải thiện đặc tính nơng sinh học dịng nhị bội qua dung hợp tế bào trần khả chuyển đặc tính kháng bệnh virus PVY từ lồi khoai tây dại Solanum tarnii, Solanum pinatisectum, Solanum bulbocastanum sang khoai tây trồng tứ bội Solanum tuberosum dung hợp tế bào trần Con lai soma làm vật liệu khởi đầu công tác chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus mang đặc tính nơng sinh học mong muốn Đây dẫn liệu khoa học quý, mẻ phục vụ nghiên cứu, giảng dạy công nghệ tế bào thực vật, công nghệ sinh học chọn tạo giống trồng Ý nghĩa thực tiễn đề tài Kết nghiên cứu đề tài luận án tạo dòng khoai tây 47/7, 47/26, 812, 131/11 sản phẩm dung hợp hai dòng nhị bội Solanum tuberosum dòng BC1 13.1300.3; BC1 13.1305.6 sản phẩm lai lại lai soma khoai tây dại khoai tây trồng Các dòng vừa có khả kháng bệnh virus, vừa mang đặc tính nơng sinh học q sử dụng cho chương trình tạo giống khoai tây kháng virus có suất cao, phẩm chất tốt Ngoài ra, kết đề tài sở kỹ thuật để tham khảo xây dựng quy trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY, mang đặc tính nơng sinh học mong muốn thông qua việc sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung khoai tây 1.1.1 Nguồn gốc Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) trồng cổ đại Các chứng khảo cổ học, lịch sử ngôn ngữ học thực vật học chứng minh khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ Nhiều lồi khoai tây hoang dại tồn tới ngày nay, đặc biệt dãy Andes thuộc Peru, Bolivia [1] Khoai tây đem tới Tây Ban Nha Châu Âu kỷ thứ 16, nhanh chóng thích nghi với điều kiện tự nhiên sớm trở thành loại thực phẩm thời điểm mà dân số giới tăng nhanh Khoai tây vào Pháp năm 1600 hai nhà thực vật học người Thụy Sỹ C Bauhin J Bauhin mang tới, trồng rộng rãi vào năm 1773 Từ Châu Âu khoai tây sang tới Ấn Độ năm 1610, vào Trung Quốc năm 1700 năm 1766 vào Nhật Bản Khoai tây đến với Áo, Italia, Đức vùng lãnh thổ Châu Âu vào cuối kỷ XVII Khoai tây trồng quy mô lớn vào năm 1800 tới khoảng kỷ XIX thực phổ biến châu lục Ở Việt Nam, khoai tây người Pháp đưa vào trồng năm 1890 số vùng: Tú Sơn – Hải Phòng, Trà Lĩnh – Cao Bằng (1907), Thường Tín – Hà Tây (Hồ Hữu An, 2005) Hiện nay, khoai tây trồng tập trung chủ yếu Đồng Bằng Sông Hồng, Sapa, Đà Lạt vùng có khí hậu mát mẻ, ôn hòa… [9] 1.1.2 Phân loại Khoai tây (Solanum tuberosum L.) thuộc loài S tuberosum, chi Solanum, họ cà Solanaceae, Solanales, phân lớp Asteridae, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta Các loài khoai tây thuộc chi (genus) lớn đa dạng mặt di truyền bao gồm loài khoai tây trồng 228 loài khoai tây dại (Hawkes, 1994) Trong lồi khoai tây trồng lồi Solanum tuberosum có hai lồi phụ đặc biệt quan trọng S tuberosum spp Tuberosum (Tuberosum group) S tuberosum spp Andigena (Andigena group) [10] Khoai tây trồng (Cultivated potatoes) Theo Hawkes (1994) có lồi khoai tây trồng có mức bội thể khác với số lượng nhiễm sắc thể gốc 12 (x = 12), nằm phạm vi từ nhị bội ngũ bội Bao gồm loài nhị bội thể (diploid, 2n = 2x = 24) có S Stenotonum, S Ajanhuii S Phureja; tam bội thể (triploid, 2n = 3x = 36) có S Chaucha S Juzepczukii; tứ bội thể (tetraploid, 2n = 4x = 48) có S.tuberosum (có lồi phụ S.tuberosum subsp tuberosum S.tuberosum subsp Andigena) ngũ bội thể (pentaploid, 2n = 5x = 60) có S curtilobum Trong loài khoai tây trồng, loài phổ biến nhất, quan trọng trồng khắp giới loài tứ bội S.tuberosum L (2n = 4x = 48) Tuy nhiên, di truyền của giống Tuberosum Châu Âu Bắc Mỹ hẹp nhóm giống Andigena (lồi phụ Solanum tuberosum subsp andigena) (2n = 4x = 48) trồng vùng cao Andes lại giàu nguồn gen nhiều tính trạng [10, 11, 12] Khoai tây dại (Wild potatoes) Theo Hawkes (1994) khoai tây có số lượng lồi hoang dại nhiều loại trồng khác (228 loài) Chúng chứa NST gốc (x = 12) loài khoai tây trồng thay đổi phạm vi từ nhị bội (2n = 2x = 24) tới lục bội (2n = 6x = 72) Điều quan trọng dòng khoai tây dại có phạm vi phân bố rộng rãi nên có tính thích nghi mặt sinh thái lớn Phạm vi phân bố chúng toàn Nam Mỹ, từ vùng đồng tới vùng núi cao (3000 - 4500m) Với phạm vi tồn rộng lớn, lồi khoai tây dại mang nhiều gen thích ứng với nhiều kiều kiện ngoại cảnh bất lợi chống chịu mạnh mẽ với nhiều loại sâu bệnh Chính lồi khoai tây dại nguồn gen phong phú tính thích ứng với stress phi sinh học nguồn gen kháng quan trọng với nhiều loại sâu bệnh phục vụ chọn tạo giống 1.1.3 Tình hình sản xuất khoai tây giới Việt Nam 1.1.3.1 Tình hình sản xuất khoai tây giới Khoai tây xếp lương thực quan trọng thứ giới sau ngô, lúa mì, gạo khoai tây coi lương thực không hạt quan trọng với lượng sản xuất hàng năm đạt 376,8 triệu (năm 2019) ngày tiêu thụ nhiều vài thập kỷ gần (World Potato Statiscs, 2019) Trung Quốc Nga hai nước có mức độ sản xuất khoai tây lớn giới, khoảng 96 45,5 triệu năm 2019 Bảng 1.1 Mười lăm quốc gia sản xuất khoai tây nhiều giới năm 2019 STT Quốc gia Khoai tây sản xuất (triệu tấn) Trung Quốc 96,0 Ấn Độ 45,5 Nga 31,5 Ukraine 23,7 Mỹ 20,0 Đức 11,8 Bangladesh 9,45 Ba Lan 8,2 Pháp 8,0 10 Thụy Điển 7,33 11 Belarus 6,41 12 Anh 6,2 13 Iran 5,1 14 Thổ Nhĩ Kỳ 4,8 15 Peru 4,78 1.1.3.2 Tình hình sản xuất khoai tây Việt Nam Ở Việt Nam, khoai tây người Pháp đưa vào năm 1890, sau trồng rộng rãi tập trung chủ yếu lưu vực Đồng sông Hồng Trong năm gần đây, sản xuất khoai tây nước ta có bước tiến triển đáng kể diện tích suất, chất lượng củ Sơ liệu thống kê FAOSTAT (2018) qua 10 năm, từ năm 2007 đến năm 2017 chứng minh điều Bảng 1.2 Diện tích, suất sản lượng khoai tây Việt Nam giai đoạn 2007 – 2017 Diện tích Năng suất Sản lượng (hecta) (tấn) (tấn/ha) 2007 36000 372000 10,33 2008 36000 380000 10,56 2009 37000 388000 10,49 2010 29663 352949 11,90 2011 22611 311604 13,78 2012 27585 403717 14,64 2013 23077 313383 13,58 2014 22823 321700 14,10 2015 21767 318321 14,62 2016 21173 302229 14,27 2017 20480 303675 14,83 Chỉ tiêu Năm Mặc dù diện tích trồng không mở rộng thêm, suất khoai tây không ngừng tăng lên qua năm, đặc biệt hai năm gần 2016 – 2017, suất khoai tây đạt 14,27 14,83 tấn/ha Theo thời gian, khoai tây khẳng định vị trí mình, dần trở thành trồng quan trọng cấu nông nghiệp nước ta Vấn đề khó khăn ngành sản xuất khoai tây giống, đặc biệt giống khoai tây bệnh Việc sử dụng cách phổ biến loại củ giống có chất lượng thấp để trồng, khơng sãn có nguồn củ giống tốt với giá hớp lý, thiếu giống ưu tú suất, chất lượng đặc chống chịu virus nguyên nhân chủ yếu hạn chế việc phát triển khoai tây Hiện nay, giống khoai tây mà người dân sử dụng hầu hết nông dân tự trì từ vụ sang vụ khác giống người dân tự mua không rõ nguồn gốc, mà giống khơng bị thối hóa mà còn có tỷ lệ nhiễm bệnh hại cao cộng với hao hụt ... tính kháng bệnh virus PVY, đề tài ? ?Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY Việt Nam? ?? thực Mục tiêu Ứng dụng thành công kỹ thuật tách, dung hợp, ... VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đinh Thị Thu Lê NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN ĐỂ CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG VIRUS PVY Ở VIỆT NAM Ngành: Công nghệ Sinh học Mã... dòng khoai tây nhị bội [7, 8] làm vật liệu nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY thông qua dung hợp tế bào trần Nhằm góp phần nghiên cứu tạo giống khoai tây (nhất khoai tây có