Tạp chí Khoa học số 35 (12-2018) TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐỒNG THÁP ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN PHỤ PHẨM CÁ TRA BẰNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS VÀ ỨNG DỤNG LÀM THỨC ĂN CHO GÀ TAM HOÀNG y Phan Uyên Nguyên(*), Trần Phương Lan(*) Tóm tắt Lượng lớn phụ phẩm sinh chế biến cá tra fillet nguy gây ô nhiễm môi trường tăng chi phí sản xuất yêu cầu phải xử lý Tận dụng phụ phẩm để phát triển sản phẩm giá trị gia tăng không giải vấn đề nan giải mà giúp tạo nhiều phúc lợi khác Trong nghiên cứu phụ phẩm cá tra thủy phân điều kiện pH = 5,72, Bacillus subtilis 1,25%, muối 5,18% cho dịch thủy phân có hàm lượng đạm cao (13,00 g/kg) Phối trộn dịch đạm với hỗn hợp cám gạo bột mì (7:3) theo tỉ lệ 8:2 để ni gà Tam hồng thấy khơng có khác biệt thức ăn phối chế thức ăn thương mại việc tăng trọng lượng gà Từ khóa: Bacillus subtilis, phụ phẩm cá, sản phẩm giá trị gia tăng, thức ăn cho gà, thủy phân Đặt vấn đề cho hiệu cao sản xuất Do đó, nghiên Theo hiệp hội chế biến xuất thủy sản cứu sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis thủy phân Việt Nam (VASEP), xuất phát từ việc nuôi cá tra phụ phẩm tạo dịch đạm theo phương pháp sinh tự phát nông dân, đến sản lượng cá tra học có nhiều ưu điểm: sử dụng nguồn phụ phẩm tăng nhanh Trong trình sản xuất cá tra fillet dồi từ địa phương để chế biến thức ăn cho gà, xuất thải lượng lớn phụ phẩm, tạo lượng protease lớn từ vi sinh vật khơng có cách giải lượng phụ phẩm cách tạo điều kiện thích hợp cho vi khuẩn Bacillus dẫn đến ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Từ subtilis sinh trưởng phát triển; sử dụng enzyme biểu đồ Hình cho thấy sản lượng từ năm 2001 protease trực tiếp qua khâu tinh sạch, đến 2009 tăng nhanh bắt đầu tương đối ổn định góp phần giảm chi phí sản xuất Nghiên cứu từ năm 2008 đến 2017 khảo sát điều kiện thủy phân phụ phẩm cá tra, tìm cơng thức phối chế thích hợp nhằm đạt hiệu cao chăn nuôi gà Phương pháp nghiên cứu 2.1 Địa điểm thời gian thực Thủy phân dịch đạm sấy thức ăn tiến hành Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học An Giang Tiến hành thử nghiệm nuôi gà ấp Hòa Tân, xã Tân Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp Hình Xuất cá tra Việt Nam từ năm 1997 đến năm 2017 2.2 Nguyên vật liệu Phụ phẩm thịt vụn cá lấy từ Công ty cổ Theo Nguyễn Thị Thủy, riêng Đồng sông Cửu Long lượng phụ phẩm cá tra thải phần Nam Việt với protein thô 59,3% chất béo môi trường khoảng 710 tấn/ ngày, dùng làm bột thô 1,2% (kết phân tích ba lần lặp lại) Gà Tam hồng mua từ sở trứng cá khơ, bột cá ướt [7], tận dụng làm thức ăn cho lợn… [6] Với lượng lớn phụ phẩm thải từ sản gia cầm Dũ Phát, địa 08/2 ấp Khánh xuất cá tra việc tận dụng để sản xuất thức ăn Nghĩa, xã Tân Khánh Đông, thành phố Sa Đéc, cho gà tạo sản phẩm giá trị gia tăng, giải tỉnh Đồng Tháp lượng lớn phụ phẩm cá tra từ nhà máy Chế phẩm vi khuẩn Bacillus subtilis dạng bột địa phương thải yêu cầu thiết Việc xử chứa 109 cfu/g chất khô xác định phương lý biện pháp sinh học biện pháp thường pháp đếm sống cung cấp Viện Nghiên lựa chọn thân thiện với mơi trường cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, lượng vi khuẩn bổ sung tính theo (*) Trường Đại học An Giang tỉ lệ phần trăm khối lượng dịch thủy phân 99 TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐỒNG THÁP 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Qui trình sản xuất dự kiến Hình Quy trình sản xuất dự kiến Xử lí sơ bộ: Phụ phẩm cá lấy từ nhà máy bẩn, cần rửa sạch, đồng thời giai đoạn phần mỡ cá loại bỏ nhiệt độ nước rửa thấp nhiệt độ nóng chảy mỡ cá nên phần mỡ lên loại bỏ, tiến hành xay nhuyễn tạo điều kiện tiếp xúc phụ phẩm cá với Bacillus subtilis enzyme thủy phân protein Sau cơng đoạn xử lí sơ q trình gia nhiệt nhằm tiêu diệt vi sinh vật gây hư hỏng có nguyên liệu Phối chế: Mỗi keo nhựa chứa hỗn hợp dịch thủy phân có khối lượng dao động từ 800 g đến 1000 g, gồm phụ phẩm cá tra nước phối trộn theo tỉ lệ 1:1 khối lượng, bổ sung Bacillus subtilis, muối, điều chỉnh pH HCl (0,1M) mục đích tạo mơi trường thích hợp cho thủy phân, trình thủy phân thực với điều kiện nhiệt độ môi trường, thời gian thủy phân khảo sát đến hàm lượng đạm amin sinh nhiều đạm amoniac thấp Thủy phân: Sau phối chế tạo mơi trường thích hợp cho Bacillus subtilis phát triển, trình sinh trưởng phát triển chúng sản sinh 100 Tạp chí Khoa học số 35 (12-2018) protease [3], tiến hành thủy phân phụ phẩm cá tra sau xử lý xong, suốt trình thủy phân thường xuyên kiểm tra hàm lượng đạm amin (2 ngày lấy mẫu phân tích lần), q trình thủy phân kết thúc xác định đạm amin khơng cịn tăng Phối trộn: Dịch thủy phân phối trộn với cám gạo:bột mì theo tỉ lệ 7:3 Với thành phần dinh dưỡng cám gạo theo phân tích Nguyễn Thị Mai Phương gồm: 12,7% protein, 18,4% lipid, 56,1% glucid tổng [4], giá thành thấp, nên cám gạo chọn bổ sung Bột mì có tác dụng cung cấp lượng glucid cần thiết đồng thời thành phần kết dính quan trọng trình ép viên sản phẩm Ép viên: Được tiến hành phương pháp ép trục vít để tạo cấu trúc đặc trưng cho sản phẩm, tiếp đến sấy đến độ ẩm thích hợp 13% nhằm hạn chế vi sinh vật phát triển, bảo quản sản phẩm lâu Thành phẩm đưa vào bao bì PE đem bảo quản Sấy: Tiến hành sấy nhiệt độ 65oC đến độ ẩm 13%, theo Lê Thị Kim Lợi (2010) với nhiệt độ độ ẩm lượng đạm không bị mất, độ ẩm phù hợp cho bảo quản thức ăn sản xuất thức ăn chăn nuôi [2] Bao gói: Sau q trình sấy, thức ăn đóng gói bảo quản bao PE, bảo quản nhiệt độ thường 2.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ vi khuẩn, pH muối đến trình thuỷ phân Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với nhân tố lần lặp lại có tổng số nghiệm thức 3x3x3=27 Nhân tố vi khuẩn bổ sung 0,5%, 1,0%, 1,5% (tính theo khối lượng), lượng muối biển 3%, 6%, 9% (tính theo khối lượng), pH điều chỉnh mức độ 4,5; 5,5; 6,5, thực bước lại theo quy trình 2.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát lượng dịch đạm bổ sung đến trình tăng trọng gà Tam hoàng Giống gà Tam hoàng chọn từ Sa Đéc (Đồng Tháp), thời gian khảo sát từ ngày tuổi đến 35 ngày tuổi, quy trình ni thực nghiêm ngặt, chuồng nhốt (ứng với nghiệm thức) quay theo hướng đơng diện tích 1,5 m x m Phòng bệnh: thường xuyên theo dõi phòng bệnh cho gà kế hoạch phòng bệnh sau: TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐỒNG THÁP ngày tuổi nhỏ lasota hệ 1; ngày tuổi nhỏ chủng đậu; 10 ngày tuổi nhỏ gum bô ro; 21 ngày nhỏ lasota hệ 2; 30 ngày tuổi tiêm phòng tụ huyết trùng; tháng tuổi tiêm Newcatson Bố trí thí nghiệm với nhân tố lần lặp lại có tổng số nghiệm thức 3x3=9, khảo sát tỉ lệ dịch đạm phối trộn so với hỗn hợp cám gạo, bột mì với mức 60% (thức ăn loại 1), 80% (thức ăn loại 2), 100% (thức ăn loại 3), đến q trình tăng trọng gà Tam hồng so sánh với thức ăn có bán thị trường có hàm lượng đạm 21% (thức ăn loại 4) 2.4 Phân tích liệu 2.4.1 Phương pháp thu thập xử lí số liệu Các thí nghiệm bố trí ba lần lặp lại, số liệu biểu thị giá trị trung bình Khi khảo sát cơng đoạn đầu, cố định thông số kĩ thuật công đoạn sau dựa số liệu tham khảo Lấy thông số tối ưu thí nghiệm trước làm sở cho thí nghiệm sau Số liệu thu thập phân tích Anova qua phép thử LSD mức ý nghĩa 95% phần mềm Statgraphic Centurion XVI, phần mềm Excel, Matcad 14,0 2.4.2 Phương pháp phân tích Phương pháp phân tích thành phần: Phân tích đạm tổng phương pháp Kjeldahl, xác định hàm lượng nitơ amoniac theo TCVN 3706 - 90, định lượng đạm formol phương pháp chuẩn độ, đạm amin = đạm formol - đạm amoniac, lipid xác định phương pháp Soxhlet theo TCVN 4884:2005 [5] Phân tích hàm lượng chất khơ phương pháp sấy đến khối lượng không đổi nhiệt độ 103oC ± 2oC theo TCVN 4326:2001 Đo pH với thiết bị pH kế điện tử (Schott Lab 850, Đức) Kết thảo luận 3.1 Khảo sát lượng Bacillus subtilis, pH muối đến trình thuỷ phân 3.1.1 Ảnh hưởng Bacillus subtilis bổ sung đến lượng đạm amoniac dịch thủy phân theo thời gian Hình cho thấy lượng đạm amoniac tăng dần theo thời gian thủy phân ba tỉ lệ 0,5%, 1,0%, 1,5% Tuy nhiên mật số Bacillus subtilis lớn chúng thúc đẩy nhanh trình thủy phân, ức chế vi khuẩn tạo amoniac nên mẫu có lượng amoniac thấp tương ứng tỉ lệ 1,0% 1,5%, mẫu có mật số Bacillus subtilis thấp (0,5%) lượng amoniac sinh nhiều khơng Tạp chí Khoa học số 35 (12-2018) có lợi cho q trình sản xuất thức ăn sau nên khơng chọn Hình Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng vi khuẩn đến lượng đạm amoniac (g/kg) Cả ba mức độ pH lượng đạm amoniac tăng dần, mức pH = 6,5 lượng đạm amoniac tạo thành nhiều hai mức pH cịn lại, mức pH khơng hạn chế xâm nhập vi sinh vật gây thối, làm cho phần đạm amin thành phần dinh dưỡng khác dịch thủy phân bị chuyển thành sản phẩm cấp thấp NH3, H2S, CO2, indol sản phẩm trung gian khác Hình Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến lượng đạm amoniac (g/kg) Ở ngày thủy phân thứ 8, khác biệt lượng đạm amoniac tạo thành mức pH 4,5 5,5 nhỏ, từ thấy hai mức pH thích hợp cho trình thủy phân mức pH 6,5 Hình ngày thủy phân thứ 8, lượng đạm amoniac cao nghiệm thức có tỉ lệ muối bổ sung 3% thấp tỉ lệ muối bổ sung cao 9% Đến ngày 12, lượng đạm amoniac nghiệm thức ba tỉ lệ muối bổ sung 101 Tạp chí Khoa học số 35 (12-2018) TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐỒNG THÁP tăng nhanh, cao tỉ lệ muối bổ sung 3% thấp tỉ lệ muối bổ sung 9% Kết lý giải hầu hết vi sinh vật không chịu nồng độ muối cao, khả hoạt động giảm Nồng độ muối bổ sung thấp khả tạp nhiễm vi sinh vật lạ cao làm cho lượng đạm amoniac dịch thủy phân tăng nhanh theo ngày thủy phân Do đó, nồng độ muối bổ sung 9% tạo thành sản phẩm cấp thấp, sản phẩm trung gian nồng độ muối bổ sung % % Vì lượng đạm amoniac tạo thành khơng có lợi cho việc tạo nhiều acid amin vi khuẩn gây thối phát triển Ở ngày thủy phân thứ 12 lượng đạm amin giảm ba mức độ pH, điều lượng đạm amin sinh chậm lượng đạm amoniac tạo thành, bên cạnh xảy thủy phân acid amin thành sản phẩm cấp thấp Bảng Hàm lượng đạm amin (g/kg) dịch thủy phân chịu tác động pH pH 4,5 5,5 6,5 1,69a 2,11a 1,81a Ngày thủy phân a 3,51 8,72a 5,89b 12,48b 3,13a 9,56a 12 7,48a 8,86b 7,82ab Ghi chú: Xem Bảng Bảng cho thấy tỉ lệ muối bổ sung thích hợp 6% nồng độ muối cao hạn chế phát triển Bacillus subtilis, nồng độ thấp gặp phải cạnh tranh với vi sinh vật tạp nhiễm làm giảm lượng đạm amin sinh Bảng Hàm lượng đạm amin (g/kg) dịch thủy phân chịu tác động tỉ lệ muối Hình Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng muối đến lượng đạm amoniac (g/kg) 3.1.2 Ảnh hưởng Bacillus subtilis, pH muối đến lượng đạm amin dịch thủy phân Bảng Hàm lượng đạm amin (g/kg) dịch thủy phân chịu tác động Bacillus subtilis Bacillus subtilis (%) 0,5 1,0 1,5 Ngày thủy phân 12 1,72a 1,86a 2,02a 4,57b 4,93b 3,02a 10,11ab 11,11b 9,54a 6,25a 9,29b 8,62b Ghi chú: Xem Bảng Ngày thủy phân 12 2,06a 1,80a 1,74a 2,99a 4,44b 5,09b 8,49a 11,33b 10,93b 7,13a 9,85b 7,18a Ghi chú: Số liệu trung bình ba lần lặp lại; số có ký tự cột biểu thị không khác biệt mức ý nghĩa 95% theo phép thử LSD Bảng cho thấy tỉ lệ Bacillus subtilis bổ sung nhiều lượng đạm amin tăng nhanh theo thời gian thủy phân, chủng Bacillus subtilis có khả sinh protease phân cắt protein thành acid amin [8] Kết cho thấy ngày thứ lượng acid amin sinh nhiều Ở pH = 5,5 thích hợp cho trình thủy phân nhất, pH nhỏ dẫn đến hạn chế phát triển Bacillus subtilis, nhiên pH cao 102 Tỉ lệ muối (%) Từ kết Bảng 1, 2, luợng đạm amin dịch thủy phân đạt cao vào ngày thủy phân thứ Tuy nhiên, kết tác động nhân tố riêng biệt nên chưa phải hàm luợng cao Do đó, cần xét đến tương tác ba nhân tố để tìm lượng đạm amin cao có dịch thuỷ phân Vì phương trình hồi quy nhiều chiều với tương tác ba nhân tố vi khuẩn, pH muối ngày thuỷ phân thứ tìm chương trình Statgraphics Centurion XVI: y = -4,18955*x3 + 6,38739*x1 - 18,826*x2 + 1,02727*x3*x1 + 6,04794*x1*x2 + 4,97086*x2*x3 - 0,936837*x1*x2*x3 - 0,115946*x32 - 1,15415*x12 - 5,50106*x22 (1) đó: y: lượng đạm amin sinh ra; x1: pH; x2: vi khuẩn; x3: lượng muối Taïp chí Khoa học số 35 (12-2018) TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐỒNG THÁP Với hệ số tuơng quan R2= 96,75% có nghĩa 96,75% thay đổi đạm amin ngày dịch thủy phân ảnh huởng ba nhân tố vi khuẩn, pH, muối đến tương tác chúng Cũng từ phương trình hồi quy (1), tiến hành lập mơ hình Solver tìm kết tối ưu lượng đạm sinh trình thủy phân với hàm mục tiêu lượng đạm amin sinh tối đa, điều kiện ràng buộc pH: 4,5 =< x1 =< 6,5; vi khuẩn: 0,5