Đang tải... (xem toàn văn)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TRÙN QUẾ VÀ ỨNG DỤNG VÀO CHẾ PHẨM LÊN MEN TỪ VI KHUẨN BACILLUS SP TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HĨA Q TRÌNH THỦY PHÂN TRÙN QUẾ VÀ ỨNG DỤNG VÀO CHẾ PHẨM LÊN MEN TỪ VI KHUẨN BACILLUS SP TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI THỦY SẢN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : CN ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực MSSV: 1151110243 : TRẦN THỊ NHỚ Lớp: 11DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung đồ án thực hướng dẫn trực tiếp cô CN Đỗ Thị Tuyến Tôi cam đoan kết nghiên cứu đưa luận án dựa kết thu q trình thực đề tài, hồn tồn trung thực khơng chép kết nghiên cứu tác giả khác Nội dung đồ án có tham khảo sử dụng số thơng tin, tài liệu từ nguồn sách hay cơng trình nghiên cứu khác được trích dẫn rõ ràng liệt kê danh mục tài liệu tham khảo Nếu có vi phạm quy chế hay gian trá tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Sinh viên thực Trần Thị Nhớ Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc Ban Giám Hiệu thầy cô trường Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Mơi Trường tận tình truyền đạt kiến thức năm học tập trường tạo điều kiện cho thực tập để tích lũy kinh nghiệm cho cơng việc sau Để hồn thành tốt khóa luận tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô CN Đỗ Thị Tuyến tận tình hướng dẫn, giúp đỡ quan tâm, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh Học Nhiệt Đới cho phép tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Bên cạnh cố gắng thân, tơi thầm biết ơn ủng hộ, quan tâm động viên gia đình, bạn bè – người thân u ln chỗ dựa vững cho suốt thời gian qua Cuối tơi xin kính chúc q Thầy, Cô dồi sức khỏe thành công nghiệp cao q Đồng kính chúc Cơ, Chú, Anh, Chị Viện Sinh Học Nhiệt Đới dồi sức khỏe, đạt nhiều thành công tốt đẹp công việc Tôi xin chân thành cảm ơn! TP HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực Trần Thị Nhớ Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Danh mục chữ viết tắt v Danh mục hình vi Danh mục bảng vii Danh mục sơ đồ viii Danh mục đồ thị viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu 1.4 Phương pháp nghiên cứu 1.5 Kết cấu đồ án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát vi khuẩn Bacillus sp 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Đặc điểm chung chi Bacillus 2.1.3 Khả tạo bào tử 2.1.4 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp nuôi trồng thủy sản 2.1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp 2.2 Enzyme protease 2.2.1 Giới thiệu chung protease 2.2.2 Phân loại protease 10 2.2.3 Chức sinh học protease vi sinh vật 12 2.2.4 Môi trường phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease 13 2.2.5 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả sinh enzyme protease 15 2.2.6 Ứng dụng protease vi sinh vật 16 2.3 Trùn quế 17 2.3.1 Phân loại đặc điểm trùn quế 17 2.3.2 Đặc tính sinh học trùn quế 18 i Đồ án tốt nghiệp 2.3.3 Đặc tính sinh lý trùn quế 19 2.3.4 Sự sinh sản phát triển 20 2.3.5 Tác dụng trùn quế 20 2.3.6 Bổ sung Trùn quế BIO – T chăn nuôi 22 2.4 Chế phẩm probiotics 24 2.4.1 Định nghĩa Probiotics 24 2.4.2.Vai trò probiotics chăn nuôi thủy sản 24 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 26 3.2 Vật liệu, hóa chất dụng cụ nghiên cứu 26 3.2.1 Vật liệu 26 3.2.2 Hóa chất 27 3.2.3 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu 28 3.3 Môi trường phân lập, định danh giữ giống 28 3.4 Phương pháp nghiên cứu 29 3.4.1 Sơ đồ tổng quan thí nghiệm 29 3.4.2 Phương pháp phân lập Bacillus sp 30 3.4.2.1 Hoạt hóa giống Bacillus sp 30 3.4.2.2 Phân lập chủng Bacillus sp 30 3.4.2.3 Cấy giữ gống Bacillus sp 30 3.4.2.4 Tăng sinh chủng Bacillus sp 30 3.4.2.5 Xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc 31 3.4.3 Phương pháp định danh đặc điểm sinh lý, sinh hóa 31 3.4.3.1 Phương pháp nhuộm Gram 31 3.4.3.2 Test khả di động 33 3.4.3.3 Test catalase 33 3.4.3.4 Thử nghiệm khả sinh Indol 34 3.4.3.5 Thử nghiệm Methyl Red (MR) 35 3.4.3.6 Thử nghiệm khả sử dụng đường 36 ii Đồ án tốt nghiệp 3.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 36 3.4.4.1 Khả kháng khuẩn 36 3.4.4.2 Phương pháp định tính khả sinh enzyme protease 37 3.4.4.3 Phương pháp nuôi cấy môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease 37 3.4.4.4 Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme protease 38 3.4.5.Phương pháp xác định thành phần sinh hóa cho trùn quế 38 3.4.5.1 Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu 38 3.4.5.2 Phương pháp định lượng khoáng tổng số quang phổ kế 39 3.4.5.3 Phương pháp xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (định lượng Nitơ tổng số) 40 3.4.5.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease phương pháp Anson cải tiến 41 3.4.5.5 Phương pháp Lowry xác định hàm lượng acid amin 44 3.4.6 Khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động chế phẩm protease 45 3.4.6.1 Xác định nhiệt độ tối ưu 45 3.4.6.2 Xác định pH tối ưu 45 3.4.7 Khảo sát chọn lọc điều kiện thủy phân protein trùn quế 46 3.4.7.1 Khảo sát nồng độ chất 46 3.4.7.2 Khảo sát nồng độ enzyme 47 3.4.7.3 Khảo sát thời gian thủy phân 47 3.4.8 Phương pháp qui hoạch thực nghiệm 48 3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm xử lý số liệu 49 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 4.1 Kết phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp 50 4.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp từ chế phẩm Probiotic 50 4.1.2 Nhuộm Gram 52 4.1.3 Kiểm tra đặc tính sinh hóa 52 4.1.3.1 Khả di động 52 4.1.3.2 Khả sinh catalase 53 iii Đồ án tốt nghiệp 4.1.3.3 Khả sinh indol 54 4.1.3.4 Thử nghiệm methyl red 54 4.1.3.5 Khả lên men loại đường 55 4.2 Đánh giá hoạt tính sinh học 58 4.2.1 Đánh giá khả kháng khuẩn 59 4.2.2 Định tính khả sinh enzyme protease 59 4.3 Xác định thành phần sinh hóa trùn quế 60 4.4 Kết xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động enzyme thu từ chế phẩm 61 4.4.1 Kết xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động protease 61 4.4.2 Kết xác định pH tối ưu cho hoạt động protease 62 4.5 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất lên trình thủy phân 63 4.6 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme bổ sung vào trình thủy phân 65 4.7 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian lên trình thủy phân 67 4.8 Thủy phân trùn quế với điều kiện tối ưu chọn 70 4.9 Quy hoạch thực nghiệm 71 4.10 Đánh giá hiệu sản phẩm 77 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 5.1 Kết luận 78 5.2 Kiến nghị 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT OD Optical density UI Unit International MR Methyl red CFU Colonies Form Unit TCA Trichloroacetic acid EDTA Etilendiamin tetraaxetic axit NL Nguyên liệu CPE Chế phẩm enzyme v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Bacillus sp Hình 2.2 Quá trình tạo bào tử Hình 2.3 Cấu trúc 3D protease Hình 2.4 Trùn quế 18 Hình 2.5 Trùn quế chăn ni 22 Hình 3.1 Mẫu chế phẩm probiotic dùng để phân lập 26 Hình 3.2 Chủng Escherichiacoli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus – Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP HCM 27 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc phân lập từ mẫu 50 Hình 4.2 Hình ảnh nhuộm Gram chủng 1, 52 Hình 4.3 Kết thử khả di động chủng 1, 53 Hình 4.4 Kết thử khả tạo catalase chủng 1, 53 Hình 4.5 Kết thử nghiệm khả sinh indol chủng 1, 54 Hình 4.6 kết thử nghiệm methyl red chủng 1, 54 Hình 4.7 Kết thử khả lên men loại đường chủng 55 Hình 4.8 Kết thử khả lên men loại đường chủng 56 Hình 4.9 Kết thử khả lên men loại đường chủng 57 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Một số vi sinh vật có khả sinh tổng hợp protease 13 Bảng 2.2 Hàm lượng dinh dưỡng bột trùn bột cá 22 Bảng 3.1 Thí nghiệm dựng đường chuẩn Tyrosin 42 Bảng 3.2 Xác định hàm lượng Tyrosine dung dịch nghiên cứu 42 Bảng 3.3 Lập đường chuẩn Albumin 44 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ chất (% w/v) 46 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ enzyme (%) 47 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian thủy phân 48 Bảng 4.1 Kết phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ chế phẩm 51 Bảng 4.2 Kết thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng khảo sát 58 Bảng 4.3 Kết vòng tan xác định khả kháng khuẩn chủng 59 Bảng 4.4 Kết xác định vòng phân giải casein enzyme protease thu nhận từ chủng sau 48 59 Bảng 4.5 Thành phần sinh hóa thịt trùn quế dùng để thủy phân 60 Bảng 4.6 Điều kiện tối ưu cho trình thủy phân thịt trùn quế enzyme thương phẩm enzyme chế phẩm 70 Bảng 4.7 Kết so sánh tiêu hai sản phẩm thịt trùn sau thủy phân 70 Bảng 4.8 Mã hóa biến số thực nghiệm theo yếu tố ảnh hưởng 71 Bảng 4.9 Ma trận kế hoạch hóa yếu tố 71 Bảng 4.10 Kết hàm lượng acid amin theo thực nghiệm theo phương trình hồi quy 72 Bảng 4.11 Kết bj bij 73 Bảng 4.12 Xử lý số liệu tâm 73 Bảng 4.13 Bảng kiểm định Student 74 Bảng 4.14 Kết so sánh số tiêu tỷ lệ trộn 77 vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ phân loại protease 10 Sơ đồ 3.1 Q trình tiến hành thí nghiệm 29 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme chế phẩm 61 Đồ thị 4.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzyme chế phẩm 63 Đồ thị 4.3 Kết xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng độ chất khác 64 Đồ thị 4.4 Kết xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng độ enzyme khác 66 Đồ thị 4.5 Kết xác định hàm lượng acid amin sau qua trình thủy phân với mức thời gian khác 68 viii Đồ án tốt nghiệp Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme sản xuất ngày nhiều ứng dụng nhiều lĩnh vực đời sống người như: Công nghệp da, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế, yếu tố quan trọng trình thúc đẩy phát triển ngành chế biến thức ăn thủy sản Trong năm gần thủy sản trở thành kinh tế mũi nhọn nước ta, sản lượng thủy sản đáp ứng nhu cầu tiêu thụ nước mà xuất thị trường nước Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc Để tăng suất lợi nhuận người nuôi tăng mật độ giống, sử dụng thuốc hóa học để phịng trị bệnh làm xáo trộn hệ sinh học tự nhiên, ô nhiễm môi trường thêm vào ảnh hưởng đến chất lượng thủy sản Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ mơi trường sống khơng bị nhiễm hố chất độc hại, người ta hạn chế cấm sử dụng số loại thuốc, mà thay vào sản phẩm sinh học giúp tăng cường sức đề kháng bệnh, tăng khả hấp thụ dưỡng chất, hay làm môi trường nước cách bổ sung thêm vi sinh vật có lợi Chế phẩm sinh học hay gọi “probiotic” bao gồm vi sinh vật sống có lợi, có tính đối kháng cao đưa vào đường ruột tạo cân có lợi hệ sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật có hại Ngồi ra, chế phẩm sinh học cịn cải thiện tốt q trình tiêu hố (nhờ hệ enzyme vi sinh vật, sản phẩm chuyển hóa q trình lên men chúng), giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh Thêm vào đó, việc ứng dụng trùn quế vào thức ăn làm tăng hàm lượng đạm hữu thức ăn chăn nuôi hướng nghiên cứu nhận nhiều quan tâm nhà khoa học người chăn nuôi Với hàm lượng protein thô cao, hàm lượng đạm trùn tương đương với bột cá, thức ăn lý tưởng để nuôi thủy sản Trùn chứa nhiều loại acid amin,vitamin, chất khoáng cần thiết cho gia súc, gia cầm thủy sản Đặc biệt, thịt trùn cịn có loại kích thích tố sinh trưởng tự nhiên mà bột cá khơng có Thức ăn chăn ni có bột trùn khơng Đồ án tốt nghiệp có mùi khét cá dầu cá, hấp dẫn với vật ni, lại bảo quản lâu thức ăn có dùng bột cá Tuy nhiên protein có thịt trùn tươi thường khó tiêu hóa nên thủy phân protease mang lại nhiều ưu điểm như: Không độc hại, cắt đứt liên kết peptid tạo amino acid đơn giản giúp q trình tiêu hóa, hấp thụ tốt Vì vậy, chúng tơi thực đề tài “Tối ưu hóa q trình thủy phân trùn quế ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp thức ăn chăn ni thủy sản” 1.2 Mục đích nghiên cứu Chọn lọc chủng Bacillus sp có khả sinh enzyme protease cao Xác định điều kiện tối ưu cho trình thủy phân trùn quế enzyme protease để ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp 1.3 Nội dung nghiên cứu Phân lập chủng Bacillus sp từ chế phẩm thức ăn chăn nuôi thủy sản Xác định nhiệt độ pH tối ưu cho hoạt động enzyme protease Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein trùn quế enzyme protease: nồng độ chất, nồng độ enzyme thời gian thủy phân So sánh khả thủy phân enzyme protease thương phẩm enzyme protease từ chế phẩm lên men vi khuẩn Bacillus sp Tối ưu hóa thực nghiệm q trình thủy phân trùn quế 1.4 Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp như: phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, phương pháp phân tích xử lý số liệu phần mềm excel 2013 phần mềm statgraphics 1.5 Kết cấu đồ án Đồ án tốt nghiệp gồm chương: Chương 1: Mở đầu Chương 2: Tổng quan tài liệu Chương 3: Vật liệu phương pháp nghiên cứu Chương 4: Kết thảo luận Chương 5: Kết luận kiến nghị Đồ án tốt nghiệp Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát vi khuẩn Bacillus sp 2.1.1 Phân loại Bacillus có khả chịu đựng tồn thời gian dài điều kiện bất lợi, nên đa số chúng phổ biến phân lập từ nhiều nguồn Theo khóa phân loại Bergey, chi Bacillus phân loại sau: Giới: Bacteria Ngành: Fimicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Chi Bacillus chi lớn, đa dạng thuộc họ Bacillaceae Với số loài thường gặp tự nhiên như: Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus mensentericus, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, bacillus Brevis, Bacillus simplex, Hình 2.1 Bacillus sp (http://nuoitomsu.blogspot.com/2013/03/vai-tro-cua-vi-khuan-bacillussp-trong.html) Đồ án tốt nghiệp 2.1.2 Đặc điểm chung chi Bacillus (Nguyễn Thị Yến Thu, 2011) Vi khuẩn Bacillus chi gồm vi khuẩn hình que hay trực khuẩn, Gram (+), đường kính khoảng 0,2 – µm, dài – µm, thường dạng đơn chuỗi dài, chiều dài chúng phụ thuộc vào điều kiện mơi trường suốt q trình phát triển Phần lớn chủng vi khuẩn Bacillus có nhiệt độ sinh trưởng mức trung bình, với nhiệt độ tối ưu vào khoảng 35 – 45oC, có số chủng có nhiệt độ tối ưu cao khoảng 65oC Là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có khả sinh catalase, bất động hay di động nhờ tiêm mao, có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ, muối rộng, tồn điều kiện bất lợi thời gian dài số loài ưa lạnh sinh trưởng hình thành nội bào tử 0oC, pH sinh trưởng khác từ – 11 nên đa số chúng phổ biến tự nhiên phân lập từ nhiều nguồn khác như: đất, nước, thức ăn,… Hầu hết vi khuẩn hoại sinh, có mặt khắp nơi tự nhiên, phần lớn chúng cư trú đất Vi khuẩn Bacillus có khả sử dụng hợp chất hữu đơn giản đường, amino acid, acid hữu chuyển hóa nguồn carbon methanol, cellulose hay lên men hỗn hợp carbonhydrat tạo glycerol butanediol Các chủng Bacillus nghiên cứu nhiều có khả tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bào như: protease, amylase, cellulose, phytase, tùy thuộc vào nguồn chất khác sinh enzyme khác nguồn chất cellulose sinh tổng hợp enzyme cellulase, Nhiều số enzyme ngoại bào enzyme thủy phân phân tử hữu lớn, vi khuẩn có nhiều ứng dụng lĩnh vực khác công nghệ sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp thực phẩm, bánh kẹo, đồ uống, công nghệ dược phẩm, công nghệ thuộc da, công nghệ dệt xử lý chất thải 2.1.3 Khả tạo bào tử Một đặc điểm quan trọng Bacillus khả tạo bào tử điều kiện định Bào tử khơng hình thành suốt q trình hoạt động tăng trưởng phân chia tế bào, thường gặp điều kiện bất lợi môi trường, thiếu Đồ án tốt nghiệp dinh dưỡng,…thì nội bào tử hình thành Bào tử có hình oval có khuynh hướng phình đầu, đặc điểm cấu tạo đặc tính sinh lý nên bào tử cho dạng tồn bền vững tìm thấy tự nhiên tế bào, tồn lâu dài điều kiện khắc nghiệt Quá trình hình thành bào tử gồm bước: Hình thành vách ngăn Sự tạo tiền bào tử Tạo lớp vỏ bào tử Sự tổng hợp lớp vỏ bào tử Sự giải phóng bào tử Hình 2.2 Q trình tạo bào tử www.biol.lu.se/cellorgbiol/membprot/pop sv.html Lúc đầu lớp nguyên sinh chất tế bào sử dụng Tế bào chất nhân tập trung vị trí định tế bào Tế bào chất tiếp tục cô đặc tạo thành tiền bào tử (prospore) Tiền bào tử dần bao bọc lớp màng Tiền bào tử phát triển trở thành bào tử Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng phân giải bào tử giải phóng khỏi tế bào mẹ Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử hút nước bị trương Sau vỏ chúng bị phá huỷ bào tử nảy mầm phát Đồ án tốt nghiệp triển thành tế bào Mỗi tế bào sinh dưỡng tạo bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004) 2.1.4 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp nuôi trồng thủy sản Sự diện vi khuẩn Bacillus môi trường với số lượng lớn xảy cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống vi khuẩn nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh (trong 24 giờ) sử dụng phần lớn chất dinh dưỡng môi trường, đồng thời tạo số loại kháng sinh nên sinh trưởng nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Thuận, 1976) Triển vọng ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp nhiều lĩnh vực đời sống, đặc biệt nuôi trồng thủy sản to lớn Một số loài thuộc nhóm vi khuẩn Bacillus như: B subtilis, B aterrimus B niger, B pumilis, B panis, B vulgarus, B nigrificans, B natto, B licheniformis, B amyloliquefaciens, B megaterium, B mesentericus…đã ứng dụng ni trồng thủy sản với vai trị: Cải thiện sức khỏe, cung cấp nguồn dinh dưỡng trực tiếp hỗ trợ tiêu hóa Tăng cường phản ứng miễn dịch cải thiện môi trường nước phân hủy chất thải hữu cơ, giảm chất độc NH3 H2S, giảm chất dư thừa tích tụ đáy ao, giảm phát sinh khí độc mùi hôi Ức chế tác nhân gây bệnh cách tiết chất kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng môi trường sống Khả sinh enzyme phân hủy hợp chất hữu kiểm soát phát triển mức vi sinh vật gây bệnh (như vi khuẩn Vibrio) giữ cho môi trường ln trạng thái cân đặc tính trội nhóm vi khuẩn Trong q trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh hoạt chất có hoạt tính sinh học ứng dụng nhiều lĩnh vực Verschuere (2000) nghiên cứu cơng bố vi khuẩn Bacillus sp đóng vai trị quan trọng việc cải thiện chất lượng nước vi khuẩn đạt hiệu cao trình chuyển đổi vật chất hữu thành CO2 Do vậy, Bacillus sp làm giảm tích lũy chất hữu chất hịa tan (trích dẫn Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007) Một số lồi nhóm vi khuẩn Bacillus sp (B Subtilis, B Licheniformis, B Megaterium,…) dùng để làm Đồ án tốt nghiệp môi trường nhờ khả sinh enzyme (protease, amylase, cellulase, kitinase) phân hủy hợp chất hữu kiểm soát phát triển mức vi sinh vật gây bệnh chế cạnh tranh dinh dưỡng giữ cho môi trường trạng thái cân sinh học (Tăng Thị Chính, Đinh Thị Kim, 2006) Bacillus cịn có khả tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật phát triển mức Vibrio, Aeromnas,…(Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012) 2.1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp Vijayabaska et al (2008) ứng dụng thành công vi sinh vật có lợi mà cụ thể nhóm vi khuẩn Bacillus sp nuôi cá rô phi nhằm hạn chế mầm bệnh vi khuẩn A Hyrophila gây Sugama, Tsumura (1998) sử dụng chủng Bacillus BY – bổ sung vào bể (18 m3) nuôi ấu trùng tôm sú với mật độ 106 CFU/ml Kết cho thấy chủng vi khuẩn có khả ức chế vi khuẩn Vibrio harveji tỉ lệ sống tôm giai đoạn OL 10 bể bổ sung vi khuẩn đạt cao (46,1%) so với đối chứng (10,6%) Nghiên cứu Phạm Thị Tuyết Ngân (2011) quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm bùn đáy ao nuôi tôm sú cho thấy chất lượng nước ao nuôi cải thiện, đồng thời mật độ Vibrio nghiệm thức bổ sung Bacillus thấp so với đối chứng Graslund et al., cho thấy 86% người nuôi tôm Thái Lan sử dụng chế phẩm vi sinh dẫn xuất men vi sinh để cải thiện chất lượng nước bùn đáy ao ni (trích dẫn Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012) Ảnh hưởng chủng vi khuẩn Bacillus lên chất lượng nước mùn bã hữu bể nuôi tôm sú nghiên cứu Thí nghiệm gồm nghiệm thức bổ sung loài vi khuẩn Bacillus bao gồm Bacillus B8, B37 B38 với mật độ 105 CFU/ml đối chứng (không bổ sung vi khuẩn) Kết cho ta thấy tỉ lệ sống nghiệm thức B37 cao (93,33 ± 1,65%), đối chứng thấp (69,52 ± 1,65%) (p < 0,05) Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối chiều dài trọng lượng tôm cao B37 1,659 ± 0,034 mm/ngày 0,45 ± 0,02 g/ngày, nghiệm thức đối chứng thấp với số tương ứng 0,677 ± 0,017 mm/ngày 0,14 ± 0,01 g/ngày Như hiệu xử lí mơi trường chủng vi khuẩn bổ Đồ án tốt nghiệp sung khẳng định, hiệu xử lý tốt nghiệm thức dòng B37 (Phạm Thị Tuyết Ngân, Trương Quốc Phú, 2010) Theo tài liệu Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng Bacillus: Trong chăn nuôi: viện bào chế Pharimex viện Pasteur Nha Trang sản xuất chế phẩm Biousubtyl để trị bệnh tiêu chảy phân trắng heo Từ năm 1983 đến Viện Vaccin sở Đà Lạt sản xuất thuốc Biosubtyl dạng bột khô thuận tiện cho người sử dụng Ngồi ra, Bacillus subtilis cịn phối trộn với số chủng nấm mốc, nấm men số vi khuẩn khác dùng chế phẩm EM, Probiotic Trồng trọt: Bacillus subtilis ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae Ngồi cịn ứng dụng nhiều công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch Nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm Bactophyl (Bacillus subtilis) trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hố chất, Bộ Nơng Nghiệp TP HCM trừ loại nấm bệnh rau cải Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội sản xuất chế phẩm Subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh Ostrinia furnacalis bắp 2.2 Enzyme protease 2.2.1 Giới thiệu chung protease (Trần Thị Nhã Uyên, 2010) Hình 2.3 Cấu trúc 3D protease (http://www.hoahocngaynay.com/vi/nghien-cuu-giang-day/bai-nghiencuu/1241-ung-dung-enzyme-trong-nganh-cong-nghiep-.html) Đồ án tốt nghiệp Protease esterase thủy phân protein, chúng xúc tác cho trình thủy phân liên kết peptide CONH phân tử protein cắt liên kết peptide L acid amin thành acid amin tự do, peptide ngắn, pepton Protease cần thiết cho sinh vật sống, đa dạng chức từ mức độ tế bào, quan đến thể nên phân bố rộng rãi nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) động vật (gan, dày bê ) Tuy nhiên nguồn enzyme vi sinh vật phong phú nhất, có ưu điểm vi khuẩn, xạ khuẩn nấm mốc gia tăng sử dụng nguồn cung cấp protease cải thiện đáng kể hiệu sản xuất sản phẩm tạo nhiều Đặc biệt vi khuẩn nguồn sản xuất protease tương đối lí tưởng ưu điểm như: có hoạt tính mạnh với lượng nhỏ chuyển hóa lượng chất lớn, có cường độ sinh sản mạnh tổng hợp enzyme với tốc độ nhanh chóng, thời gian ngắn thu lượng lớn enzyme Hệ protease vi sinh vật hệ thống phức tạp bao gồm nhiều enzyme giống cấu trúc, khối lượng hình dạng phân tử nên khó tách dạng tinh thể đồng Cũng phức hệ gồm nhiều enzyme khác nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để đa dạng Một số protease ngoại bào sản xuất quy mô công nghiệp sử dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp khác nhau, nông nghiệp, y học Các lồi vi sinh vật có khả tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và số loài nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger…(Nguyễn Đức Lượng, 2004) Cơ chất tất loại protease phân tử protein gồm nhiều amino acid nối với liên kết peptide tạo nên hay nhiều chuỗi polypeptide có cấu trúc phức tạp chúng phân giải liên kết peptide tạo acid amin đơn giản, dễ hấp thu Các nguồn giàu protein như: thịt động vật, cá, trứng, đậu tương… ... giản giúp trình tiêu hóa, hấp thụ tốt Vì vậy, chúng tơi thực đề tài ? ?Tối ưu hóa q trình thủy phân trùn quế ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp thức ăn chăn nuôi thủy sản? ?? 1.2... enzyme vi sinh vật, sản phẩm chuyển hóa trình lên men chúng), giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh Thêm vào đó, vi? ??c ứng dụng trùn quế vào thức ăn làm tăng hàm lượng đạm hữu thức ăn chăn nuôi. .. enzyme thời gian thủy phân So sánh khả thủy phân enzyme protease thương phẩm enzyme protease từ chế phẩm lên men vi khuẩn Bacillus sp Tối ưu hóa thực nghiệm q trình thủy phân trùn quế 1.4 Phương