BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP LÊ ANH TÚ NGHIÊN CỨU THU NHẬN LEVAN TỪ (Bacillus subtilis) VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI CHO GÀ CẢNH GIAI ĐOẠN[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP LÊ ANH TÚ NGHIÊN CỨU THU NHẬN LEVAN TỪ (Bacillus subtilis) VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI CHO GÀ CẢNH GIAI ĐOẠN 1-14 NGÀY TUỔI CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VŨ KIM DUNG Hà Nội, 2020 i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn TS Vũ Kim Dung Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực, có nguồn gốc rõ ràng trích dẫn đầy đủ theo quy định Cơng trình chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2020 Người cam đoan Lê Anh Tú ii LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập rèn luyện Trường Đại học Lâm nghiệp, biết ơn kính trọng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo nhiệt tình hướng dẫn, giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thiện đề tài nghiên cứu Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Kim Dung - Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh, Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp, người thầy trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn sinh viên phịng Cơng nghệ Vi sinh - Hóa sinh, Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo phận Feed Technology - Công ty Cổ phần Chăn nuôi CP Việt Nam, chi nhánh Xuân Mai, Hà Nội tạo điều kiện cho tham gia học tập, nghiên cứu năm học giúp đỡ việc thực phần ứng dụng đề tài nghiên cứu Một lần xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp động viên, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tuy nhiên điều kiện lực thân hạn chế, luận văn chắn không tránh khỏi thiếu sót Kính mong nhận đóng góp ý kiến thầy cô giáo, bạn bè đồng nghiệp để luận văn tơi hồn thiện Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2020 Học viên Lê Anh Tú iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH .vii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan levan 1.1.1 Giới thiệu levan .3 1.1.2 Tính chất 1.1.3 Nguồn thu nhận levan 1.1.4 Một số môi trường ni cấy kích thích B subtilis sinh levan 1.1.5 Ứng dụng levan 10 1.2 Thức ăn chăn nuôi gà cảnh .12 1.2.1 Giới thiệu số giống gà cảnh 12 1.2.2 Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn - 14 ngày tuổi 15 Chương MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Mục tiêu nghiên cứu .22 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Vật liệu nghiên cứu 22 2.3.1 Vi sinh vật 22 2.3.2 Môi trường .22 2.3.3 Hóa chất 23 2.3.4 Thiết bị dụng cụ 23 2.4 Phương pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Ảnh hưởng số yếu tố đến trình sinh tổng hợp levan (Jothi cs, 2019) .23 iv 2.4.2 Phương pháp tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp levan theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken (Bruna cs, 2013) 24 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu điều kiện thu nhận levan 25 2.4.4 Phương pháp xây dựng quy trình sản xuất cám gà cảnh bổ sung levan (giai đoạn 1-14 ngày tuổi) 26 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp levan 31 3.1.1 Ảnh hưởng nồng độ sucrose 31 3.1.2 Ảnh hưởng pH ban đầu .32 3.1.3 Ảnh hưởng nguồn nito .33 3.1.4 Ảnh hưởng nồng độ nito 34 3.1.5 Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấp 36 3.1.6 Ảnh hưởng tốc độ lắc 36 3.2 Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp levan .38 3.3 Nghiên cứu điều kiện thu nhận levan .41 3.3.1 Ảnh hưởng loại dung môi đến hàm lượng levan thu 41 3.3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung môi đến hàm lượng levan thu 43 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thu .44 3.3.4 Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu 45 3.4 Nghiên cứu quy trình sản xuất cám gà cảnh từ chế phẩm levan (giai đoạn 14 ngày tuổi) 46 3.4.1 Xác định tỷ lệ levan phối trộn 46 3.4.2 Nghiên cứu xác định nhiệt độ ép viên 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ B subtilis Bacillus subtilis Ca Canxi CP Cruide Protein CS Cộng Fat Fat FOS Fructo - oligosaccharides Fib Fiber GE Gross Energy GP Glucose trypton M Moisture MTCB Môi trường P Photpho QC&Lab Quality Control & Laboratory TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TGA Trypton Glucose Agar vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Độ kết dính số polymer tự nhiên Bảng 2.1 Bảng xác định biến ảnh hưởng, mức khoảng thay đổi biến số .25 Bảng 2.2 Thành phần nguyên liệu công thức cám gà giai đoạn - 14 ngày tuổi 26 Bảng 2.3 Thành phần dinh dưỡng sau bổ sung levan theo tỷ lệ 27 Bảng 2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ ép viên đến chất lượng cám viên 27 Bảng 2.5 Ảnh hưởng nhiệt độ ép viên đến tiêu vi sinh 28 Bảng 3.1 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố hàm lượng levan thu điều kiện nuôi cấy khác 39 Bảng 3.2 Kết phân tích phương sai mơ hình tối ưu phần mềm DX11 .41 Bảng 3.3 Kết phân tích dinh dưỡng cám công thức 47 Bảng 3.4 Kết phân tích thành phần dinh dưỡng 48 bổ sung chế phẩm levan 48 Bảng 3.5 Kết kiểm tra cảm quan bổ sung chế phẩm levan công thức thức ăn chăn nuôi 49 Bảng 3.6 Kết phân tích vi sinh bổ sung chế phẩm levan thức ăn chăn nuôi 49 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học levan Hình 1.2 Sản phẩm dưỡng da mặt với Proteolea® Hình 1.3 Sản phẩm dưỡng thể với Slimexir® Hình 1.4 Các sản phẩm levan thị trường (www.realbio.com) Hình 1.5 Gà rừng đỏ miền Trung Tây Nguyên 13 Hình 1.6 Giống gà Quý phi 13 Hình 1.7 Giống gà lai cá 14 Hình 1.8 Giống gà lơng xù .14 Hình 1.9 Giống gà Serama .15 Hình 1.10 Quy trình công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi gà .16 Hình 1.11 Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn - 14 ngày tuổi 18 Hình 1.12 Lấy mẫu nguyên liệu đầu vào 18 Hình 1.13 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu máy DS2500F 18 Hình 1.14.Kiểm tra nguyên liệu trước lưu silo 19 Hình 1.15 Hệ thống bồn chứa nguyên liệu 19 Hình 1.16 Máy móc hệ thống sản xuất 20 Hình 1.17 Hình ảnh bao cám gà .21 Hình 1.18 Hình ảnh cám gà 21 Hình 3.1 Kết ảnh hưởng nồng độ sucrose đến khả sinh tổng hợp levan 31 Hình 3.2 Canh trường sau nuôi cấy chủng B subtilis với nồng độ sucrose khác 31 Hình 3.3 Kết ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh tổng hợp levan 32 Hình 3.4 Canh trường sau nuôi cấy chủng B subtilis với nồng độ pH khác 33 Hình 3.5 Kết ảnh hưởng nguồn nito đến khả sinh tổng hợp levan 34 Hình 3.6 Canh trường sau nuôi cấy chủng B subtilis với nguồn nito khác 34 Hình 3.7 Kết ảnh hưởng nồng độ nito đến khả sinh tổng hợp levan 35 viii Hình 3.8 Canh trường sau nuôi cấy chủng B subtilis với nồng độ nito khác 35 Hình 3.9 Kết ảnh hưởng tỷ lệ giống cấp đến khả sinh tổng hợp levan 36 Hình 3.10 Kết ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp levan 37 Hình 3.11 Canh trường sau nuôi cấy chủng B subtilis với tốc độ lắc khác 37 Hình 3.12 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu sinh tổng hợp levan 40 Hình 3.13 Ảnh hưởng yếu tố đến sinh tổng hợp levan .40 Hình 3.14 Kết ảnh hưởng loại dung môi đến hàm lượng levan thu 42 Hình 3.15 Ảnh hưởng tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung môi đến hàm lượng levan thu .43 Hình 3.16 Canh trường sau ni cấy chủng B subtilis với tỷ lệ thể tích levan dung môi khác .43 Hình 3.17 Kết ảnh hưởng nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thu 44 Hình 3.18 Kết ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu 45 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học, nguyên liệu sinh học an toàn dần sử dụng để thay cho nguyên liệu hóa học Chúng sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác sống Các nguyên liệu có khả đáp ứng nhu cầu cần thiết đảm bảo an tồn mục đích sử dụng Vì thế, nhà khoa học tiến hành nghiên cứu thu nhận hợp chất có nhiều tính vượt trội từ vi sinh vật phục vụ cho đời sống người Levan hợp chất polymer sinh học tổng hợp từ vi khuẩn mơi trường có thành phần sucrose Đây polymer fructose tạo liên kết β - (2 - 6) fructo - furanosidic, có mặt nhiều loại thực vật sản phẩm từ vi sinh vật Levan cung cấp nguyên liệu cho hàng loạt ngành công nghiệp nhiều lĩnh vực khác như: y dược, thực phẩm mỹ phẩm Ứng dụng tiềm levan để làm chất nhũ hóa dùng sữa, chất ổn định, chất làm đặc đặc biệt khả phục hồi sức khỏe có giá trị liệu pháp điều trị ung thư Levan polymer fructose sản xuất thực vật, nấm men, nấm vi khuẩn (Jang cs, 2001) Levan tổng hợp từ nguồn vi sinh vật như: Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Erwinia amylovora, Erwinia herbicola, Seraria sp (Oseguera cs, 1996), Rahnella aquatilis (Kim cs, 2000), Acetobacter xylinum NCI 1005 (Tajima cs, 1998) B subtilis (Shin cs, 2005) Trong chủng B subtilis Natto có khả sinh tổng hợp levan cao với hiệu suất 40,4 g/l mơi trường có chứa 200g/l sucrose (Shin cs, 2005) Nhưng nhìn chung, hiệu suất thu levan từ nguồn vi sinh vật chưa cao Vì vậy, nhà khoa học khơng ngừng tìm kiếm nguồn thu nhận có khả thu hàm lượng levan cao Ở Việt Nam, phong trào chơi gà cảnh ngày phát triển Một gà cảnh có trọng lượng 500 g lượng thức ăn tiêu tốn 1/3 gà công nghiệp, giá trị đem lại cao gấp vài chục lần, chí hàng trăm lần gà cơng nghiệp 2 Việc bổ sung dinh dưỡng chế độ ăn cho gà cảnh hay chế phẩm sinh học phần ăn, đặc biệt giai đoạn - 14 ngày tuổi giai đoạn sức đề kháng kém, nhạy cảm dễ tăng tỷ lệ chết Bổ sung dinh dưỡng giai đoạn cách hợp lý phù hợp với phát triển gà giúp cân dinh dưỡng, tăng sức đề kháng, tăng lợi khuẩn cho đường ruột cân đối ngoại hình phục vụ cho mục đích sử dụng Xuất phát từ thực tế đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận levan từ Bacillus subtilis bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn cho gà cảnh giai đoạn - 14 ngày tuổi” 3 Chương TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan levan 1.1.1 Giới thiệu levan Levan thuộc hai loại fructans (là cacbohydrate thường tìm thấy thực vật, tảo, vi khuẩn) Fructans gồm có hai loại levan inulins phân biệt loại liên kết Các đơn phân phân tử levan liên kết với liên kết ß (2 - 6) phân tử inulins liên kết ß (2 - 1) (Han cs, 1990) Theo phân loại levan thuộc nhóm thứ hai fructans Levan polymer fructose tạo liên kết β - (2 - 6) fructo furanosidic (Ki- Hyo cs, 2001; Mardo cs, 2014) Các vi sinh vật có khả tổng hợp levan gồm: Lactobacillus gasseri, B circulans, E amylovora, Seraria sp., Acetobacter xylinum NCI 1005, Z mobilis B subtilis (Anwar cs, 2010; Devi Alamu, 2013; Oliveira cs, 2007) Levan polysaccharide ngoại bào tổng hợp từ vi khuẩn môi trường có thành phần sucrose Do vi khuẩn có khả sinh tổng hợp levansucrose để chuyển hóa sucrose thành levan (Mardo cs, 2014) Năm 2012, nghiên cứu thực Esawy cs cho thấy vi khuẩn Bacillus spp tách chiết từ mật ong có khả sinh tổng hợp levan Mặc dù cấu trúc levan đặc trưng mạch thẳng liên kết ß (2 - 6) có nhiều levan tổng hợp từ vi khuẩn có cấu trúc phân nhánh với liên kết ß (2 - 1) Các mạch nhánh thường ngắn có mơt đơn phân fructose Fructans ngắn - ketose fructan ngắn loại levan Levan số polyme tự nhiên carbohydrate tồn dạng furanose Hình 1.1 Cấu trúc hóa học levan Levan sản xuất từ sinh vật khác có khác biệt lượng phân tử mức độ phân nhánh Levan tổng hợp từ vi khuẩn có khối lượng phân tử lớn levan thu từ thực vật khoảng - 100 kDa (Pontis Campillo, 1985; Keith cs, 1991) Levan sản xuất từ thực vật có lượng phân tử khoảng - 33 kDa (Rhee cs, 2002) Levan sản xuất từ trình lên men vi khuẩn Zymomonas mobilis có khối lượng phân tử khoảng 107 Da, tương ứng với 60000 đơn phân fructose (Viikari cs, 1986) Bên cạnh đó, levan sản xuất từ vi khuẩn B subtilis Natto có hai loại trọng lượng phân tử khác nhau, levan có khối lượng phân tử cao 1794 kDa levan có khối lượng phân tử thấp 11 kDa Levan có trọng lượng phân tử khác cần thiết cho mục đích cụ thể (Shin cs, 2005) Trong chủng B subtilis có khả sinh tổng hợp levan cao với 40 g/l mơi trường có chứa 200 g/l sucrose (Shih cs 2005) Trong nghiên cứu Jothi cs (2019) cho thấy levan tổng hợp B subtilis MTCC 441 sử dụng sucrose làm nguồn carbon Chiết xuất nấm men (YE) nguồn nitơ tốt Nồng độ sucrose 100 g/l, pH 7, nồng độ YE g/l, tốc độ lắc 150 vòng/phút giá trị tối ưu cho sản xuất levan Kết cho thấy suất levan thu tương ứng 0,395 g/g sucrose Các nghiên cứu levan có khả chống ung thư (Calazans cs, 2000; Yoo cs, 2004) Levan sản xuất từ Microbacterium laevaniformans, Rahnella aquatilis Zymomonas mobilis có khả chống lại tám dịng khác tế bào ung thư (El-Safty cs, 2012) Nhiều nghiên cứu levan thúc đẩy vai trò chúng điều trị sâu (Aridson cs, 2006) làm giảm cholesterol (Yamamoto cs, 1999), điều hòa hoạt động miễn dịch thể (Calazans cs, 1997; Yamamoto cs, 1999) Levan sử dụng để sản xuất DFA IV (di - D - fructose - 2,6: 6.2 - dianhydride) với độ nửa độ sucrose có tính ổn định Vì vậy, levan ứng dụng chất làm sản phẩm sử dụng cho bệnh nhân tiểu đường (Jaecho cs, 2001) Trong vài thập kỷ qua, số nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn để tăng cường khả tổng hợp levan thực Oliveira cs (2007) tiến hành tối ưu điều kiện nuôi cấy Zymomonas mobilis phương pháp đáp ứng bề mặt với nhân tố thay đổi, thu hàm lượng levan cao 21,68 g/l Santos cs (2013), tối ưu điều kiện nuôi cấy B.subtilis Natto phương pháp cho hàm lượng levan đạt 111,6 g/l với nồng độ sucrose (400 g/l) thời gian nuôi 16 Hiện nay, levan nhiều nhà khoa học sản xuất quan tâm đặc tính vượt trội như: khả hịa tan tốt dầu nước, độ kết dính mạnh, khả tương thích sinh học tốt, chống ung thư khả tạo màng (Santos cs, 2013) Vì vậy, levan ứng dụng mỹ phẩm, thực phẩm dược phẩm (Jaecho cs, 2001; Santos cs, 2013) Levan sử dụng chăm sóc cá nhân, y tế, công nghệ nanno (Gupta cs, 2010), nuôi trồng thủy sản ứng dụng thực phẩm (Oner cs, 2016) Natural Polymers Inc (Hoa Kỳ); Real Biotech Co., Ltd., (Hàn Quốc) Advance Co., Ltd., (Nhật Bản) nhà sản xuất levan quy mơ thương mại Hai ví dụ phổ biến sản phẩm thương mại dựa levan có sẵn thị trường Proteolea® Slimexir® (Oner cs, 2016) Hình 1.2 Sản phẩm dưỡng da mặt Hình 1.3 Sản phẩm dưỡng thể với Proteolea® với Slimexir® Bên cạnh đó, số sản phẩm thực phẩm chức bày bán hệ thống siêu thị Hàn Quốc, Nhật Bản công ty RealBiotech (www.realbio.com) (Beste cs, 2016) 6 Hình 1.4 Các sản phẩm levan thị trường (www.realbio.com) 1.1.2 Tính chất Levan loại bột tinh thể màu trắng có tính chất chất kết dính mạnh mẽ Các hạt có dạng hình cầu đường kính 75 - 200 nm Các thành phần tính chất levan phụ thuộc vào mơi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp levan (Khadiga cs, 2015) Không giống polysaccharides sử dụng chất nhũ hóa chất làm đặc, levan khơng trương lên nước độ nhớt thấp 0,38 dl/gm 250C (In Young Bae cs, 2007) Levan dễ tan nước nóng gần khơng hịa tan (< 0,5%) nước nhiệt độ phòng Khả hịa tan nước nóng levan cao inulin đặc trưng liên kết ß (2 - 6) so với liên kết ß (2 - 1) cấu trúc mạch nhánh yếu tố hỗ trợ (Justin cs, 2007) Levan homopolymer fructose khơng hịa tan hầu hết dung môi hữu (Ashton cs, 2012): - Methanol, ethanol, isopropanol, n - propanol; - Acetone, methylethylketone, toluene; - Ethyl lactate; - N, N - dimethyloctanamide, N, N - dimethyl - decanamide; - Methyl caprylate/caprate, methylpalmitate/ oleate; - D - limonene; - Propylene carbonate, methoxypolyethylene glycol, polyethylene glycol; - Dimethyl formamid; - Ethoxyethyl acetate, anhydride acetic; - Furfuryl alcohol; - Dầu hỏa, xăng Levan không bị phân cắt thủy phân enzyme invertase amylase, dễ bị thủy phân acid tạo thành fructose Levan bị thủy phân hoàn toàn thành đơn phân fructose HCl 1N 700C (Kang Cottrell, 1979) Levan thủy phân axit oxalic 0,5% (Shin cs, 2005) Theo Szwengiel cs (2004) sản phẩm trình thủy phân levan axit yếu fructo oligosaccharides (FOS) ngắn đơn phân fructose Độ kết dính levan mạnh So với polymer tự nhiên, levan có độ kết dính mạnh nhiều, thể qua bảng 1.1 (Bruna cs, 2015) Bảng 1.1 Độ kết dính số polymer tự nhiên Polymer tự nhiên Độ kết dính (psi) Levan 991 Carboxymethylcellulose 193 Inulin 124 Guargum 63 Xanthan gum 33 Levan có số đặc tính sinh học như: ức chế khối u, kích thích tăng tính thấm tế bào (Leibovici Stark, 1984) Hơn nữa, levan có khả tương thích sinh học tốt khả tạo màng Vì vậy, levan ứng dụng nhiều y học (Shin cs, 2005) 1.1.3 Nguồn thu nhận levan Levan cacbohydrate sản xuất thực vật, nấm men, nấm vi khuẩn (Jang cs, 2002) Levan tìm thấy số loại cỏ như: Dactylis glomerata, Poa secunda Agropyron cristatum Levan chứa lúa mì lúa mạch (Hordeum vulgare), nấm (Aspergillus sydawi A versicolor) (Han, 1990) Levan tổng hợp nhiều vi sinh vật như: Zymomonas mobilis (Muro cs, 2000), Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Erwinia amylovora, Erwinia herbicola, Seraria sp (Oseguera cs, 1996), Rahnella aquatilis (Kim cs, 2000), Pseudomonas syringae (Hettwer cs, 1995) Acetobacter xylinum NCI 1005 (Tajima cs, 1998) Levan sản xuất từ sinh vật khác có khác biệt trọng lượng phân tử mức độ phân nhánh Levan sản xuất từ vi khuẩn nuôi cấy mơi trường có thành phần sucrose Dựa chất phản ứng chuyển gốc fructose sucrose levan β - 2, - fructan enzyme D - glucose - fructosyl transferare số vi sinh vật Nhưng nguồn vi sinh vật để sản xuất levan quy mô công nghiệp cho suất cao Gần nhà khoa học tìm vi khuẩn B subtilis Natto có khả sản xuất hỗn hợp poly acid glutamic levan Khi chúng ni cấy mơi trường có thành phần gồm đường sucrose axit amin L Glutamic Tuy nhiên, hỗn hợp poly acid - - glutamic chủ yếu sản xuất mơi trường có chứa acid - - glutamic khơng có đường sucrose Ngược lại, levan sản xuất vi khuẩn ni cấy mơi trường có tới 20% (w/w) đường sucrose khơng có glutamate Các nhà khoa học cho B subtilis Natto có tiềm sản xuất lượng lớn levan sản phẩm dễ dàng tinh (Shin cs, 2005) 1.1.4 Một số môi trường nuôi cấy kích thích B subtilis sinh levan Levan sản xuất từ vi khuẩn ni cấy mơi trường có thành phần đường cacbonhydrate sucrose Năm 2004, Szwengiel cs, nuôi cấy B subtilis DSM 347 mơi trường có thành phần sau: sucrose (150 g/l), acid citric (11,7 g/l), natri sulfat (4,0 g/l), ammonium hydrogen phosphate (4,2 g/l), cao nấm men (5,0 g/l) 100 ml/l dung dịch muối (với thành phần: KCl (7,62 g/l), MgCl2 (4,18 g/l), MnCl2 (5,43 g/l), FeCl3 (0,49 g/l), ZnCl2 (0,21 g/l)) Độ pH môi trường nuôi cấy điều chỉnh tới 6,8 dung dịch amoniac 25% Môi trường khử trùng 121oC 20 phút Sau 16 nuôi cấy thu levan với hàm lượng 35 g/l Năm 2005, Shin cs tổng hợp 40,4 (g/l) levan từ B subtilis (Natto) sau 21 lên men môi trường có sucrose (200 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l), NaH2PO4.2H2O (3 g/l) Na2HPO4.12H2O (3 g/l) pH Năm 2007, theo Oliverira cs sau 24 nuôi cấy Zymomonas mobilis ATCC 31821 môi trường sinh tổng hơp levan có thành phần sau: sucrose (350 g/l), cao nấm men (2 g/l), KH2PO4 (1 g/l), (NH4)2SO4 (1 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l) 25oC sinh tổng hợp levan 21,7 g/l Nghiên cứu Santos cs (2013), cho thấy từ chủng B subtilis phân lập từ thực phẩm Natto thương mại Nhật Bản có khả sinh tổng hợp levan cao so với nghiên cứu trước Chủng B subtilis Natto nuôi cấy mơi trường có hàm lượng sucrose cao (400 g/l) 370C Ngồi sucrose mơi trường lên men cịn có nhiều thành phần khác như: cao nấm men (2,0 g/l), KH2PO4 (1,0 g/l), (NH4)2SO4 (3,0 g/l), MgSO4 7H2O (0,06 g/l), MnSO4 (0,02 g/l) Sau 16 nuôi cấy tác giả tổng hợp 111,6 g/l levan từ B subtilis Natto Gần đây, Jothi cs (2019), nghiên cứu trình sinh tổng hợp levan từ chủng Bacillus subtilis MTCC 441 điều kiện môi trường dịch chiết nấm men (YE) nồng độ g/l, nồng độ sucrose 100 g/l, pH 7, tốc độ lắc 150 vòng/ phút tổng hợp hàm lượng levan tương ứng 0,395 g/g sucrose Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật ảnh hưởng tới thành phần tính chất levan Theo Guilbert Combes (1996), nồng độ sucrose môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến trọng lượng phân tử levan Nồng độ sucrose môi trường ni cấy tỷ lệ nghịch với kích thước chuỗi polymer fructose Santos cs (2013), nuôi cấy B subtilis Natto môi trường giàu sucrose (400 g/l) sinh tổng hợp hai loại levan trọng lượng phân tử khác Levan có khối lượng phân tử cao 1794 kDa levan có khối lượng phân tử thấp 11 kDa Điều lý giải ban đầu, môi trường nuôi cấy nồng độ sucrose cao nên vi khuẩn tổng hợp levan có trọng lượng phân tử thấp 11 kDa, cịn sau q trình nuôi vi sinh vât, vi khuẩn sử dụng nhiều sucrose, làm cho nồng độ sucrose 10 giảm nhiều nên tổng hợp phân tử levan có trọng lượng cao 1794 kDa (Santos cs, 2013) 1.1.5 Ứng dụng levan Trong năm gần đây, việc sử dụng loại polysaccharide từ vi khuẩn phát triển mạnh, loại polysaccharide gọi polymer sinh học có tính tương thích sinh học cao, thân thiện với môi trường polysaccharide sản xuất từ vi khuẩn xem nguồn lượng tiềm ngành công nghệ sinh học Levan loại polymer sinh học nhiều người quan tâm đặc tính vượt trội levan khả hòa tan tốt dầu nước, độ kết dính mạnh, khả tương thích sinh học tốt khả tạo màng Vì vậy, levan ứng dụng nhiều lĩnh vực như: mỹ phẩm, thực phẩm, dược phẩm, y học (Hae cs, 2003) Trong lĩnh vực y học, levan coi sản phẩm tuyệt vời sinh học khả tương thích với hoạt động thể người Do có hoạt tính polymer sinh học nên levan dùng để sản xuất fructose tinh khiết dùng y tế, có khả chống ung thư (Calazans cs, 2000; Yoo cs, 2004) Levan sản xuất từ Microbacterium laevaniformans, Rahnella aquatilis Zymomonas mobilis có khả chống lại tám dòng khác tế bào u (El-Safty cs, 2012) Nhiều nghiên cứu levan thúc đẩy vai trò chúng điều trị sâu (Aridson cs, 2006) làm giảm cholesterol (Yamamoto cs, 1999), điều hòa hoạt động miễn dịch thể (Calazans cs, 1997) Ngồi ra, levan cịn tạo lượng hypocholesterol lớn (Yamamoto, 1999) Một số levan cịn có hoạt tính sinh học gần giống huyết tương, có khả làm tăng khối huyết tương, hạ đường huyết điều trị bệnh tiểu đường Levan sử dụng để sản xuất DFA IV (di - D - fructose - 2,6: 6.2 dianhydride) DFA IV thuộc nhóm hợp chất di - fructose anhydride (DFAs) kết phản ứng transfructosylation intramolecular DFA IV đặc trưng độ nửa độ sucrose có tính ổn định Vì vậy, levan ứng dụng chất làm sản phẩm sử dụng cho bệnh nhân tiểu đường (Jaecho cs, 2001) 11 Năm 2009, Kang cs nghiên cứu khả gây độc levan dòng tế bào nguyên bào sợi người Kết nghiên cứu cho thấy, levan khơng có khả gây độc dòng tế bào với nồng độ levan 100 mg/ml mg/ml Năm 2011, theo Dahech cs levan có hiệu việc ức chế tăng đường huyết gây bệnh tiểu đường nghiên cứu cho thấy bổ sung levan vào chế độ ăn uống hữu ích việc ngăn ngừa biến chứng bệnh tiểu đường chuột trưởng thành Năm 2012, Esawy cs nghiên cứu levan tổng hợp từ Bacillus spp phân lập từ mật ong có khả kháng vi rút H5N1 40 loại denovirus Trong ứng dụng dược phẩm, levan dùng làm màng bao thuốc viên Levan có cấu trúc phân nhánh thường tạo độ nhớt sử dụng chất kết dính thuốc viên dùng làm màng bao bên viên thuốc (In cs, 2007) Trong công nghệ thực phẩm, levan sử dụng làm chất phụ gia thực phẩm có đặc tính prebiotic hypocholesterol Prebiotic thành phần thức ăn khơng bị tiêu hóa hấp thụ dịch dày ruột non mà có khả kích thích phát triển hoạt động vi khuẩn có lợi đường tiêu hóa (Olano cs, 2002) Bên cạnh đó, levan dùng làm chất tạo ngọt, chất nhũ hóa sữa chất kết dính Ban đầu, levan coi sản phẩm phụ trình lên men sản xuất ethanol, tăng độ nhớt siro đường mía (Ernandes Garcia - Cruz, 2005) Ngoài ra, levan bổ sung vào sản phẩm mỹ phẩm với vai trò làm ẩm da, giảm hiệu ứng kích thích da tăng mùi hương cho sản phẩm (Calazans cs, 2000) Ứng dụng levan chất ổn định, chất làm đặc, tác nhân bề mặt, tác nhân đóng gói, chất làm gia tăng hương vị, màu sắc ngồi cịn chất tạo mùi vị (Selim cs, 2013) Một số nghiên cứu số vi khuẩn có tiềm sản xuất lượng lớn levan có khối lượng phân tử cao dễ tinh sạch, không lẫn sản phẩm phụ polysaccharide khác Như vậy, chi phí sản xuất levan thấp làm tăng việc sử dụng levan (Shin cs, 2005) ... subtilis sinh levan 1. 1.5 Ứng dụng levan 10 1. 2 Thức ăn chăn nuôi gà cảnh .12 1. 2 .1 Giới thiệu số giống gà cảnh 12 1. 2.2 Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn. .. Giống gà lông xù .14 Hình 1. 9 Giống gà Serama .15 Hình 1. 10 Quy trình cơng nghệ sản xuất thức ăn chăn ni gà .16 Hình 1. 11 Quy trình sản xuất thức ăn chăn ni gà giai đoạn - 14 ... subtilis bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn cho gà cảnh giai đoạn - 14 ngày tuổi? ?? 3 Chương TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. 1 Tổng quan levan 1. 1 .1 Giới thiệu levan Levan thu? ??c hai loại fructans