ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO TỚI TẾ BÀO VÀ DNA CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis BỊ CHIẾU XẠ TRẦN XUÂN AN, NGUYỄN THỊ THƠM, HOÀNG ĐĂNG SÁNG, NGUYỄN VĂN BÍNH, TRẦN BĂNG DIỆP Trung tâm c[.]
ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO TỚI TẾ BÀO VÀ DNA CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis BỊ CHIẾU XẠ TRẦN XUÂN AN, NGUYỄN THỊ THƠM, HOÀNG ĐĂNG SÁNG, NGUYỄN VĂN BÍNH, TRẦN BĂNG DIỆP Trung tâm chiếu xạ Hà Nội, km 12, Đường 32, Minh Khai - Bắc Từ Liêm - Hà Nội Email: ank55b1@gmail.com Tóm tắt: Dịch chiết từ nấm đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) phịng Nghiên cứu Cơng nghệ xạ - Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội phân lập, nuôi trồng sử dụng chất bảo vệ phóng xạ Chất lượng dịch chiết Cordyceps militaris đánh giá thơng qua hoạt tính chống oxy hóa phương pháp quét gốc tự DPPH Trong đó, ảnh hưởng dịch chiết tới khả làm giảm mức độ tổn thương gây xạ tia gamma tế bào DNA vi khuẩn Bacillus subtilis kết luận dựa khảo sát tỷ lệ sống sót tế bào vi khuẩn mơi trường có bổ sung dịch chiết nấm Cordyceps militaris kiểm tra mức độ đứt gãy DNA vi khuẩn Bacillus subtilis sau chiếu xạ phương pháp sinh học phân tử Từ khóa: Bacillus subtillis, bảo vệ phóng xạ, Cordyceps militaris I MỞ ĐẦU Con người thường xuyên tiếp xúc giới hạn an toàn với hai loại xạ: xạ tự nhiên xạ nhân tạo Mức độ gây tác hại phóng xạ phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc cường độ phóng xạ Tia gamma nói riêng, tia phóng xạ nói chung biết đến tác nhân gây đột biến cấp độ tế bào, DNA sai sót q trình sửa chữa DNA tự nhiên dẫn đến hình thành tế bào ung thư [1] Ảnh hưởng tia gamma lên tế bào DNA quan tâm nghiên cứu nhiều đối tượng khác nguyên bào sợi tế bào máu người [2,3], tế bào chuột, plasmid [2], tế bào dâu tây [4], Arabidopsis [5], Dưới tác dụng tia gamma, DNA có số biến đổi chủ yếu như: Đứt gãy mạch đơn phân tử DNA, làm phân tử DNA biến dạng, giảm thể tích phân tử; Đứt gãy mạch kép phân tử DNA, làm giảm độ nhớt dung dịch; Tạo nhánh, tạo cầu liên kết phân tử; Tạo dimer nucleotide pyrimidine (thymine cytosine), mà phổ biến tượng nhị trùng phân thymine-thymine Tất biến đổi ngăn cản chép DNA, hình thành đột biến phân tử DNA [2,3,4,5,6] Nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) loại nấm ký sinh nội bào, thuộc nhóm nấm Ascomycota Hiện có khoảng 500 lồi khác nhau, phân bố chủ yếu khu vực Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Châu Âu Châu Á Hiện nay, số loài nấm nuôi trồng thành công điều kiện nhân tạo để đáp ứng nhu cầu người dân điều trị bệnh nâng cao sức khỏe Chủng nấm Cordyceps militaris biết tới nguồn chất hỗ trợ tăng cường miễn dịch bảo vệ phóng xạ tiềm nhờ mang hoạt chất chống oxy hóa cao nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Jae-Won Ha cộng (2006), Kang HJ cộng (2015) có nghiên cứu khả tăng cường miễn dịch dịch chiết nấm Cordyceps militaris [7, 8] Đặc biệt, Jeong cộng (2014) công bố việc sử dụng nấm Cordyceps militaris chất bảo vệ phóng xạ, dịch chiết Cordyceps militaris có tác dụng bảo vệ chống lại phá hủy DNA xạ gây Theo nhóm tác giả này, dịch chiết Cordyceps militaris làm tăng hiệu loại bỏ gốc tự giảm chuỗi DNA plasmid gây xạ thử nghiệm in vitro [9] Nghiên cứu tập trung khảo sát ảnh hưởng dịch chiết nấm Cordyceps militaris nuôi cấy Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội tới tế bào DNA chủng vi khuẩn Bacillus subtilis B5 bị chiếu xạ Các kết thu lần khẳng định tác dụng bảo vệ phóng xạ dịch chiêt nấm tế bào DNA vi khuẩn nói riêng xa tác dụng bảo vệ phóng xạ tế bào, DNA loài sinh vật khác người II NỘI DUNG II Đối tượng phương pháp II.1.1 Nguyên vật liệu hóa chất Nấm Cordyceps militaris ni cấy phịng Nghiên cứu Cơng nghệ Bức xạ - Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội Chủng Bacillus subtilis B5 cung cấp Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Bách Khoa Hà Nội 2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl (DPPH), môi trường nutrient broth (NB) hãng SigmaAldrich Một số hóa chất tách chiết điện di DNA Thermo Fisher Scientific Máy móc, thiết bị ni cấy vi sinh nguồn chiếu xạ gamma nguồn Co-60 Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội II.1.2 Phương pháp Phương pháp thu nhận dịch chiết nấm Cordyceps militaris [10] Một (01) g bột nấm Cordyceps militaris khô cho vào 40 ml dung môi H2O:C2H5OH tỷ lệ 1:1 ủ bể ổn nhiệt 85°C khoảng thời gian 2,5 Sau ủ, toàn hỗn hợp chia vào ống Falcon ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút 30 phút 4°C Dịch chiết sau ly tâm sấy thăng hoa -80°C 24 để thu dạng bột khô tinh khiết Phương pháp đánh giá khả bắt giữ gốc tự DPPH [11] Khả bắt giữ gốc tự dịch chiết nấm Cordyceps militaris đánh giá phương pháp DPPH theo Zhan cộng (2006) [11] Thành phần phản ứng bao gồm: ml dịch chiết nồng độ 0,5-9,0 mg/ml; ml đệm acetate nồng độ 0,05mol/l, pH 5,5; ml C2H5OH 100%; ml DPPH nồng độ 0,5 mmol/l pha C2H5OH 100% Hỗn hợp phản ứng lắc để nhiệt độ 30°C tối 30 phút Độ hấp thụ quang hỗn hợp đo máy đo quang phổ bước sóng 517 nm Ascorbic acid (vitamin C) sử dụng làm đối chứng dương, đối chứng âm mẫu không bổ sung DPPH Khả bắt giữ gốc tự dịch chiết tính theo cơng thức: % bắt giữ gốc tự = Trong đó: Ab, As, Asb độ hấp thụ quang đo bước sóng 517 nm mẫu trắng (dung dịch khơng chứa mẫu), mẫu mẫu trắng mẫu tương ứng Phương pháp chiếu xạ Đường cong sinh trưởng chủng B subtilis B5 khảo sát môi trường nuôi cấy NB mơi trường có bổ sung dịch chiết nấm Đông trùng hạ thảo (CM2) điều kiện lắc 120 vòng/phút, 37oC thời điểm khác từ 0-36 Các ống nghiệm (10 ml/ống) chứa dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn B subtilis B5 dịch ni cấy tế bào vi khuẩn có bổ sung dịch chiết nấm Đông trùng hạ thảo pha Log (OD550 = 0,6-0,7) đem xử lý chiếu xạ dải liều 0-2000 nguồn gamma Co-60 Gy Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội (3 ống nghiệm lặp lại cho liều/cơng thức thí nghiệm) Phương pháp tính tỷ lệ sống sót Dung dịch ni cấy tế bào vi khuẩn (trước sau chiếu xạ) pha loãng theo mũ thập phân 0,1 ml mẫu nồng độ pha lỗng thích hợp cấy vào đĩa petri chứa mơi trường NA (3 đĩa petri/ độ pha lỗng) Sử dụng que gạt vô trùng dàn dung dịch bề mặt thạch Tiến hành đếm số lượng khuẩn lac sau 24 nuôi cấy nhiệt độ 37°C tính số lượng tế bào (Mi) 1ml mẫu theo cơng thức: Mi (CFU/ml)= Ai x Di/V Trong đó: Ai số khuẩn lạc trung bình/ đĩa; Di độ pha lỗng V thể tích dung dịch cấy vào đĩa (ml) Phương pháp tách chiết DNA sử dụng phenol/chloroform Dịch nuôi cấy sau chiếu xạ vi khuẩn B subtilis B5 ly tâm làm giàu tách chiết DNA tổng số phương pháp sử dụng Phenol/Chloroform Kết tách chiết DNA tổng số vi khuẩn B subtilis B5 điện di kiểm tra gel agarose 1% sử dụng marker 1kb II Kết bàn luận Khả bắt giữ gốc tự dịch chiết nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris Dịch chiết (CM2) Cordyceps mitaris chiết xuất dung mơi H2O:C2H5OH tỷ lệ 1:1 có dạng đồng nhất, màu nâu, khơng cịn chứa tạp dạng bột Thể tích dịch chiết thu nằm khoảng từ 25ml đến 35ml tùy vào lượng hao hụt bay trình tách chiết (Hình 1) Hình Dịch chiết Cordyceps militaris thu nhận Dịch chiết (CM2) sấy thăng hoa -80°C 24 để thu dạng bột khô tinh khiết thuận lợi cho việc tạo dung dịch chiết nồng độ khác Hoạt tính chống oxi hóa in vitro dịch chiết đánh giá thông qua khả bắt giữ gốc tự DPPH Kết trình bày Hình Hình Khả bắt giữ gốc tự dịch chiết CM2 vitamin C Hình cho thấy khả bắt giữ gốc tự dịch chiết CM2 tăng nhanh từ nồng độ 03 mg/ml đạt khoảng 90% nồng độ 3-9 mg/ml Ở khoảng nồng độ 3-9 mg/ml, khả bắt giữ gốc tự của dịch chiết CM2 ổn định, thay đổi theo chiều tăng nồng độ cao mẫu đối chứng dung dịch vitamin C có nồng độ Kết tương đồng với nghiên cứu Zhan cộng (2006) dải nồng độ tương tự [11] Điều cho thấy chất lượng nấm Cordyceps mitaris tốt phương pháp tách chiết đạt hiệu cao Ảnh hưởng dịch chiết tới sinh trưởng, phát triển tế bào B subtilis B5 Hình Đường cong hấp thụ OD550 dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn B subtilis B5 thời điểm khác Hình biểu diễn độ hấp thụ quang dịch nuôi cấy vi khuẩn môi trường ni cấy NB mơi trường NB có bổ sung dịch chiết CM2 Đồ thị cho thấy giai đoạn tăng trưởng mạnh- pha log khoảng 2-6 Trong giai đoạn này, chủng vi khuẩn B5 môi trường có bổ sung dịch chiết CM2 có tốc độ sinh trưởng cao so với mơi trường không bổ sung dịch chiết, OD550 thời điểm 1,13 so với 0,95 Tốc độ sinh trưởng vi khuẩn chậm giai đoạn bước vào pha cân (8-18 giờ) Do hạn chế phương pháp đo quang phổ không phân biệt tế bào sống-chết, đồ thị có chiều hướng lên gần đường thẳng Ở giai đoạn này, tốc độ tế bào sống tăng lên tế bào chết khơng có khác biệt lớn giá trị OD mơi trường có bổ sung dịch chiết CM2 môi trường không bổ sung dịch chiết Giai đoạn suy vong tính từ 18h trở Đồ thị giai đoạn nằm ngang dung dịch tồn tế bào chết, khơng có tăng thêm số lượng tế bào sống Thậm chí, tế bào kết lại thành đám làm giá trị OD550 giảm thời điểm 36 xuống 1,57 1.68 Các kết cho thấy chủng B subtilis B5 mơi trường có bổ sung dịch chiết CM2 có tốc độ suy thối chậm so với chủng B5 môi trường không bổ sung dịch chiết Tỷ lệ sống sót tế bào Bacillus subtilis B5 sau chiếu xạ Tác động xạ gamma tới tỷ lệ sống sót vi khuẩn B subtilis B5 đánh giá phương pháp nhỏ trực tiếp dịch nuôi cấy lên đĩa thạch phương pháp đếm khuẩn lạc sống sót sau chiếu xạ (Hình 4A 4B) Dựa vào đồ thị hình ta thấy, hai loại mơi trường số lượng tế bào vi khuẩn sống sót giảm đáng kể theo chiều tăng liều chiếu xạ (giảm từ 109 xuống 104 liều tăng từ 0-2000Gy) Tuy nhiên, liều 1000 ảnh hưởng dịch chiết tới phát triển tế bào sau chiếu xạ rõ rệt Ở khoảng liều này, mơi trường có bổ sung dịch chiết, lượng tế bào sống sót giảm từ 109 xuống 107, giảm chậm so với môi trường không bổ sung dịch chiết, lượng tế bào sống sót giảm từ 109 xuống 106 Hiệu ứng thể rõ đĩa thạch nhỏ trực tiếp dịch nuôi cấy sau chiếu xạ, môi trường bổ sung dịch chiết khuẩn lạc mọc dày hơn, cho thấy khả sinh trưởng phát triển tốt (Hình 4) Qua khẳng định dịch chiết CM2 có tác dụng bảo vệ tế bào vi khuẩn dải liều chiếu thấp, tác dụng liều chiếu cao A B Hình Tỷ lệ sống sót chủng B5 chủng B5 có bổ sung dịch chiết A Không bổ sung dịch chiết CM2; B Có dịch chiết CM2 Mức độ đứt gãy DNA tổng số Bacillus subtilis B5 sau chiếu xạ Để kiểm tra mức độ đứt gãy DNA chủng vi khuẩn B subtilis B5 gây chiếu xạ DNA tổng số tế bào vi khuẩn dung dịch nuôi cấy liều chiếu 0, 300, 700, 1500Gy tách chiết (mỗi liều gồm mẫu đối chứng mẫu có bổ sung dịch chiết (CM2) Kết điện di DNA tổng số mẫu thí nghiệm trình bày Hình Điện di DNA tổng số sử dụng marker 1kb, gel agarose 1% Hình Kết điện di DNA tổng số mẫu M: Marker 1kb; 1-2: B5 Gy; 3-4: 300 Gy; 5-6: 700 Gy; 7-8: 1500 Gy Hình cho thấy rõ ảnh hưởng chiếu xạ tới đứt gãy DNA tổng số Mẫu mẫu không chiếu xạ cho kết băng DNA sắc nét, rõ ràng, khơng có vệt đứt gãy phía Mẫu mẫu chiếu xạ liều 300 Gy 700 Gy cho băng sáng rõ, nhiên ảnh hưởng chiếu xạ tạo vệt đứt gãy DNA rải rác phía Mẫu mẫu chiếu xạ liều 300 Gy 700 Gy, nhiên tác dụng bảo vệ phóng xạ dịch chiết CM2 vệt đứt gãy phía giảm nhiều, quan sát rõ mẫu số Mẫu mẫu chiếu xạ liều 1500 Gy, liều chiếu cao băng DNA tổng số khơng cịn rõ ràng bị đứt gãy nhiều Mẫu có bố sung dịch chiết CM2 giảm số vệt đứt gãy phía dưới, nhiên liều cao, hiệu ứng khơng rõ ràng Điều giải thích liều chiết cao, chiếu xạ gây đứt gãy lớn DNA, đồng thời ảnh hưởng lớn tới tế bào, DNA phục hồi chế sửa chữa tế bào Như vậy, kết khẳng định dịch chiết CM2 có tác dụng bảo vệ DNA vi khuẩn B subtilis B5 liều chiếu thấp, tác dụng liều chiếu cao III KẾT LUẬN Khả bắt giữ gốc tự dịch chiết nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 90% nồng độ từ 3mg/ml Với hoạt tính chống oxy hóa tốt, dịch chiết cho thấy khả bảo vệ đáng kể tế bào DNA vi khuẩn B subtilis liều chiếu thấp Khả bảo ... B Có dịch chiết CM2 Mức độ đứt gãy DNA tổng số Bacillus subtilis B5 sau chiếu xạ Để kiểm tra mức độ đứt gãy DNA chủng vi khuẩn B subtilis B5 gây chiếu xạ DNA tổng số tế bào vi khuẩn dung dịch. .. liều chiết cao, chiếu xạ gây đứt gãy lớn DNA, đồng thời ảnh hưởng lớn tới tế bào, DNA phục hồi chế sửa chữa tế bào Như vậy, kết khẳng định dịch chiết CM2 có tác dụng bảo vệ DNA vi khuẩn B subtilis. .. lượng nấm Cordyceps mitaris tốt phương pháp tách chiết đạt hiệu cao Ảnh hưởng dịch chiết tới sinh trưởng, phát triển tế bào B subtilis B5 Hình Đường cong hấp thụ OD550 dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn