Nghiên cứu điều kiện nuôi sinh khối vi tảo thalassiosira pseudonana để ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng

PHỤ LỤC 3: TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ, PHẢN ỨNG PCR NHÂN MỘT PHẦN GEN 18S rRNA, ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE, TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN Tách chiết ADN tổng số: ADN tổng s

PHỤ LỤC 1: DANH SÁCH CÁC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN 18S rRNA ĐÃ CÔNG BỐ TRÊN NGÂN HÀNG GEN (GENBANK) ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ

XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOẠI

1 T pseudonana CCAP 1085/12 KU900218.1 Woo (2008)

12 Phaeodactylum tricornutum FR744760.1 Guo và cộng sự (2015)

13 Stephanopyxis turris KJ671710.1 Guo và cộng sự (2015)

PHỤ LỤC 2: PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI VI TẢO

Sau khi pha môi trường xong cần bao gói cẩn thận và hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 15 phút, lấy ra để nguội và sử dụng Tùy vào từng quy mô nuôi T pseudonana để sử dụng hàm lượng dinh dưỡng phục vụ sản xuất hiệu quả, cần thực hiện pha theo công thức định lượng chính xác và chi tiết về hàm lượng, sử dụng sẽ cho hiệu quả cao mà giảm được chi phí trong sản xuất

2.1 Phương pháp sử dụng môi trường dinh dưỡng

Phương pháp sử dụng môi trường dinh dưỡng, có nhiều phương pháp sử dụng môi trường dinh dưỡng nhằm mang lại hiệu quả kinh tế trong nuôi sinh khối vi tảo để thu năng suất sinh khối cao Trong đó có 2 phương pháp cho hiệu quả cao:

Phương pháp sử dụng môi trường dinh dưỡng một lần: Đây là phương pháp đang được

áp dụng rộng rãi và đem lại hiệu quả cao Phương pháp này chỉ dùng một lần môi trường dinh dưỡng khi bắt đầu tiến hành nhân nuôi sinh khối vi tảo, hoà tan hàm lượng dinh dưỡng vào trong quy mô nuôi từ đầu vụ nuôi cho đến khi thu hoạch, chỉ cần thực hiện 1 lần duy nhất Nó sẽ cho hiệu quả cao, giảm được thời gian, ổn định được môi trường dinh dưỡng trong khi thực hiện sản xuất Hạn chế cơ bản của phương pháp này là không kiểm soát được mức hấp thụ dinh dưỡng của tế bào vi tảo theo thời gian nhất định Phương pháp

này được ứng dụng cho quy mô nuôi trong ống nghiệm, bình thủy tinh 0,25 L đến bể composite 3,5 m3

Phương pháp sử dụng môi trường dinh dưỡng nhiều lần: Phương pháp này phải tiến hành cho môi trường dinh dưỡng theo từng đợt và tiến hành sử dụng môi trường sau khi đã nhân giống, chia thành từng đợt Phương pháp này có giá trị thực tiễn là kiểm soát mức độ hấp thụ dinh dưỡng của chúng theo thời gian, kiểm soát được lượng môi trường cần sử dụng trong quá trình nuôi, vi tảo sử dụng triệt để dinh dưỡng trong môi trường nuôi, hạn chế dư thừa dinh dưỡng Tuy nhiên, phương pháp này có thể làm giảm hiệu quả kinh tế và đòi hỏi trình độ cao, chi phí cao, vì vậy chỉ dùng để nuôi một số vi tảo đặc trưng

2.2 Hàm lượng sử dụng môi trường dinh dưỡng

Ở quy mô phòng thí nghiệm: Ở quy mô này vi tảo cần nhiều dinh dưỡng để thích nghi

và sinh trưởng Sử dụng môi trường AGP 20% và silicate 30 µg/L với tỉ lệ 1 mL/L : 2 mL/L ở quy mô nuôi trong ống nghiệm đến bình thủy tinh 2 L

Ở quy mô pilot trong bể composite 0,2 - 3,5 m3: Vi tảo đang ở giai đoạn phát triển nhanh

về MĐTB và nhằm tiết kiệm chi phí sản xuất nên cần phải giảm hàm lượng môi trường nuôi Sử dụng môi trường AGP 20% và silicate 30 µg/L với tỉ lệ 1 mL/L : 2 mL/L

PHỤ LỤC 3: TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ, PHẢN ỨNG PCR NHÂN MỘT PHẦN GEN 18S rRNA, ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE, TINH SẠCH SẢN

PHẨM PCR VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN

Tách chiết ADN tổng số: ADN tổng số của các mẫu tảo được tách chiết nhờ sử dụng

ZR Plant/Seed ADN Mini Prep Kit với các bước như sau:

Chuẩn bị: Zymo - Spin IV - HRC Spin Filters (ống nắp màu xanh): bẻ cột, cho ống IV - HRC Spin Filter vào Collection tube Li tâm 9.000 vòng/phút trong 3 phút

Bước 1: Cho 150 mg mẫu (nghiền bằng N2 lỏng) vào ZR Bashing Bead Lysis tube Bổ sung thêm 750 µL Lysis solution;

Bước 2: Vontex trong 10 phút;

Bước 3: Li tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, 4oC;

Bước 4: Hút 400 µL pha trên sang ống Zymo - Spin IV Spin IV Spin Filter (nắp màu cam) Li tâm 9.000 vòng/ phút, ở 4oC;

Bước 5: Bổ sung 1.200 µL Plant/Seed ADN Binding Buffer vào ống Spin Filter ở bước

4 Bổ sung thêm 6 µL β - mecaptholethanol, mix đều;

Bước 6: Hút 800 µL hỗn hợp ở bước 5 vào cột Zymo - Spin IIC Li tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, ở ở 4oC;

Bước 7: Loại phần dịch trong ở Collection tube và lặp lại bước 6;

Bước 8: Bổ sung 200 µL ADN Pre - Wash Buffer vào cột Zymo - Spin IIC trong Collection tube mới Li tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, ở 4oC;

Bước 9: Bổ sung 500 µL Plant/Seed ADN Wash Buffer vào cột Zymo - Spin IIC Li tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, ở 4oC;

Bước 10: Chuyển lên cột Zymo - Spin IIC sang ống eppendorf 1,5 mL và bổ sung 70

µL ADN Elution Buffer vào cột Li tâm 12.000 vòng/phút để hòa tan ADN;

Bước 11: Chuyển phần ADN đã hòa tan sang ống IV - HRC Spin Filter, đặt trong ống eppendorf 1,5 mL Li tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, ở 4oC để hòa tan ADN;

Bước 12: Thu lấy ADN tổng số đã được tinh sạch phù hợp cho chạy PCR

Hàm lượng và chất lượng của ADN tổng số của các mẫu vi tảo được đo ở các bước sóng 260 và 280 nm trên máy quang phổ (Nanno Drop) và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%

Phản ứng PCR nhân một phần gen 18S rRNA: một phần gen 18S rRNA của mẫu Thalassiosira sp được khuếch đại nhờ phản ứng PCR với cặp mồi Primer F và R Sản phẩm PCR có kích thước dự kiến là 1.100 bp Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích là 20 L bao gồm 2 L ADN tổng số (50 - 100 ng/L), 2 L Green buffer (2X); 1 L Primer F (10 M), 1 L Primer R (10 M), 1,5 μL dNTP (2,5 mM), 0,5 μL MgCl2 (50 mM) và 0,5 μL Taq DNA Polymerase (2u/μL) và 11,5 μL H2O Chu trình nhiệt: bước 1:

94oC - 3 phút, bước 2: 94oC - 30 giây, bước 3: 55oC - 1 phút, bước 4: 72oC - 1 phút, bước 5: lặp lại 40 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4, bước 6: 72oC - 5 phút, bước 7: giữ sản phẩm ở

15oC cho tới khi sử dụng Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%

Điện di trên gel agarose: dựa trên đặc tính cấu trúc của các axít nucleic đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt (ở pH =7) nên khi chịu tác động của một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 0,8% và quan sát dưới đèn tử ngoại Tinh sạch sản phẩm PCR: sử dụng các cột tinh sạch, trên cột này được gắn các hạt có vai trò giữ lại phân tử ADN khi chúng đi qua nhờ liên kết thuận nghịch Sau đó, sử dụng các dung dịch bám màng và rửa màng để loại bỏ các tạp chất bám trên phân tử ADN Sản phẩm PCR được tinh sạch theo Gene JET Purification Kit của hãng Thermo Fisher Scientific

Xác định trình tự gen: một phần gen 18S rRNA được xác định trình tự nucleotide trên máy đọc trình tự tự động (ABI PRISM® 3100 - Avant Genetic Analyzer, USA) bằng cách

sử dụng bộ hóa chất chuẩn BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing ở Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mô tả các phần mềm sử dụng trong nghiên cứu: mẫu Thalassiosira sp được đọc trình

tự cả 2 chiều, các thông số về trình tự và chất lượng của trình tự được kiểm tra bằng phần mềm BioEdit Kết quả chỉ ra cho thấy, các peak đọc rõ ràng, không bị nhiễu Việc so sánh, đối chiếu trình tự của chiều đọc xuôi và chiều đọc ngược được tiến hành trên phần mềm ClustalX (1.81) nhằm xác định trình tự của đoạn gen 18S rRNA hoàn chỉnh Kết quả cho thấy chúng tôi đã thu được đoạn trình tự gen 18S rRNA của mẫu Thalassiosira sp có chiều dài 1007 bp Ngoài ra, để kiểm tra trình tự thu được xem có đúng thuộc chi Thalassiosira hay không, chúng tôi tiến hành kiểm tra trên ngân hàng gen (GenBank) bằng chương trình

BLAST Kết quả cho thấy đoạn trình tự thu được thuộc chi Thalassiosira có độ tương đồng rất lớn với các loài thuộc chi Thalassiosira

Sau khi thu được trình tự gen 18S rRNA của mẫu Thalassiosira sp., chúng tôi đã sử dụng chương trình phần mềm ClustalX (1.81) và MEGA7 để phân tích trình tự đó với 12 trình tự thuộc chi Thalassiosira và 3 trình tự của nhóm ngoại có quan hệ gần gũi với chi Thalassiosira Chương trình MEGA7 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) được phát triển với việc tích hợp các công cụ phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại tương đối mạnh, cho kết quả phân tích có độ tin cậy cao Trong chương trình này, chúng tôi sử dụng phương pháp Neigbour - Joining (NJ) với thuật giải Kimura 2 thông số (Kimura 2 parameter), giá trị Bootstrap là 1000 lần lặp lại và các thông số mặc định khác

để xây dựng cây phát sinh chủng loại đối với trình tự đoạn gen 18S rRNA của mẫu Thalassiosira sp Bên cạnh đó, chúng tôi cũng sử dụng chương trình DNASTAR để xác định tỉ lệ phần trăm tương đồng của từng cặp trình tự giữa các loài thuộc chi Thalassiosira,

tỉ lệ phần trăm tương đồng được thống kê dưới dạng ma trận tam giác trên và khoảng cách

di truyền được thống kê dưới dạng ma trận tam giác dưới Đồng thời cũng kiểm tra lại và

so sánh được cây phát sinh chủng loại được thực hiện bởi 2 chương trình DNASTAR và MEGA7

Kết quả đo nồng độ ADN tổng số

Bảng 3.1 Kết quả đo nồng độ ADN tổng số của mẫu Thalassiosira sp bằng máy

quang phổ NanoDrop (Thermo - Scientific, Mỹ)

Ghi chú: hệ số pha loãng ADN tổng số: 50 lần, pha loãng bằng nước chạy PCR

PHỤ LỤC 4: TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN 18S rRNA CỦA Thalassiosira sp

Thalassiosira sp (1007 bp)

TACCACATCCAAGGAAGGCGGCGCGTAAATTACCCAATACTGAAACAGTGAGGTAGTGACAATAAATAACAATGCCGGGCCTTTACAGGTCTGGCAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTAATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCTGGCAGGAGCGACCGGTCTCACACTCAGTGCGAGAACTCGTGTTGTCTCTGGCCATCCTTGGGGATATCCTGTTTGGCATTAAGTTGTCGGGCAGGGGATACCCATCGTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTTAAAGCAGGCTTATGCCAATATATTAGATAATAAGATAGGACCCTGGTACTATTTTGTTGGTTTGCGCACCGAATGATTAAAAGAGACAGGCGGGGCTATTCGTATTGCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTCTGCAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTAGCAAGG

ATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTCGGGATTGGCGGTTGTTTTTTGGCCAGCACCGTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGTGAGGACAGATTGAGAGTTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCGCCGCCTGCTAAATAGTTCTGCGAATGGTTTTTCATTGGCAAGAGCTTCTTAGAGGGACGTTCATTCTACAAGATGAAGGAAGATGGCGGCAATAACAGGTCTGTGATGCC

PHỤ LỤC 5: PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ NGUỒN NƯỚC BIỂN SỬ DỤNG TRONG CÁC THÍ NGHIỆM NUÔI SINH KHỐI VI TẢO, SẢN XUẤT GIỐNG

VÀ NUÔI THƯƠNG PHẨM TÔM THẺ CHÂN TRẮNG

Phương pháp chuẩn bị nguồn nước biển sử dụng trong các thí nghiệm nuôi sinh khối vi tảo: Nguồn nước biển sử dụng cho quy mô phòng thí nghiệm phải được lấy vào bình thủy tinh 2 L và tiến hành hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 15 phút, chờ nguội và lấy ra kiểm tra, đưa về nhiệt độ phòng, san ra ống nghiệm, bình thủy tinh (0,25 - 2 L) để tiến hành thí nghiệm Nguồn nước sử dụng cho quy mô pilot thì bơm trực tiếp từ bể dự trữ nước vào các quy mô nuôi trên bể composite (0,2 - 3,5 m3) Sau khi bơm vào các hệ thống diệt khuẩn nguồn nước bằng javel 30 ppm kết hợp sục khí 12 - 14 giờ, sử dụng sodium thiosulfate (Na2S2O3) 30 ppm để khử lượng javel dư trong các quy mô nuôi sinh khối T pseudonana nói trên

Chuẩn bị nguồn nước biển sử dụng trong sản xuất giống và nuôi thương phẩm TTCT đảm bảo các điều kiện môi trường: độ mặn 30 - 31‰, nhiệt độ 29 - 30oC, bổ sung 180 -

200 mg CaCO3/L và pH 7,9 - 8,2

PHỤ LỤC 6: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG KHÔ

Sinh khối khô tảo (SKK, g/l) được tính theo phương pháp sấy khô mẫu ở 105oC (Elliquot và cộng sự, 1934)được tiến hành như sau:

Bước 1: Sấy cốc cân ở 105oC trong 3 giờ Lấy cốc ra để nguội trong silicator (trong 30 phút) Cân khối lượng cốc và lặp lại cho đến khi khối lượng cốc không đổi, được m1 (g) Bước 2: Lấy 10 mL dịch tảo cho vào cốc đã sấy ở bước 1 và sấy tiếp ở 105oC trong 24 giờ Lấy ra để nguội trong silicator (30 phút), cân khối lượng cốc và sinh khối Lặp lại quá trình sấy đến khối lượng không đổi được m2 (g) Tiến hành tương tự với 10 mL môi trường nuôi (không có tảo) được m3 (g)

Bước 3: Tính trọng lượng khô của tảo theo công thức sau:

SKK (g/l) = (m2 - m1) - (m3 - m1) x 1.000

10 Trong đó: (m2 - m1) là khối lượng khô của (sinh khối tảo + môi trường)

(m3 - m1) là khối lượng khô của môi trường

PHỤ LỤC 7: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHLOROPHYLL A, B VÀ

CAROTENOIT

Bước 1: Lấy 5 mL dịch tảo lọc qua giấy GF/C bằng hệ thống lọc hút chân không Sau

đó giấy lọc có chứa sinh khối tảo được nghiền bằng cát thuỷ tinh để phá vỡ tế bào Nghiền cho đến khi tạo thành một hỗn hợp mịn

Bước 2: Bổ sung 5 mL axeton 90% vào hỗn hợp trên và đổ vào ống nghiệm (có quấn giấy bạc)

Bước 3: Lặp lại bước 2 để đảm bảo lấy hết được hỗn hợp dịch axeton có chứa sắc tố tảo

từ cối chày sứ

Bước 4: Lọc hỗn hợp ở bước 3 với hệ thống lọc hút chân không Thu phần dịch trong, định mức lên 10 mL bằng axeton 90% và chuyển dịch này vào ống nghiệm (có quấn giấy bạc);

Chú ý cần phải tiến hành các bước nêu trên trong tối và các dụng cụ phải được để trong

đá để giảm tối đa sự phá huỷ chlorophyll do tác dụng của ánh sáng

Bước 5: Đo OD của dịch chiết bằng máy đo quang phổ ở các bước sóng 665, 645, 630

và 480 nm (sử dụng axeton 90% làm blank) Ghi giá trị OD tương ứng với các bước sóng nêu trên

Bước 6: Tính hàm lượng sắc tố theo công thức đã được Strick Land và Person (1977) công bố như sau:

mg sắc tố/m3 (µg/l) = C/V Trong đó: V là lượng thể tích dịch tảo đem lọc (tính ra lít)

C: Giá trị nhận được từ các công thức sau:

C (chlorophyll a) = 11,6*E665 - 1,31*E645 - 0,14*E630

C (chlorophyll b) = 20,7*E645 - 4,34*E665 - 4,42*E630

C (total carotenoit) = 4,0*E480

Với Ei: là giá trị OD đo được ở bước sóng i

PHỤ LỤC 8: CÁC CÔNG ĐOẠN HOẠT HÓA GIỐNG Thalassiosira

pseudonana TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

(1) Cấy chuyển Thalassiosira pseudonana giống từ đĩa gốc sang các đĩa thí nghiệm

Tiêu chí để lựa chọn đĩa gốc (hình 8.1): quan sát bên ngoài bằng mắt thường xem có dấu hiệu bị nhiễm các loại nấm, đĩa sạch, đĩa được bọc cẩn thận, có mã số, được ghi ngày cấy chuyển đầy đủ và không có dấu hiệu sử dụng trước đó Quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần: chọn đĩa có các cụm tế bào và các tế bào đồng đều, đẹp và có màu sắc đặc trưng của các vi tảo nói trên

Phương pháp chuẩn bị đĩa agar:

Bước 1: Chuẩn bị nguồn nước biển để nấu agar có độ mặn 29 - 31‰; pH 7,5 - 8,5; 150 -

Bước 4: Quan sát agar sôi đều và nổi bọt màu trắng tắt máy nấu

Bước 5: San qua bình tam giác, tiến hành bọc bằng giấy bạc, sau đó đem hấp để tiệt trùng bằng nồi áp suất nhiệt độ đạt 121oC trong khoảng thời gian 15 phút

Bước 6: Lấy ra và chờ nhiệt độ của dung dịch agar hạ xuống còn 50 - 60oC, bổ sung môi trường AGP 20% với 4 mL/L đã được tiệt trùng, lắc đều dung dịch

Bước 7: Tiến hành san dung dịch agar vào đĩa petri khoảng 1/2 - 2/3 của đáy đĩa

Bước 8: Để agar đông lại và lật ngược đĩa trong tủ vô khuẩn sau một đêm có thể sử dụng để san giống vi tảo trên các đĩa này Các đĩa agar đã chuẩn bị nên sử dụng hết 1 lần

và trong ngày, không nên để quá lâu dễ nhiễm khuẩn

Kỹ thuật cấy Thalassiosira pseudonana trên đĩa thạch agar:

1 2 3 4 5

Hình 8.1 Sơ đồ cấy T pseudonana trên đĩa thạch agar

Kỹ thuật cấy T pseudonana từ ống nghiệm sang đĩa thạch agar (hình 8.1): Bước 1: Lấy thanh gạt bằng kim loại nhúng vào cồn 96o, sau đó hơ qua lửa cho đỏ rồi

để nguội Có thể thử thanh gạt lên da cổ tay, nếu còn nóng thì chưa sử dụng và loại bỏ thanh đã thử không dùng vì dễ nhiễm khuẩn

Bước 2: Đổ ống nghiệm chứa các vi tảo này vào đĩa thạch agar hoặc lấy thanh kim loại nhúng vào ống nghiệm có chúng sau đó tráng trên bề mặt đĩa thạch agar

Bước 3: Lấy thanh gạt bằng kim loại dàn đều khắp bề mặt thạch agar cho đến lúc bề mặt thạch khô

Bước 4: Lấy giấy parafilm bọc xung quanh vành đĩa vừa cấy các vi tảo nói trên lại, lật ngược đĩa để phần có thạch agar lên trên tiếp xúc với ánh sáng Các bước đều được thực hiện trong tủ vô trùng

Kỹ thuật cấy T pseudonana từ đĩa sang đĩa thạch agar:

Mục đích: San từ đĩa agar trước sang đĩa agar mới nhằm bảo quản tảo gốc, tránh các đĩa agar trước bị nhiễm hay có các tạp chất san qua đĩa agar mới nhằm tạo tảo gốc sạch và không nhiễm các tạp chất khác Với mục đích lưu giữ nguồn giống và kiểm tra giống vi tảo nói trên về các tiêu chí kỹ thuật của nguồn giống, việc làm này sẽ tạo nguồn giống ổn định

và giống khỏe cho việc sử dụng nuôi sinh khối trong các trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng

Bước 1: Lấy thanh gạt bằng kim loại nhúng vào cồn 96o, sau đó hơ qua lửa cho đỏ rồi

để nguội Có thể thử thanh gạt lên da cổ tay, nếu còn nóng thì chưa sử dụng và loại bỏ thanh đã thử không dùng vì dễ nhiễm khuẩn

Bước 2: Dùng thanh gạt bằng kim loại chọn 1 - 2 colony tảo đẹp (to và có màu vàng sẫm hoặc đen)

Bước 3: Cấy lên đĩa thạch agar mới theo 3 đường giống như ở hình 8.1 (từ 1 sang 2) Bước 4: Ghi mã số cho đĩa thạch agar và ngày cấy giống

Bước 5: Lấy giấy parafilm bọc xung quanh vành đĩa vừa cấy vi tảo này lại, lật ngược đĩa để phần có thạch agar lên trên tiếp xúc với ánh sáng Các bước đều được thực hiện trong tủ vô trùng

Bước 6: Đặt lên giàn nuôi và chiếu ánh sáng 24/24 giờ với CĐAS 5,0 - 5,5 klux, nhiệt

độ không khí 25 - 26oC

Sau thời gian 4 - 7 ngày nuôi trên đĩa thạch agar trở lên thì cần kiểm tra đĩa thường xuyên bằng mắt thường để loại bỏ các đĩa thạch có dấu hiệu nhiễm nấm lớn hoặc kiểm tra dưới kính hiển vi để loại bỏ các đĩa không đạt yêu cầu chỉ giữ lại các đĩa có giống T pseudonana đạt các tiêu chí kỹ thuật về nguồn giống Thời gian nuôi trên đĩa thạch agar, vi tảo nói trên sẽ phát triển tốt từ 7 - 14 ngày nuôi Kiểm tra dưới kính hiển vi các đĩa thạch agar có vi tảo này phát triển đều và đẹp, các tế bào sạch và không nhiễm khuẩn, tế bào không có dấu hiệu hoại tử thì sau đó cần chuyển ngay các đĩa đến khu vực hạn chế ánh sáng để vi tảo nói trên không bị già hóa ngay từ đĩa thạch Có thể cho các đĩa thạch agar vào các hộp đậy nắp kín và bảo quản bằng tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 8 - 12oC Trước khi đem ra sử dụng lại cần đưa các đĩa thạch agar trở lại môi trường ở điều kiện thường ít nhất

3 - 5 giờ để sử dụng nguồn giống hiệu quả tránh gây sốc các điều kiện môi trường cho vi tảo này

(2) Cấy chuyển mẫu Thalassiosira pseudonana từ đĩa petri sang ống nghiệm

Chúng tôi đã tinh sạch và lựa chọn nhiều phương pháp khác nhau với mục đích tiêu chuẩn hóa chất lượng nguồn giống T pseudonana Các kết quả thu được có độ lặp và cho thấy, vi tảo nói trên cần được thực hiện qua các công đoạn nuôi cấy bằng ống nghiệm và giữ giống thì sẽ cho phép có thể bảo quản vi tảo được lâu hơn Vi tảo này được chúng tôi nuôi với 3 mức là Original line (ống nghiệm gốc), Dilution line (mức lặp) và Production line (mức sản xuất)

Kỹ thuật cấy T pseudonana ở mức Original line:

Mục đích: Tạo nguồn giống thuần và tăng thêm thời gian bảo quản và lưu trữ nguồn giống cho các trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng Tiêu chuẩn hóa sơ cấp nguồn giống

vi tảo nói trên ngay từ trong các ống nghiệm gốc Thời gian làm giống gốc mới ở mức nuôi này thường khoảng 3 - 7 ngày

Bước 1: Lấy thanh gạt bằng kim loại nhúng vào cồn 96o, sau đó hơ qua lửa cho đỏ rồi

để nguội Có thể thử thanh gạt lên da cổ tay, nếu còn nóng thì chưa sử dụng và loại bỏ thanh đã thử không dùng vì dễ nhiễm khuẩn

Bước 2: Chọn và lấy colony đẹp từ đĩa tảo gốc và thuần cho vào ống nghiệm khoảng 8

mL đã bổ sung môi trường AGP 20%, đánh tan để tế bào lan đều trong nước, rồi hơ miệng

và nắp ống nghiệm qua đèn cồn sau đó đậy nắp, cho vào giá để ống nghiệm

Bước 3: Ghi mã số cho ống nghiệm và ngày nhân giống

Bước 4: Đặt lên giàn nuôi và chiếu ánh sáng 24/24 giờ với CĐAS 5,0 - 5,5 klux, nhiệt

độ không khí 25 - 26oC

Sau thời gian 3 - 4 ngày nuôi trong ống nghiệm ở mức Original line trở lên cần kiểm tra thường xuyên bằng cách quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần: có các cụm tế bào và tế bào đồng đều, đẹp, tế bào hoàn chỉnh, không có tạp chất và có màu sắc đặc trưng của vi tảo này và số lượng tế bào đang ở giai đoạn phân chia tế bào khoảng 10 - 15% để nhân giống ở mức tiếp theo, loại bỏ các ống nghiệm không đạt yêu cầu chỉ giữ lại các ống nghiệm có giống vi tảo nói trên đạt các tiêu chí kỹ thuật về nguồn giống Thời gian nuôi trong ống nghiệm ở vi tảo này ở mức Original line phát triển từ 3 - 4 ngày Kiểm tra dưới kính hiển vi các ống nghiệm ở mức Original line của chúng thấy tế bào phát triển đều và đẹp, các tế bào sạch và không nhiễm khuẩn, tế bào không có dấu hiệu hoại tử thì cần chuyển ngay các ống nghiệm đến khu vực hạn chế ánh sáng để vi tảo này không phát triển quá mức Sử dụng các ống nghiệm ở mức Original line để đem nhân nuôi ở mức Dilution line

Kỹ thuật cấy T pseudonana ở mức Dilution line:

Mục đích: Tạo thêm nguồn giống thuần và tăng thêm thời gian bảo quản và lưu trữ nguồn giống cho các trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng Tiêu chuẩn hóa sơ cấp nguồn giống ngay từ trong các ống nghiệm gốc Tăng gấp 3 lần lượng giống gốc ban đầu Thời gian nhân giống gốc mới ở mức nuôi này thường kéo dài khoảng 3 - 4 ngày

Bước 1: Sử dụng pipet hút nước biển được tiệt trùng đã bổ sung môi trường AGP 20% cho vào ống nghiệm 10 mL, hút vào 3 loại ống gọi các ống nghiệm lần lượt là X, X’ và X’’

Bước 2: Hút vi tảo nói trên ở ống nghiệm Original line với thể tích 1 mL cho vào ống nghiệm thứ nhất (ống nghiệm X), lắc ống nghiệm X nhẹ bằng máy lắc để tế bào lan đều

trong nước, rồi hơ miệng và nắp ống nghiệm qua đèn cồn sau đó đậy nắp, cho vào giá để ống nghiệm

Bước 3: Hút vi tảo này ở ống nghiệm X với thể tích 1 mL cho vào ống nghiệm thứ hai (ống nghiệm X’), lắc ống nghiệm X’ nhẹ bằng máy lắc để tế bào lan đều trong nước, rồi hơ miệng và nắp ống nghiệm qua đèn cồn sau đó đậy nắp, cho vào giá để ống nghiệm

Bước 4: Hút vi tảo nói trên ở ống nghiệm X’ với thể tích 1 mL cho vào ống nghiệm thứ

ba (ống nghiệm X’’), lắc ống nghiệm X’’ nhẹ bằng máy lắc để tế bào lan đều trong nước, rồi hơ miệng và nắp ống nghiệm qua đèn cồn sau đó đậy nắp, cho vào giá để ống nghiệm Bước 5: Ghi mã số cho ống nghiệm và ngày nhân giống

Bước 6: Đặt tất cả các ống nghiệm lên giàn nuôi và chiếu ánh sáng 24/24 giờ với CĐAS 5,0 - 5,5 klux, nhiệt độ không khí 25 - 26oC

Sau thời gian nuôi trong ống nghiệm X (2 ngày), X’ (3 ngày), X’’ (4 ngày) trở lên cần kiểm tra thường xuyên tình trạng tảo bằng cách quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần: có các cụm tế bào và tế bào đồng đều, đẹp, tế bào hoàn chỉnh, không bị nhiễm tạp chất

và có màu sắc đặc trưng của vi tảo này và số lượng tế bào đang ở giai đoạn phân chia tế bào khoảng 15 - 25% để nhân giống ở mức tiếp theo, loại bỏ các ống nghiệm không đạt yêu cầu và chỉ giữ lại các ống nghiệm có giống vi tảo nói trên đạt các tiêu chí kỹ thuật về nguồn giống Kiểm tra dưới kính hiển vi các ống nghiệm X, X’, X’’ Nếu thấy chúng phát triển đều và đẹp, các tế bào sạch và không nhiễm khuẩn, tế bào không có dấu hiệu hoại tử thì cần chuyển ngay các ống nghiệm đến khu vực có hạn chế ánh sáng để chúng không phát triển quá mức Sử dụng các ống nghiệm X, X’, X’’ ở mức Dilution line để đem nhân nuôi ở mức Production line

Kỹ thuật cấy T pseudonana ở mức Production line:

Mục đích: Tạo nguồn giống vi tảo nói trên dùng cho việc sản xuất sinh khối trong các trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng Tiêu chuẩn hóa sơ cấp nguồn giống này ngay từ trong các ống nghiệm ở mức sản xuất Thời gian nhân nuôi giống gốc mới ở mức nuôi này thường khoảng 2 - 3 ngày

Bước 1: Sử dụng pipet hút nước biển được tiệt trùng đã bổ sung môi trường AGP 20% cho vào ống nghiệm 8 mL

Bước 2: Hút vi tảo này ở ống nghiệm X, X’, X’’ (Dilution line) với thể tích 1 mL cho vào ống nghiệm Production line, lắc ống nghiệm Production line nhẹ bằng máy lắc để tế bào lan đều trong nước, rồi hơ miệng và nắp ống nghiệm qua đèn cồn sau đó đậy nắp, cho vào giá để ống nghiệm

Bước 5: Ghi mã số cho ống nghiệm và ngày nhân giống

Bước 6: Đặt các ống nghiệm lên giàn nuôi và chiếu ánh sáng 24/24 giờ với CĐAS 5,0 - 5,5 klux, nhiệt độ không khí 25 - 26oC

Sau thời gian 2 ngày nuôi trong ống nghiệm Production line cần kiểm tra thường xuyên bằng cách quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần có các cụm tế bào và tế bào đồng đều, đẹp, tế bào hoàn chỉnh, không có tạp chất và có màu sắc đặc trưng của vi tảo này và

số lượng tế bào đang ở giai đoạn phân chia tế bào khoảng 20 - 30% để nhân giống ở mức sản xuất, loại bỏ các ống nghiệm không đạt yêu cầu và chỉ giữ lại các ống nghiệm có giống đạt các tiêu chí kỹ thuật về nguồn giống để sản xuất sinh khối Sử dụng các ống nghiệm ở

mức Production line để đem nhân nuôi sinh khối Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng các ống nghiệm Production line làm nguồn giống phục vụ nghiên cứu và nuôi sinh khối để thử nghiệm trong sản xuất giống tôm thẻ chân trắng

PHỤ LỤC 9: MẬT ĐỘ TẾ BÀO CỦA Thalassiosira pseudonana Ở BỂ

là giá trị TB ± SD; đơn vị tính x 106 TB/mL

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu khác nhau lên sinh trưởng của T pseudonana

12 0,37 ± 0,03 0,38 ± 0,03 0,39 ± 0,02 0,42 ± 0,02 0,28 ± 0,02

13 0,27 ± 0,02 0,28 ± 0,02 0,33 ± 0,02 0,39 ± 0,01 0,23 ± 0,04

14 0,15 ± 0,03 0,24 ± 0,03 0,28 ± 0,01 0,32 ± 0,02 0,16 ± 0,02 Ghi chú: Số liệu thu được ở trên bảng là kết quả của mỗi công thức được lặp lại 3 lần; MĐTB

16 PHỤ LỤC 10: HÌNH ẢNH MINH HỌA BỐ TRÍ CÁC THÍ NGHIỆM CỦA Thalassiosira pseudonana

PHỤ LỤC 11: HÌNH ẢNH CÁC QUY MÔ NUÔI TRỒNG Thalassiosira

pseudonana Trong công trình nghiên cứu này chúng tôi đã thiết kế và vận hành các quy mô nuôi trồng khác nhau để nuôi trồng T pseudonana thành công, sinh khối tươi được thu hoạch để làm thức ăn tươi sống cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng Kết quả của các quy mô nuôi trồng được trình bày ở trên hình 11.1

Hình 11.1 Hình ảnh nhân nuôi của T pseudonana ở các quy mô khác nhau

(A): đĩa thạch, (B): Ảnh tế bào dưới kính hiển vi quang học nuôi trong đĩa, (C): ống

nghiệm, (D): bình thủy tinh 0,25 L, (E): bình thủy tinh 1 L, (F): bình thủy tinh 2 L, (G): bể composite 0,2 m3, (H, I): bể composite 1 m3, (K, L, M): bể composite 3,5 m3

PHỤ LỤC 12: QUY TRÌNH THU HOẠCH Thalassiosira pseudonana Ở

QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ PILOT

Mục đích thu hoạch sinh khối của chúng tôi là để làm thức ăn tươi trong trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng đạt hiệu quả cao Phương pháp thu hoạch phải đáp ứng các yêu cầu đơn giản, nhanh chóng, năng suất lớn và làm như thế nào để giữ nguyên được sinh khối tươi sạch, tế bào tảo ổn định, tránh làm hỏng, gãy, vỡ tế bào ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm thu được làm giảm chất lượng của thức ăn Xác định đây là một thách thức lớn trong việc nuôi trồng vi tảo trên quy mô lớn là việc thu hoạch vi tảo bởi MĐTB tảo thấp (chỉ khoảng 0,5 g/L đối với hệ thống nuôi hở), kích thước tế bào của T pseudonana (4 - 5 µm) bé là một trong những vấn đề gây khó khăn cho việc thu hoạch tảo ngoại trừ những loài có kích thước lớn như S platensis (Van và cộng sự, 2013) Ngoài ra, phân tách và thu hồi sinh khối tảo từ môi trường nuôi là một bước rất quan trọng trong quy trình sản xuất sinh khối tảo cho nhiều mục đích khác nhau và bước này chiếm 20 - 30% giá thành sản xuất tảo (Uduman và cộng sự, 2010) Do vậy, công nghệ về thu hoạch tảo luôn được đầu tư nghiên cứu và tìm kiếm hướng tính ổn định cao Việc lựa chọn phương pháp thu hoạch thích hợp phụ thuộc vào các đặc tính của vi tảo chẳng hạn như MĐTB, kích thước cũng như yêu cầu của các sản phẩm đầu

ra (Brennan và cộng sự, 2010; Bilad và cộng sự, 2014) Nhìn chung, quá trình thu hoạch vi tảo

có thể được chia thành hai bước bao gồm việc thu hoạch tảo từ lượng thể tích lớn bằng cách sử dụng phương pháp keo tụ, tuyển nổi, hoặc lắng trọng lực Bằng phương pháp này, tổng số chất rắn có thể đạt 2 - 7% Sau đó là bước làm đặc với mục đích là cô đặc dịch tảo thu được thành dạng bùn nhão bằng cách lọc và li tâm Bước này cần nhiều năng lượng hơn bước thu hoạch từ lượng lớn (Brennan và cộng sự, 2010)

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng máy bơm để thu sinh khối tươi sống và cung cấp trực tiếp vào trong bể ương nuôi ấu trùng tôm thẻ chân trắng Dưới đây là các bước thu hoạch sinh khối tươi sống của T pseudonana trong trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng của chúng tôi đang áp dụng:

(1) Chuẩn bị hệ thống máy bơm

Hệ thống máy bơm được vệ sinh sạch sẽ bao gồm cả vệ sinh hệ thống ống dẫn Φ60 mm bằng cách bơm qua nước có chứa chất diệt khuẩn 1 lần, bơm lại bằng nước ngọt 1 - 2 lần

và tiến hành xả hết nước trong ống với khí đã diệt khuẩn Phải đảm bảo rằng các ống dẫn tảo tươi sống đã được vệ sinh sạch sẽ nhằm loại bỏ các tác động không mong muốn từ bên ngoài môi trường lẫn vào trong sinh khối tảo thu được

(3) Cho bơm vào hệ thống nuôi

Cho bơm vào hệ thống nuôi nhẹ nhàng, tránh tác động mạnh gây vỡ, gãy tế bào của tảo

sẽ làm giảm chất lượng đáng kể của sinh khối thu được

(4) Bơm trực tiếp vào bể ương ấu trùng tôm thẻ chân trắng

Bể ương ấu trùng được chuẩn bị nước biển sạch đã qua xử lý trước đó, để bơm tảo vào nuôi cùng với ấu trùng tôm thẻ chân trắng để giúp chúng sử dụng thức ăn có hiệu suất cao Đây là kỹ thuật nuôi cùng một bể có tảo và ấu trùng tôm, cả hai đối tượng này sẽ hỗ trợ nhau phát triển và góp phần có tính ổn định trong môi trường nước nuôi Tảo phát triển giúp tôm sử dụng làm thức ăn, phân thải của tôm cũng có thể là nguồn dinh dưỡng để tảo phân chia và sinh trưởng, bởi vì trong nghiên cứu chúng tôi đã quan sát trong quá trình nuôi trồng vi tảo nói trên từ khi bơm vào bể ương tôm cho đến khi kết thúc giai đoạn PL1kiểm tra thấy tế bào của tảo vẫn còn

(5) Vệ sinh sau khi kết thúc đợt thu hoạch

Sau khi việc thu hoạch kết thúc chúng tôi tiến hành vệ sinh máy bơm, vệ sinh ống dẫn tảo Φ60 mm và làm tương tự như khâu chuẩn bị Sau đó hệ thống ống dẫn sẽ được ngâm hóa chất diệt khuẩn, hệ thống nuôi hở được vệ sinh sạch sẽ và phơi khô, chờ sử dụng lại

Trong công trình này, chúng tôi đã thu hoạch sinh khối của T pseudonana để nghiên cứu tính an toàn của sinh khối nuôi trồng được Việc thu hoạch đã được tiến hành thành công và lặp lại nhiều lần, chúng tôi xây dựng quy trình thu hoạch T pseudonana được trình bày ở hình 12.1

Bước 1: Cô đặc các tế bào tảo bằng chất kết bông hoặc lọc qua lưới lọc

T pseudonana có MĐTB ở các bình thủy tinh 1 - 2 L đạt 1,58 - 1,59 x 106 tb/mL; 0,68 - 1,18 x 106 tb/mL ở quy mô bể composite 0,2 - 3,5 m3 sẽ tiến hành thu hoạch toàn bộ dịch nuôi tảo Việc tiến hành thu hoạch tảo còn phụ thuộc vào trạng thái sinh lí của tế bào Nếu tế bào tảo

ở trạng thái sinh lí tốt, thu đúng pha thì việc thu hoạch tảo dễ dàng, đạt hiệu suất cao và chất lượng tốt Khi nuôi trồng vi tảo nói trên ở các bể hở lớn có sử dụng ánh sáng mặt trời thì nên tiến hành thu hoạch vào buổi sáng sớm có ánh sáng mặt trời do quá trình quang hướng động sau thời gian tối, tế bào tảo sẽ nổi lên trên bề mặt nước và việc thu hoạch sẽ dễ dàng hơn Nhiều công trình nghiên cứu cũng đã công bố cho thấy hàm lượng protein trong vi tảo nói chung và vi tảo này có giá trị cao hơn vào buổi sáng so với các thời điểm khác trong ngày

Hình 12.1 Quy trình thu hoạchT pseudonana

Vì tế bào của T pseudonana không có lông roi và kích thước bé nên nếu chúng ta có túi lọc có kích thước nhỏ hơn 5 µm thì có thể áp dụng cách thu sinh khối tảo này bằng cách dùng ống nhựa mềm Φ21 mm cho chảy từ từ bể nuôi ra các túi lọc Tuy nhiên, vì kích thước lỗ của túi lọc nhỏ hơn 5 µm nên việc lọc sẽ nhanh chóng bị giảm do túi lọc sẽ bị bít kín lỗ Do vậy, để tiến hành lọc được tốt thì định kỳ thay túi lọc 1 lần trong thời gian lọc từ

2 - 3 giờ sẽ cho hiệu quả nhanh và cao hơn Có thể tiến hành hai dãy lưới lọc có kích thước khác nhau Với hàng lưới thứ nhất có kích thước lỗ khoảng >10 µm nhằm giữ lại các phần không phải là T pseudonana Còn hàng lưới thứ hai có kích thước <5 µm sẽ cho phép lọc

được phần lớn tế bào của T pseudonana Tuy nhiên, đối với vi tảo nói trên thì việc sử dụng lọc tảo qua túi lọc nhìn chung không hiệu quả và khó thực hiện trên quy mô lớn vì tốc độ lọc tảo chậm, lưới dễ bị bít tắc Hiệu quả lọc theo phương pháp này chỉ đạt từ 40 - 55% Bước 2: Dịch tảo cô đặc (5 - 10% thể tích dịch ban đầu) thu được

Sau khi tủa bông bằng chitosan 0,4% axít axetic, dịch phía trên được xi phông loại nước chỉ giữ lại khoảng 5 - 10% thể tích dịch ban đầu hoặc tảo được giữ lại trên bề mặt túi lọc được gạt dồn vào trong ca nhựa loại 5 L có lót mặt trong là các túi vải có kích thước mắt lỗ là 2 - 5

µm Ca nhựa và túi vải này đều được khử trùng bằng cồn 70o để vô trùng tối đa

Bước 3: Li tâm loại nước thu dạng nhão (paste)

Sau khi dịch tảo cô đặc được thêm nước cất Sau đó, tiến hành li tâm loại nước nhằm thu tảo ở dạng nhão (li tâm 3000 vòng/phút, 5 phút)

Bước 4: Sấy khô tảo

Tùy thuộc vào quy mô sản xuất mà chúng ta có thể lựa chọn các phương pháp sấy khô phù hợp như sấy khô sinh khối tảo bằng điện, sử dụng các tủ sấy ở nhiệt độ <55oC, sấy khô sinh khối tảo dạng nhão bằng năng lượng ánh sáng mặt trời, sấy đông khô, sấy phun khô, sấy khô bằng nhiệt với phần tạo nhiệt bằng than đá, than tổ ong và bằng máy hút chân không

Trong nghiên cứu này, với mục đích sử dụng sinh khối khô của T pseudonana ở dạng viên để phục vụ nghiên cứu tính an toàn của sinh khối nuôi trồng được Chúng tôi đã sấy khô, đủ số lượng để thử nghiệm độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên các động vật thực nghiệm thành công

PHỤ LỤC 13: HÌNH ẢNH MINH HỌA THU HOẠCH SINH KHỐI

Thalassiosira pseudonana TƯƠI SỐNG