Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme nàyLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme này
-1ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC KHOA HỌC Nguyễn Ngọc Mai “Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh trùng Lecanicillium lecanii đánh giá tính chất enzyme này” Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -2- MỞ ĐẦU Chitin phân bố rộng rãi tự nhiên, polysaccharide phổ biến thứ hai sau cellulose Nó chuỗi polymer chứa đơn phân N-acetylglucosamine đƣợc liên kết liên kết β-1,4-glucoside, có trọng lƣợng phân tử cao, khơng hịa tan nƣớc dung môi hữu khác Chitin thành phần cấu trúc vỏ lớp biểu bì động vật chân đốt, giáp xác, lồi côn trùng thành tế bào nấm Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân, phân cắt chitin thành sản phẩm khác nhƣ N-acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose Chitinase có nhiều loại thể sống khác bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật không xƣơng sống, thực vật động vật có xƣơng sống Chitinase đƣợc ứng dụng nhiều ngành nông nghiệp nhƣ tác nhân nhằm kiểm soát nấm gây bệnh thực vật, kiểm sốt trùng Trong y dƣợc, chitinase có giá trị phòng trừ dịch bệnh, tổng hợp chitooligosaccharide hoạt hóa… Hiện nay, ngƣời ta nghiên cứu tách chiết chitinase phân giải chitin từ nguồn khác nhƣ vi khuẩn, nấm, động vật, thực vật… nhƣng có chitinase vi sinh vật tổng hợp, đặc biệt từ nấm sợi có hoạt tính cao, ổn định với nhiệt độ pH Hiện nay, việc phịng ngừa trùng có hại cho trồng biện pháp biến sử dụng thuốc trừ sâu hóa học Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học với liều lƣợng ngày cao, tần suất nhiều ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe ngƣời môi trƣờng sinh thái Với ƣu điểm vƣợt trội thân thiện với ngƣời môi trƣờng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học lựa chọn có tiềm lớn xu hƣớng phát triển nông nghiệp bền vững Lecanicillium lecanii số chủng nấm entomopathogenic, mà trƣớc đƣợc biết đến rộng rãi nhƣ Verticillium lecanii, nhƣng đƣợc hiểu dạng anamorphic nhóm Trùng thảo Hầu Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -3hết, entomopathogens kí sinh thể trùng Tuy nhiên, số entomopathogens tồn trồng Vì vậy, L lecanii spp có hai vật chủ trùng thực vật Trong tự nhiên, nấm Lecanicillium spp kí sinh gây bệnh côn trùng phá hoại cây, đặc biệt rệp Lecanicillium có độc lực mạnh số loài rệp nhƣ: rệp đào (Myzus persicae) rệp (Aphis gossypii) Do vậy, bào tử nấm Lecanicillium spp đƣợc quan tâm vấn đề kiểm sốt trùng sâu hại Từ vấn đề thực tiễn nêu trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh trùng Lecanicillium lecanii đánh giá tính chất enzyme này” Mục tiêu đề tài: Sử dụng biện pháp đột biến để cải biến chủng, tăng hoạt tính chitinase Đồng thời, tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase Nội dung đề tài: - Gây đột biến chủng nấm lecanicillium lecanii cách sử dụng hóa chất gây đột biến NTG (N–methyl–N'–nitron–nitrosoguanidine) tia UV (tia cực tím) - Sàng lọc chủng nấm kí sinh trùng có hoạt tính chitinase cao - Tối ƣu mơi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh trùng đột biến sàng lọc - Xác định tính chất chitinase Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -4- Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITINASE 1.1.1 Giới thiệu chitinase Chitinase [poly-β-1,4-(2-acetalmido-2-deoxy)-D-glucoside glucanohydrolase] thuộc nhóm glycosyl hydrolase, enzyme thùy phân chitin thành đơn phân chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác thủy giải liên kết β-1,4-glucoside C1 C4 hai phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp chitin Kí hiệu chitinase EC3.2.1.14 Trong đó: → Hydrolase → Glycosylase → Glycosidase 14 → Chitinase Chitinase cịn có tên gọi khác tùy theo xuất xứ enzyme chitodextrinase, β-poly-N-acetylglucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC (Streptomyces griceus)…[98] Chitinase đƣợc tìm thấy lồi có thành phần cấu trúc chứa chitin nhƣ nấm, côn trùng, giáp xác, đến lồi khơng có chitin nhƣ vi khuẩn, thực vật [59] Ở sinh vật chứa chitin, chitinase đóng vai trị q trình phát sinh hình thái phân chia tế bào Tùy thuộc vào loài sinh vật khác mà tổng hợp chitinase với mục đích khác Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân hủy chitin tạo nguồn carbon Ở thực vật động vật, chitinase nằm hệ thống chống lại tác nhân gây bệnh nhƣ nấm cách phá vỡ thành tế bào chứa chitin nấm [91] Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -5Cơ chất chitinase chitin số dẫn xuất Chitin [111] Chitin [(C8H13O5N)n] dạng polysaccharide phổ biến tự nhiên, đƣợc tạo thành đơn phân N-acetylglucosamine liên kết với liên kết β-1,4-glucoside Về mặt cấu trúc , chitin có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cellulose, điểm khác biệt nhóm acetamido vị trí số khung carbon chitin đƣợc thay nhóm hdroxyl (-OH) cellulose [71] Hình 1.1: Cấu trúc hóa học chitinase Chitin có hoạt tính hóa học thấp, màu trắng, cứng có chứa nitrogen Nó khơng hịa tan nƣớc, kiềm lỗng hay đặc, rƣợu hầu hết dung mơi hữu thơng thƣờng Nó tan axit vơ đặc (HCl, H2SO4, H3PO4…) số dung môi khác (hexafluro isopropanol, hexafluro acetone…) [69], [94] Một số động vật không xƣơng sống nhƣ côn trùng, huyễn thể, giáp xác giun tròn, chitin thành phần cấu trúc quan trọng lớp vỏ Ở động vật thủy sản, đặc biệt vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực, hàm lƣợng chitin chiếm cao từ 14 – 35% so với trọng lƣợng khô [10] Trong giới thực vật, chitin có thành tế bào nấm số tảo Chlorophiceae [85] Các dẫn xuất chitinase Chitinase thủy phân số dẫn xuất chitin nhƣ glycol-chitin, carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfat, 4-methylumbellferyl-tri N-acetyl chititrioside (MUC – phát huỳnh quang) [33], [60] không thủy phân số chất: chitin nitrat, cellulose, hyaluronic acid, alginic acid mucin Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -6- 1.1.2 Phân loại chitinase Dựa vào phản ứng phân cắt Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-β-chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) [60] Endochitinase (EC 3.2.1.14): nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin cách ngẫu nhiên tạo đoạn oligosaccharide Các enzyme đƣợc nghiên cứu từ dịch chiết môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 ± 0,2 M2 = 40kDa, pI2 = 3,9), Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 78) Chitin-1,4-β-chitobiosidase: enzyme phân cắt chitin tạo thành sản phẩm dimer chitobiose N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase): enzyme tiếp tục phân cắt chitin từ đầu cho sản phẩm nhóm monomer N-acetyl-D-glucosamin Hình 1.2: Sơ đồ phân cắt chitinase enzyme thuộc nhóm chitinase [117] Dựa vào cấu trúc phân tử Chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18, Glycohydrolase 19 Glycohydrolase 20 [60] Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -7- Họ Glycohydrolase 18: Là họ lớn với khoảng 180 chi, đƣợc tìm thấy hầu hết lồi thuộc Eukaryote, Prokaryote virus Họ bao gồm chủ yếu chitinase, ngồi cịn có chitodextrinase, chitobiase N-acetyl glucosaminidase Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm xoắn α/β cuộn tròn, hoạt động thơng qua chế kiểm sốt mà đoạn β-polymer bị phân cắt tạo sản phẩm β-anomer [43] Chúng thủy phân liên kết GlcNAc – GlcNAc, GlcNAc – GlcN chế giữ ngun cấu hình anomeric Hoạt tính chitinase thuộc họ 18 bị ức chế allosamidin [53] Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 bao gồm chitinase từ thực vật (Arabidosis, dƣa leo, họ đậu, thuốc lá…), nấm (Aphanocladium, Rhizopus, Saccharomyces…), vi khuẩn (Alteromonas, Bacillus, Serratia, Streptomyces…), virus động vật [53] Họ Glycohydrolase 19: Họ gồm 130 chi, thƣờng thấy chủ yếu thực vật nhƣ cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum)… ngồi cịn có xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với vịng xoắn hoạt động thơng qua chế nghịch chuyển Họ Glycohydrolase 20 Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces ngƣời Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -8- Hình 1.3: Cấu trúc không gian họ Glycohydrolase 18 (A) họ Glycohydrolase 19 (B) [118] Dựa vào trình tự amino acid Ngồi ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), định vị enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết vùng cảm ứng, ngƣời ta phân loại enzyme chitinase thành nhóm [88]: Nhóm I: đồng phân enzyme phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua đoạn giàu glycin prolin đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trị quan trọng gắn kết enzyme chất chitin nhƣng khơng cần cho hoạt động xúc tác Nhóm II: đồng phân enzyme phân tử có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein đầu N peptid nhận biết đầu C, có trình tự amino acid tƣơng tự chitinase nhóm I Chitinase nhóm II có thực vật, nấm, vi khuẩn Chúng đƣợc cảm ứng tác nhân bên ngồi Nhóm III: trình tự amino acid hồn tồn khác với chitinase nhóm I II Nhóm IV: đồng phân enzyme chủ yếu có hai mầm, 41 – 47% trình tự amino acid tâm xúc tác chúng tƣơng tự nhƣ chitinase nhóm I, phân tử có đoạn giàu cystein nhƣng kích thƣớc phân tử nhỏ đáng kể so với chitinase nhóm I Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -9Nhóm V: dựa liệu trình tự, ngƣời ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) giảm nhiều lần q trình tiến hóa thực vật bậc cao 1.1.3 Nguồn thu nhận chitinase Chitinase diện hầu hết giới sinh vật bao gồm vi sinh vật, thực vật động vật [37], [60], [94] Chitinase vi khuẩn Chitinase đƣợc tìm thấy Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus đặc biệt nhóm Streptomycetes Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân giải chitin môi trƣờng nhằm sử dụng nguồn cacbon cho sinh trƣởng phát triển Chitinase vi khuẩn enzyme cấu trúc enzyme cảm ứng Tuy nhiên môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật ngƣời ta cho thêm chitin nhƣ nguồn chất kích thích làm tăng khả tổng hợp chitinase, đồng thời ổn định hoạt tính chitinase sau trình tách chiết Chitinase nấm Các lồi nấm sợi có khả tạo chitinase Các chủng nấm mốc cho chitinase cao nhƣ Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia đặc biệt nấm lớn nhƣ Lycoperdon, Coprinus Tƣơng tự nhƣ vi khuẩn, chitinase nấm đóng vai trị quan trọng mặt dinh dƣỡng, nhƣng khác hoạt động chúng linh hoạt trình phát triển phát sinh hình thái nấm chitin thành phần vách tế bào nấm Chitinase cịn giữ vai trị hoạt động kí sinh nấm nhằm đối kháng lại loài nấm gây bệnh thực vật Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -10 Chitinase thực vật Những thực vật bậc cao có khả sinh chitinase nhƣ thuốc lá, cao su, lúa mạch, cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) Ngoài ra, số loài tảo biển nguồn cung cấp chitinase [41] Chitinase thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại loại trùng nấm kí sinh gây bệnh cho trồng [44] Ngƣời ta quan sát thấy chitinase đƣợc tách chiết từ cần tây có khả ức chế sợi nấm phát triển Tuy nhiên có tác giả cho chitinase cịn có vai trị khác nhƣ tham gia vào q trình hình thành phôi [35] Chitinase động vật Ở số động vật nguyên sinh, từ mô tuyến khác hệ tiêu hóa nhiều lồi động vật khơng xƣơng nhƣ ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt thu nhận đƣợc chitinase (ví dụ dịch ruột ốc sên Helix aspersa) Đối với động vật có xƣơng sống, chitinase đƣợc tiết từ tuyến tụy dịch dày loài cá, lƣỡng cƣ, bò sát ăn sâu bọ, dịch dày loài chim, thú ăn sâu bọ Ngoài ra, chitinase cịn đƣợc thu nhận từ dịch biểu bì giun trịn suốt q trình phát triển dịch tiết biểu bì lồi chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngồi (cuticun) chúng q trình biến thái hay lột xác [33] 1.2 NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHITINASE 1.2.1 Sơ lƣợc nghiên cứu chitinase Nghiên cứu giới So với enzyme nhƣ protease, amylase… chitinase đƣợc nghiên cứu chậm Chitinase lần đầu đƣợc mô tả Bernad (1911) ảnh hƣởng Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B ... soát côn trùng sâu hại Từ vấn đề thực tiễn nêu trên, tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh trùng Lecanicillium. .. chitinase cao - Tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng đột biến sàng lọc - Xác định tính chất chitinase Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -4- Chƣơng... Lecanicillium lecanii đánh giá tính chất enzyme này? ?? Mục tiêu đề tài: Sử dụng biện pháp đột biến để cải biến chủng, tăng hoạt tính chitinase Đồng thời, tối ƣu mơi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase