Xây dựng phương pháp biến nạp cho bacillus subtilis 1012 và bacillus subtilis WB800N

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM THỊ MỸ TIÊN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN BIẾN NẠP CHO BACILLUS SUBTILIS 1012 VÀ BACILLUS SUBTILIS WB800N LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM THỊ MỸ TIÊN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN BIẾN NẠP CHO BACILLUS SUBTILIS 1012 VÀ BACILLUS SUBTILIS WB800N Chuyên ngành: Vi sinh Mã số chuyên ngành: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG TP Hồ Chí Minh – Năm 2015 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn đến tất thầy cô khoa Sinh – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh thầy cô thỉnh giảng tận tình truyền đạt cho em kiến thức quý báu suốt năm học Em xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn chân thành đến GS TS Trần Linh Thước Thầy gương sáng cho em đường học tập nghiên cứu Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Phan Thị Phượng Trang thầy Nguyễn Đức Hoàng Thầy cô tận tâm hướng dẫn, định hướng truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu vô quý báu, đồng thời hỗ trợ em trình học tập, nghiên cứu tạo điều kiện cho em phát huy tốt lực Cảm ơn thầy cô tất thành em đạt ngày hôm Em xin cảm ơn anh chị, em bạn học tập làm việc Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học hỗ trợ, động viên em suốt trình làm thí nghiệm, đồng thời chia sẻ kinh nghiệm nghiên cứu vui buồn công việc Đặc biệt cảm ơn anh Trí Nam, chị Ngọc Phương, anh Tuấn Anh, anh Hoài Nam, anh Lương Thắng bạn Tinh Tươm, Kiều Thanh, Châu Duyên, em Huy, Vương, Toàn, Phương, Trí, Lan, Lệ Mọi người giúp đỡ em nhiều thời gian qua Cảm ơn tập thể cán phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho em trình nghiên cứu Và hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến ba mẹ gia đình, người bên cạnh con, yêu thương chỗ dựa vững cho bước đường mà chọn TP Hồ Chí Minh tháng năm 2015 Phạm Thị Mỹ Tiên Mục lục MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .xi LỜI MỞ ĐẦU TỔNG QUAN 1.1 1.2 Tổng quan Bacillus subtilis 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.2 Đặc điểm vách tế bào 1.1.3 Dinh dưỡng sinh trưởng 1.1.4 Ưu điểm B subtilis 1012 B subtilis WB800N 1.1.5 Ứng dụng B subtilis sản xuất protein tái tổ hợp Một số phương pháp biến nạp vật chất di truyền vào B subtilis 1.2.1 Phương pháp biến nạp tự nhiên 1.2.1.1 Nguyên tắc 1.2.1.2 Ưu nhược điểm 1.2.2 Phương pháp biến nạp qua protoplast 1.2.2.1 Nguyên tắc Trang i Mục lục 1.2.2.2 1.2.3 1.3 Ưu nhược điểm 10 Phương pháp điện biến nạp 10 1.2.3.1 Nguyên tắc 10 1.2.3.2 Tác động dòng điện đến màng tế bào 11 1.2.3.3 Ưu nhược điểm phương pháp điện biến nạp 12 Các yếu tố ảnh hưởng tần suất biến nạp phương pháp điện biến nạp 12 1.3.1 Đặc điểm tế bào khả nạp 13 1.3.2 Môi trường tăng trưởng ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên tính khả nạp 14 1.3.2.1 Áp suất thẩm thấu chất thẩm thấu môi trường tăng trưởng 15 1.3.2.2 Các chất tác động lên vách tế bào trình nuôi cấy 16 1.3.2.3 Nhiệt độ 17 1.3.3 Ảnh hưởng cấu trúc kích thước DNA lên tính khả nạp 17 1.3.4 Thông số điện biến nạp 18 1.4 Ảnh hưởng điện trường đến tế bào vi khuẩn 18 1.5 Tình hình nghiên cứu phương pháp điện biến nạp cho Bacillus 19 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 Địa điểm nghiên cứu 20 2.2 Vật liệu 20 Trang ii Mục lục 2.2.1 2.2.1.1 Chủng vi khuẩn 20 2.2.1.2 Plasmid 20 2.2.2 2.3 Nguồn nguyên liệu sinh học 20 Môi trường - hóa chất - thiết bị - dụng cụ sử dụng 21 2.2.2.1 Môi trường 21 2.2.2.2 Hóa chất thuốc thử 22 2.2.2.3 Dụng cụ - thiết bị 23 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Tách chiết plasmid 24 2.3.1.1 Biến nạp plasmid vào E coli OmmiMAX 25 2.3.1.2 Tách plasmid midi kit 25 2.3.1.3 Biến nạp plasmid vào B subtilis theo phương pháp thông thường 25 2.3.2 Xây dựng quy trình điện biến nạp 26 2.3.2.1 Dựng đường cong tăng trưởng B subtilis 1012 B subtilis WB800N 27 2.3.2.2 Xây dựng quy trình điện biến nạp sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu cao kết hợp với xử lý tế bào lysozyme 28 2.3.2.3 Xây dựng quy trình điện biến nạp sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu cao kết hợp xử lý tế bào với nhiệt độ lạnh 4oC 31 2.3.3 Khảo sát hiệu suất biến nạp với plasmid khác 32 Trang iii Mục lục 2.3.4 Kiểm tra plasmid sau biến nạp vào tế bào B subtilis 33 2.3.5 Khảo sát biểu protein tái tổ hợp tế bào B subtilis 35 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1 Xây dựng quy trình điện biến nạp 36 3.1.1 Đường cong tăng trưởng B subtilis 1012 B subtilis WB800N 36 3.1.2 Xây dựng quy trình điện biến nạp sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu cao kết hợp xử lý tế bào lysozyme 37 3.1.2.1 Ảnh hưởng môi trường tăng trưởng thời điểm thu mẫu lên tính khả nạp tế bào B subtilis 1012 B subtilis WB800N 37 3.1.2.2 Ảnh hưởng nồng độ lysozyme lên tính khả nạp tế bào B subtilis 1012 B subtilis WB800N 41 3.1.2.3 Ảnh hưởng thời gian xử lý với lysozyme lên tính khả nạp tế bào B subtilis 1012 B subtilis WB800N 43 3.1.2.4 3.1.3 Ảnh hưởng hiệu điện đến tần suất biến nạp 46 Xây dựng quy trình điện biến nạp sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu cao kết hợp ủ lạnh tế bào 4oC 50 3.1.3.1 Ảnh hưởng môi trường tăng trưởng thời điểm thu mẫu lên tính khả nạp tế bào B subtilis 1012 B subtilis WB800N 50 3.1.3.2 Ảnh hưởng thời gian ủ lạnh lên tính khả nạp tế bào B subtilis 1012 B subtilis WB800N 52 Trang iv Mục lục 3.1.3.3 Ảnh hưởng hiệu điện lên tần suất biến nạp B subtilis 1012 B subtilis WB800N 55 3.2 Khảo sát tần suất biến nạp với plasmid pHT1068, pHT43 – amyQ 57 3.3 Kiểm tra plasmid sau điện biến nạp vào tế bào B subtilis 59 3.4 Khảo sát biểu protein tái tổ hợp tế bào B subtilis 1012 B subtilis WB800N 61 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 64 4.2 Đề nghị 655 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Trang v Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các cặp mồi kích thước sản phẩm PCR tương ứng với plasmid 34 Bảng 3.1: Bảng tổng kết kết biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012 B subtilis WB800N nuôi môi trường LB – 0,5 M sorbitol thời điểm tăng trưởng xử lý lysozyme 38 Bảng 3.2: Bảng tổng kết kết biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012 B subtilis WB800N xử lý với nồng độ lysozyme: 0,5; 1; 2; µg/ml 42 Bảng 3.3: Bảng tổng kết kết biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012 B subtilis WB800N xử lý nồng độ lysozyme µg/ml thời gian: 5; 10; 15; 20 phút 44 Bảng 3.4: Bảng tổng kết kết biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012 B subtilis WB800N xử lý lysozyme biến nạp với dãy hiệu điện 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV 47 Bảng 3.5: Bảng tổng kết kết biến nạp plasmid vào B subtilis 1012 B subtilis WB800N nuôi môi trường LB – 0,5 M sorbitol thời điểm tăng trưởng xử lý ủ lạnh 4oC 51 Bảng 3.6: Bảng tổng kết kết biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012 B subtilis WB800N phương pháp ủ lạnh 4oC 12; 24; 36; 48 53 Bảng 3.7: Bảng tổng kết kết biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012 B subtilis WB800N với dãy hiệu điện 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV phương pháp ủ lạnh 55 Bảng 3.8: Kết điện biến nạp B subtilis 1012 B subtilis WB800N với plasmid pHT1068 pHT43 – amyQ theo hai quy trình xử lý lysozyme ủ lạnh 58 Trang vi Danh mục biểu đồ DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Đường cong tăng trưởng hai chủng B subtilis 1012 B subtilis WB800N môi trường LB – sorbitol (0; 0,25; 0,5; 0,75 M) 36 Biểu đồ 3.2: Bảy thời điểm tăng trưởng từ pha log đến pha cân B subtilis 1012 B subtilis WB800N môi trường LB – sorbitol (0; 0,25; 0,5; 0,75 M) 37 Biểu đồ 3.3: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012 B subtilis WB800N theo thời điểm tăng trưởng khác dựa giá trị OD600nm môi trường LB – 0,5 M sorbitol xử lý lysozyme 40 Biểu đồ 3.4: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào tế bào B subtilis 1012 B subtilis WB800N xử lý lysozyme nồng độ từ: 0,5; 1; 2; µg/ml 10 phút 43 Biểu đồ 3.5: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào tế bào B subtilis 1012 B subtilis WB800N xử lý lysozyme nồng độ từ µg/ml 5, 10, 15, 20 phút 46 Biểu đồ 3.6: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào tế bào B subtilis 1012 B subtilis WB800N xử lý lysozyme điện biến nạp với hiệu điện thế: 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV 48 Biểu đồ 3.7: Bảy thời điểm tăng trường từ pha log đến pha cân B subtilis 1012 B subtilis WB800N môi trường LB – sorbitol (0; 0,25; 0,5; 0,75 M) 50 Biểu đồ 3.8: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012 B subtilis WB800N theo thời điểm tăng trưởng khác dựa giá trị OD600nm môi trường LB – 0,5 M sorbitol ủ lạnh 4oC 24 51 Biểu đồ 3.9: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012 B subtilis WB800N theo môi trường LB – 0,5 M sorbitol ủ lạnh 4oC 12; 24; 36; 48 54 Trang vii Tài liệu tham khảo [8] Benz, R and Zimmermann, U (1981), “The resealing process of lipid bilayers after reversible electrical breakdown”, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes, 640(1), 169–178 [9] Bone, E.J and Ellar, D.J (1989), “Transformation of Bacillus thuringiensis by electroporation”, FEMS Microbiology Letters, 58(2–3), 171–177 [10] Brigidi, P., De Rossi, E., Bertarini, M.L., Riccardi, G and Matteuzzi, D (1990), “Genetic transformation of intact cells of Bacillus subtilis by electroporation”, FEMS Microbiology Letters, 67(1–2), 135–138 [11] Bron, S., Meijer, W., Holsappel, S and Haima, P (1991), “Plasmid instability and molecular cloning in Bacillus subtilis”, Research in Microbiology, 142(7–8), 875– 883 [12] Canosi, U., Morelli, G and Trautner, T.A (1978), “The relationship between molecular structure and transformation efficiency of some S aureus plasmids isolated from B subtilis”, Molecular and General Genetics MGG, 166(3), 259–267 [13] Chakrabarti, R., Wylie, D.E and Schuster, S.M (1989), “Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation.”, Journal of Biological Chemistry, 264(26), 15494–15500 [14] Chang, D.C (1992), Guide to electroporation and electrofusion, Academic Press [15] Chang, D.C., Gao, P.Q and Maxwell, B.L (1991), “High efficiency gene transfection by electroporation using a radio-frequency electric field”, Biochimica Et Biophysica Acta, 1092(2), 153–160 [16] Chang, S and Cohen, S.N (1979), “High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA”, Molecular and General Genetics MGG, 168(1), 111–115 [17] Chassy, B.M and Flickinger, J.L (1987), “Transformation of Lactobacillus casei by electroporation”, FEMS Microbiology Letters, 44(2), 173–177 [18] Chassy, B.M and Flickinger, J.L (1987), “Transformation of Lactobacillus casei by electroporation”, FEMS Microbiology Letters, 44(2), 173–177 Tài liệu tham khảo [19] Chassy, B.M and Giuffrida, A (1980), “Method for the lysis of Gram-positive, asporogenous bacteria with lysozyme.”, Applied and Environmental Microbiology, 39(1), 153–158 [20] Chassy, B.M., Mercenier, A and Flickinger, J (1988), “Transformation of bacteria by electroporation”, Trends in Biotechnology, 6(12), 303–309 [21] Chen, I and Dubnau, D (2004), “DNA uptake during bacterial transformation”, Nature Reviews Microbiology, 2(3), 241–249 [22] Chu, G., Hayakawa, H and Berg, P (1987), “Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.”, Nucleic Acids Research, 15(3), 1311– 1326 [23] Conchas, R.F and Carniel, E (1990), “A highly efficient electroporation system for transformation of Yersinia”, Gene, 87(1), 133–137 [24] Contente, S and Dubnau, D (1979), “Characterization of plasmid transformation in Bacillus subtilis: Kinetic properties and the effect of DNA conformation”, Molecular and General Genetics MGG, 167(3), 251–258 [25] Csonka, L.N (1989), “Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress.”, Microbiological Reviews, 53(1), 121–147 [26] F Tabatabaie, A.M (2008), “Studying the Effects of Ultrasound Shock on Cell Wall Permeability and Survival of Some LAB in Milk” [27] Harwood, A.J (1994), “Transformation of Bacteria by Electroporation”, Humana Press, 31 [28] Hashimoto, K., Tatsumi, N and Okuda, K (1989), “Introduction of phalloidin labelled with fluorescein isothiocyanate into living polymorphonuclear leukocytes by electroporation”, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 19(2–3), 143–153 [29] Holo, H and Nes, I.F (1989), “High-Frequency Transformation, by Electroporation, of Lactococcus lactis subsp cremoris Grown with Glycine in Tài liệu tham khảo Osmotically Stabilized Media”, Applied and Environmental Microbiology, 55(12), 3119–3123 [30] Jones, P.G., VanBogelen, R.A and Neidhardt, F.C (1987), “Induction of proteins in response to low temperature in Escherichia coli.”, Journal of Bacteriology, 169(5), 2092–2095 [31] Kim, A.Y and Blaschek, H.P (1989), “Construction of an Escherichia coliClostridium perfringens shuttle vector and plasmid transformation of Clostridium perfringens.”, Applied and Environmental Microbiology, 55(2), 360–365 [32] Kinosita, K and Tsong, T.T (1977), “Hemolysis of human erythrocytes by transient electric field.”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74(5), 1923–1927 [33] Luchansky, J.B., Muriana, P.M and Klaenhammer, T.R (1988), “Application of electroporation for transfer of plasmid DNA to Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Listeria, Pediococcus, Bacillus, Staphylococcus, Enterococcus and Propionibacterium”, Molecular Microbiology, 2(5), 637–646 [34] Lurquin, P.F (1997), “Gene transfer by electroporation”, Molecular Biotechnology, 7(1), 5–35 [35] Lu, Y.-P., Zhang, C., Lv, F.X., Bie, X.M and Lu, Z.-X (2012), “Study on the electro-transformation conditions of improving transformation efficiency for Bacillus subtilis”, Letters in Applied Microbiology, 55(1), 9–14 [36] Mack, M., van Loon, A.P and Hohmann, H.P (1998), “Regulation of riboflavin biosynthesis in Bacillus subtilis is affected by the activity of the flavokinase/flavin adenine dinucleotide synthetase encoded by ribC”, Journal of Bacteriology, 180(4), 950–955 [37] Morikawa, M (2006), “Beneficial biofilm formation by industrial bacteria Bacillus subtilis and related species”, Journal of Bioscience and Bioengineering, 101(1), 1– Tài liệu tham khảo [38] Nguyen, H.D., Nguyen, Q.A., Ferreira, R.C., Ferreira, L.C.S., Tran, L.T and Schumann, W (2005), “Construction of plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilis exhibiting full structural stability”, Plasmid, 54(3), 241–248 [39] Olubajo, B and Bacon, C.W (2008), “Electrotransformation of Bacillus mojavensis with fluorescent protein markers”, Journal of Microbiological Methods, 74(2–3), 102–105 [40] Park, S.F and Stewart, G.S.A.B (1990), “High-efficiency transformation of Listeria monocytogenes by electroporation of penicillin-treated cells”, Gene, 94(1), 129–132 [41] Phadtare, S (2004), “Recent developments in bacterial cold-shock response”, Current Issues in Molecular Biology, 6(2), 125–136 [42] Phan, T.T.P., Nguyen, H.D and Schumann, W (2006), “Novel plasmid-based expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis”, Protein Expression and Purification, 46(2), 189–195 [43] Potter, H (1988), “Electroporation in biology: Methods, applications, and instrumentation”, Analytical Biochemistry, 174(2), 361–373 [44] Powell, I.B., Achen, M.G., Hillier, A.J and Davidson, B.E (1988), “A Simple and Rapid Method for Genetic Transformation of Lactic Streptococci by Electroporation”, Applied and Environmental Microbiology, 54(3), 655–660 [45] Powell, I.B., Achen, M.G., Hillier, A.J and Davidson, B.E (1988), “A Simple and Rapid Method for Genetic Transformation of Lactic Streptococci by Electroporation”, Applied and Environmental Microbiology, 54(3), 655–660 [46] Rhodes, D and Hanson, A.D (1993), “Quaternary Ammonium and Tertiary Sulfonium Compounds in Higher Plants”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 44(1), 357–384 [47] Rittich, B and Španová, A (1996), “Electrotransformation of bacteria by plasmid DNAs: statistical evaluation of a model quantitatively describing the relationship Tài liệu tham khảo between the number of electrotransformants and DNA concentration”, Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 40(2), 233–238 [48] Schumann, W (2007), “Production of recombinant proteins in Bacillus subtilis.”, Advances in applied microbiology, 62, 137–89 [49] Schumann, W., Inouye, M and Phadtare, S (2008), Encyclopedia of Life Sciences, John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, UK [50] Schurter, W., Geiser, M and Mathé, D (1989), “Efficient transformation of Bacillus thuringiensis and B cereus via electroporation: Transformation of acrystalliferous strains with a cloned delta-endotoxin gene”, Molecular and General Genetics MGG, 218(1), 177–181 [51] Shark, K.B., Smith, F.D., Harpending, P.R., Rasmussen, J.L and Sanford, J.C (1991), “Biolistic transformation of a procaryote, Bacillus megaterium.”, Applied and Environmental Microbiology, 57(2), 480–485 [52] Sokoloski, J.A., Jastreboff, M.M., Bertino, J.R., Sartorelli, A.C and Narayanan, R (1986), “Introduction of deoxyribonucleoside triphosphates into intact cells by electroporation”, Analytical Biochemistry, 158(2), 272–277 [53] Stenger, D.A and Hui, S.W (1986), “Kinetics of ultrastructural changes during electrically induced fusion of human erythrocytes”, The Journal of Membrane Biology, 93(1), 43–53 [54] Swezey, R.R and Epel, D (1988), “Enzyme Stimulation upon Fertilization is Revealed in Electrically Permeabilized Sea Urchin Eggs”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 85(3), 812–816 [55] Tavares, G.A., Béguin, P and Alzari, P.M (1997), “The crystal structure of a type I cohesin domain at 1.7 Å resolution1”, Journal of Molecular Biology, 273(3), 701– 713 [56] Tsongalis, G.J., Lambert, W.C and Lambert, M.W (1990), “Electroporation of normal human DNA endonucleases into xeroderma pigmentosum cells corrects their DNA repair defect”, Carcinogenesis, 11(3), 499–503 Tài liệu tham khảo [57] Vehmaanperä, J (1989), “Transformation of Bacillus amyloliquefaciens by electroporation”, FEMS Microbiology Letters, 61(1–2), 165–169 [58] Whatmore, A.M., Chudek, J.A and Reed, R.H (1990), “The effects of osmotic upshock on the intracellular solute pools of Bacillus subtilis”, Journal of General Microbiology, 136(12), 2527–2535 [59] Wong, T.-K and Neumann, E (1982), “Electric field mediated gene transfer”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 107(2), 584–587 [60] Xue, G.-P., Johnson, J.S and Dalrymple, B.P (1999), “High osmolarity improves the electro-transformation efficiency of the gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis”, Journal of Microbiological Methods, 34(3), 183–191 [61] Zeigler, D.R., Prágai, Z., Rodriguez, S., Chevreux, B., Muffler, A., Albert, T., Bai, R., Wyss, M and Perkins, J.B (2008), “The Origins of 168, W23, and Other Bacillus subtilis Legacy Strains”, Journal of Bacteriology, 190(21), 6983–6995 [62] Zimmermann, U., Vienken, J and Pilwat, G (1980), “Development of drug carrier systems: Electrical field induced effects in cell membranes”, Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry, 116, 553–574 TÀI LIỆU TRÊN WEBSITE [63] http://vi.wikipedia.org/wiki/V%C3%A1ch_t%E1%BA%BF_b%C3%A0o [64] http://www.isciencemag.co.uk/blog/tasty-humans/attachment/bacillus-subtilis/ [65] http://xetnghiemdakhoa.com/diendan/showthread.php?tid=313 [66] http://www.btxonline.com/pages/faq.html [67] protopaslthttp://sivabio.50webs.com/dnacloning.htm Phần PHỤ LỤC Phụ lục 5.1 Giá trị OD600 nm chủng B subtilis 1012 môi trường LB có nồng độ sorbitol: 0; 0,25; 0,5; 0,75 M (Biểu đồ 3.1) OD600nm Thời gian(giờ) 0M 0,25 M 0,5 M 0,75 M 0,1 0,1 0,1 0,1 1,3 1,49 1,07 0,65 2 2,6 1,6 2,26 3,4 2,8 2,3 2,8 3,8 3,2 3,25 4,7 3,3 3,5 5,1 4,3 3,6 5,4 4,3 4,1 4,2 6,4 4,8 4,2 4,3 6,4 5,5 3,86 10 4,4 7,2 5,8 4,5 11 4,4 7,2 5,94 4,7 12 4,46 7,4 4,8 13 4,68 7,4 5,2 15 4,74 7,7 6,6 6,1 16 4,76 7,5 6,9 6,36 17 4,8 7,56 7,28 6,6 18 7,36 6,72 19 5,44 7,8 7,2 6,62 20 5,6 7,84 6,8 6,78 21 5,3 7,4 6,8 6,8 22 4,98 7 7,4 23 4,92 7,4 24 5,36 6,8 7,2 Phụ lục 5.2.Giá trị OD600 nm chủng B subtilis WB800N môi trường LB có nồng độ sorbitol: 0; 0,25; 0,5; 0,75 M (Biểu đồ 3.1) OD600nm Thời gian(giờ) 0M 0,25 M 0,5 M 0,75 M 0,05 0,05 0,05 0,05 1,12 1,13 0,5 1,64 1,96 1,99 1,2 2,3 2,35 2,04 1,82 2,54 2,9 2,37 2,1 2,61 3,3 2,4 2,2 2,87 3,9 2,55 2,34 3,46 4,1 2,9 2,47 3,9 4,8 3,3 2,8 5,1 3,5 3,1 10 4,3 5,6 3,8 3,5 11 4,4 3,7 12 4,4 6,2 4,1 3,65 13 4,5 6,6 4,4 3,78 15 4,55 6,8 4,49 3,77 16 4,56 6,92 4,55 3,82 17 4,4 4,83 4,3 18 4,6 4,5 19 4,8 7,2 4,7 20 4,7 6,8 5,2 4,9 21 5,2 22 6,8 23 5,2 5,8 5,14 24 5,4 Phụ lục 5.3.Gía trị OD600nm giai đoạn thu mẫu dịch nuôi cấy tế bào B subtilis 1012 B subtilis WB800N môi trường LB có nồng độ sorbitol: 0; 0,25; 0,5; 0,75 M xử lý lysozyme (Biểu đồ 3.2) Giai đoạn thu mẫu 0M 0,25 M 0,5 M 0,75 M 1,38 1,45 1,06 0,6 Giai đoạn thu mẫu 0M 0,25 M 0,5 M 0,75 M 1,22 1,88 1,4 0,5 B subtilis 1012 1,9 2,7 3,9 2,74 4,12 1,76 2,36 3,3 0,9 1,76 3,53 B subtilis WB800N 1,79 2,45 2,56 2,5 3,5 1,8 1,98 2,5 1,6 2,3 4,29 3,6 4,18 4,5 5,5 4,5 4,5 5,2 2,7 2,89 4,4 3,5 3,1 3,5 4,7 4,1 3,2 5.1.Gía trị OD600nm giai đoạn thu mẫu dịch nuôi cấy tế bào B subtilis 1012 B subtilis WB800N môi trường LB có nồng độ sorbitol: 0; 0,25; 0,5; 0,75 M, ủ lạnh 4oC (Biểu đồ 3.7) Giai đoạn thu mẫu 0M 0,25 M 0,5 M 0,75 M Giai đoạn thu mẫu 0M 0,25 M 0,5 M 0,75 M B subtilis 1012 1,46 2,12 1,88 2,8 3,7 1,23 2,13 2,68 0,8 1,35 2,35 B subtilis WB800N 1,12 1,64 2,3 1,13 1,96 2,35 1,99 2,04 0,5 1,2 1,82 3,3 4,6 2,9 2,6 3,8 4,9 3,6 4,3 5,5 3,3 4,5 5,9 4,6 3,6 2,54 2,9 2,37 2,1 2,61 3,3 2,4 2,2 2,87 3,9 2,55 2,34 3,46 4,1 2,9 2,47 Phụ lục 5.2.Tần suất biến nạp B subtilis 1012 B subtilis WB800N môi trường LB – 0,5 M sorbitol xử lý lysozyme theo giai đoạn tăng trưởng (Biểu đồ 3.3) Giai đoạn thu mẫu Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) Sai số Giai đoạn thu mẫu Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) Sai số B subtilis 1012 0,27 1,83 2,6 2,13 1,68 0,09 0,27 0,2 B subtilis WB800N 0,19 0,26 0,18 0,28 0,26 2,47 4,38 3,09 1,86 0,06 0,06 0,42 0,62 0,41 0,31 0,42 5.3.Tần suất biến nạp B subtilis 1012 B subtilis WB800N môi trường LB – 0,5 M sorbitol xử lý với nồng độ lysozyme (Biểu đồ 3.4) B subtilis 1012 Nồng độ lysozyme (µg/ml) 0,5 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 1,15 2,51 0,86 0,39 Sai số 0,05 0,01 0,16 0,01 B subtilis WB800N Nồng độ lysozyme (µg/ml) 0,5 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 2,97 4,41 1,88 0,62 Sai số 0,09 0,27 0,02 0,2 Phụ lục 5.4.Tần suất biến nạp B subtilis 1012 B subtilis WB800N môi trường LB – 0,5 M sorbitol xử lý lysozyme 1µg/ml 5, 10, 15, 20 phút (Biểu đồ 3.5) B subtilis 1012 Thời gian (phút) 10 15 20 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 0,41 2,59 2,95 0,59 Sai số 0,26 0,24 0,18 0,04 B subtilis WB800N Thời gian (phút) 10 15 20 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 1,05 4,67 5,99 0,84 Sai số 0,01 0,29 0,51 0,23 5.5.Tần suất biến nạp B subtilis 1012 B subtilis WB800N môi trường LB – 0,5 M sorbitol xử lý lysozyme điện biến nạp với dãy hiệu điện thế: 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV (Biểu đồ 3.6) B subtilis 1012 Hiệu điện (kV) 1,9 2,1 2,3 2,5 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 0,66 1,91 2,65 2,85 Sai số 0,1108 0,1603 0,3276 0,2475 B subtilis WB800N Hiệu điện (kV) 1,9 2,1 2,3 2,5 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 0,77 1,58 2,56 5,86 Sai số 0,0448 0,0495 0,0401 0,2404 Phụ lục 5.6 Tần suất biến nạp B subtilis 1012 B subtilis WB800N môi trường LB – 0,5 M sorbitol ủ lạnh 4oC theo giai đoạn tăng trưởng (Biểu đồ 3.8) B subtilis 1012 Giai đoạn thu mẫu Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) Sai sô 0 1,28 2,41 4,33 5,43 1,05 0 0,2676 0,2982 1,0918 0,4868 0,095 B subtilis WB800N Giai đoạn thu mẫu Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) Sai số 0,06 0,29 1,05 3,24 5,19 1,47 0,94 0,0603 0,0656 0,225 0,4394 0,6146 0,1539 0,2701 5.7.Tần suất biến nạp B subtilis 1012 B subtilis WB800N môi trường LB – 0,5 M sorbitol ủ lạnh 4oC 12; 24; 36; 48 (Biểu đồ 3.9) B subtilis 1012 Thời gian (giờ) 12 24 36 48 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 4,15 5,6 2,04 0,6 Sai số 0,1461 0,3818 0,0306 0,1344 B subtilis WB800N Thời gian (giờ) 12 24 36 48 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 3,6 5,65 3,06 1,32 Sai số 0,8532 0,6317 0,0495 0,693 Phụ lục 5.8.Tần suất biến nạp B subtilis 1012 B subtilis WB800N môi trường LB – 0,5 M sorbitol xử lý lysozyme điện biến nạp với dãy hiệu điện thế: 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV (Biểu đồ 3.10) B subtilis 1012 Hiệu điện (kV) 1,9 2,1 Tần suất biến nạp (x10 /µg DNA) 1,48 2,32 Sai số 0,1626 0,0707 B subtilis WB800N Hiệu điện (kV) 1,9 2,1 Tần suất biến nạp (x10 /µg DNA) 1,23 2,13 Sai số 0,0071 0,0189 2,3 2,76 0,1461 2,5 5,26 0,1367 2,3 3,78 0,3276 2,5 5,82 0,2946 5.9.Tần suất biến nạp B subtilis 1012 B subtilis WB800N điện biến nạp với pHT1068 pHT43 – amyQ (Biểu đồ 3.11) Tế bào xử lý lysozyme Plasmid pHT1068 pHT43 – amyQ Tần suất biến nạp B subtilis 1012 2,94 2,21 Tần suất biến nạp B subtilis WB800N 5,83 4,66 Sai số tần suất biến nạp B subtilis 1012 0,0988 0,2328 Sai số tần suất biến nạp B subtilis WB800N 0,2867 0,1766 Plasmid pHT1068 pHT43 – amyQ Tần suất biến nạp B subtilis 1012 5,6 3,54 Tần suất biến nạp B subtilis WB800N 5,79 4,93 Sai số tần suất biến nạp B subtilis 1012 0,2449 0,1144 Sai số tần suất biến nạp B subtilis WB800N 0,4247 0,7733 Tế bào ủ lạnh [...]... thuật đơn giản cho tần suất biến nạp cao và được sử dụng phổ biến cho nhiều loài vi khuẩn khác nhau Mặc dù điện biến nạp được sử dụng rộng rãi cho nhiều chủng vi khuẩn khác nhau nhưng việc sử dụng phương pháp biến nạp này cho B subtilis vẫn còn nhiều hạn chế và đặc biệt là vẫn chưa có nghiên cứu xây dựng quy trình điện biến nạp cho hai chủng B subtilis 1012 và B subtilis WB800N Đây là hai chủng được... tượng 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng tần suất biến nạp của phương pháp điện biến nạp Điện biến nạp là phương pháp cho hiệu quả biến nạp cao, tần suất biến nạp phụ thuộc vào nhiều yếu tố Do đó, để đạt được hiệu quả biến nạp tốt nhất cần tối ưu các yếu Trang 12 Tổng quan tố ảnh hưởng đến tần suất biến nạp như: đặc điểm của đối tượng biến nạp, môi trường tăng trưởng và biến nạp, hiệu điện thế trong quá trình xung... thí nghiệm cho các nghiên cứu và sản xuất protein tái tổ hợp Nguyên nhân chính cho vấn đề này là quy trình điện biến nạp vào các chủng B subtilis không ổn định giữa các chủng khác nhau, phụ thuộc vào đặc điểm tăng trưởng của từng chủng Do đó, luận văn tập trung vào Xây dựng các phương pháp điện biến nạp cho hai chủng B subtilis 1012 và B subtilis WB800N nhằm tìm ra điều kiện biến nạp cho tần suất... DNA vào tế bào B subtilis như sử dụng deoxiribonucleate, biến nạp qua protolast, xử lý với alkali hay biến nạp tự nhiên Hạn chế của các phương pháp này là tần suất biến nạp thấp và đòi hỏi một lượng DNA lớn cho một lần biến nạp, do đó muốn dòng hóa tạo plasmid tái tổ hợp trên B subtilis phải biến nạp qua trung gian E coli để thu được một lượng lớn DNA Phương pháp điện biến nạp là kỹ thuật đơn giản cho. ..Danh mục biểu đồ Biểu đồ 3.10: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012 và B subtilis WB800N trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol được ủ lạnh 12; 24; 36; 48 giờ 56 Biểu đồ 3.11: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 và pHT43 – amyQ vào B subtilis 1012 và B subtilis WB800N điện biến nạp theo hai phương pháp xử lý tế bào với lysozyme và ủ lạnh 4oC 58 Trang viii Danh mục... biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012 và B subtilis WB800N thu nhận ở 7 giai đoạn tăng trưởng khác nhau trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol và được xử lý lysozyme 39 Hình 3.2: Kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012 và B subtilis WB800N được xử lý với lysozyme nồng độ: 0,5; 1; 2; 4 µg/ml trong 10 phút 41 Hình 3.3: Kết quả điện biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012. .. subtilis Để sử dụng B subtilis cho nghiên cứu và sản xuất thì việc biến nạp vật chất di truyền vào B subtilis là bước quan trọng Hiện nay có một số phương pháp khác nhau đã được sử dụng để biến nạp DNA vào tế bào B subtilis như biến nạp tự nhiên, biến nạp qua protoplast hay điện biến nạp 1.2.1 Phương pháp biến nạp tự nhiên 1.2.1.1 Nguyên tắc Nhiều chủng B subtilis có khả năng hấp thu DNA ngoại lai trong... quả điện biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012 và B subtilis WB800N được ủ lạnh 4oC 12, 24, 36, 48 giờ 53 Hình 3.6: Kết quả PCR khuẩn lạc của B subtilis 1012 và B subtilis WB800N được biến nạp plasmid pHT1068, pHT43 – amyQ, pKTH10 60 Hình 3.7: Sự biểu hiện GFP trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B subtilis 1012 và B subtilis WB800N mang plasmid pHT1068 được điện biến nạp ... Cm của B subtilis 1012 và B subtilis WB800N mang plasmid pHT1068 được biến nạp theo phương pháp thông thường 61 Hình 3.9: Sự biểu hiện α-amylase trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B subtilis 1012 và B subtilis WB800N mang plasmid pHT43 – amyQ được điện biến nạp 62 Hình 3.10: Sự biểu hiện α-amylase trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B subtilis 1012 và B subtilis WB800N mang... nhược điểm Dựa vào đặc tính khả nạp tự nhiên của vi khuẩn B subtilis, nuôi cấy và thu nhận Trang 8 Tổng quan tế bào B subtilis vào giai đoạn tế bào có tính khả nạp Tế bào khả nạp có thể được bảo quản trong glycerol 15% và lưu trữ ở -80oC cho nhiều lần sử dụng Đây là phương pháp tương đối đơn giản và ít tốn kém Tuy nhiên, đối với phương pháp biến nạp dựa vào tính khả nạp tự nhiên của tế bào B subtilis có ... thiết để xây dựng quy trình điện biến nạp, áp dụng quy trình cho tất đối tượng 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng tần suất biến nạp phương pháp điện biến nạp Điện biến nạp phương pháp cho hiệu biến nạp cao,... quan trọng Hiện có số phương pháp khác sử dụng để biến nạp DNA vào tế bào B subtilis biến nạp tự nhiên, biến nạp qua protoplast hay điện biến nạp 1.2.1 Phương pháp biến nạp tự nhiên 1.2.1.1 Nguyên... điện biến nạp plasmid pHT1068 vào B subtilis 1012 B subtilis WB800N biến nạp với dãy hiệu điện 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV) 47 Hình 3.6: Kết PCR khuẩn lạc B subtilis 1012 B subtilis WB800N biến nạp