MỞ ĐẦU ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC Tên đề tài TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DEACETYL VINDOLINE 4 O ACETYLTRASFERASE ([.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC Tên đề tài TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DEACETYL VINDOLINE 4-O-ACETYLTRASFERASE (DAT) THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don ) Mã số: ĐH2016 – TN05-04 Chủ nhiệm đề tài: ThS Bùi Thị Hà THÁI NGUYÊN, 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC Tên đề tài TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DEACETYL VINDOLINE 4-O-ACETYLTRASFERASE (DAT) THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don ) Mã số: ĐH2016 – TN05-04 Xác nhận tổ chức chủ trì Chủ nhiệm đề tài (ký, ghi rõ họ tên) ThS Bùi Thị Hà THÁI NGUYÊN, 2018 i DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA ĐỀ TÀI I Danh sách thành viên STT Họ tên Nguyễn Thị Tâm Nguyễn Thu Hiền Nguyễn Huy Hồng Đơn vị cơng tác Khoa sinh học, ĐH Sư phạm Thái Nguyên Bộ môn Sinh học, ĐH Y Dược Thái Nguyên Bộ môn Sinh học, ĐH Y Dược Thái Nguyên II Đơn vị phối hợp thực Khoa sinh học, Trường ĐH Sư phạm, ĐH Thái Nguyên Bộ môn Sinh học, ĐH Y Dược Thái Nguyên Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ii MỤC LỤC Trang MỤC LỤC ii DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN 1.1.1 Vai trò alkaloid thực vật 1.1.2 Alkaloid dừa cạn 1.2 SINH TỔNG HỢP ALKALOID VÀ HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME DAT Ở CÂY DỪA CẠN .10 1.2.1 Quá trình sinh tổng hợp alkaloid dừa cạn 10 1.2.2 Hoạt động enzyme DAT gen DAT 17 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 19 2.1.1 Vật liệu thực vật .19 2.1.2 Chủng vi khuẩn loại vector .19 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .19 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1 Các phương pháp sinh học phân tử 20 2.3.2 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT 24 2.3.3 Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào thuốc 28 iii 2.3.4 Phương pháp phân tích chuyển gen .29 2.3.5 Phương pháp tính hiệu suất chuyển gen .31 2.3.6 Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu 31 3.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN CrDAT PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN .32 3.1.1 Kết tách dòng xác định trình tự nucleotide gen CrDAT 32 3.1.2 So sánh trình tự nucleotite gen CrDAT 34 3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN CrDAT 39 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDATError! Bookmark not 3.2.2 Phân tích biểu gen CrDAT thuốc chuyển gen .44 3.2.3 Thảo luận kết thiết kế đánh giá hoạt động vector chuyển gen pBI121-CrDAT 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 Kết luận 54 Đề nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 64 iv DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 35S Promoter CaMV 35S bp DNA base pair Deoxyribonucleic acid Cặp bazơ nitơ cDNA Complementary DNA DNA bổ sung DAT Deacetyl vindoline 4-Oacetyltransferase Gen DAT DEPC Diethyl pyrocarbonate dNTP Deoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid Kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn MS Murashige Skoog Tên gọi đặt cho môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật mRNA Messenger ribonucleic acid NptII Neomycyn phosphatranferaseII PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid rCrDAT Recombinant CrDAT protein SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA Gen kháng kanamycine Phản ứng chuỗi polymerase Protein DAT tái tổ hợp v Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase T-DNA Transfer DNA TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine WT Wild type X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-βD-galacto-pyranoside Đoạn DNA chuyển vào thực vật Cây không chuyển gen vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR .21 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen CrDAT vào vector tách dòng 22 Bảng 2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn 23 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt DNA BamHI .24 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid NotI/ NcoI 26 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt plasmid HindIII 26 Bảng 3.1 Các vị trí nucleotide sai khác giữa ba trình tự nucleotide gen CrDAT .35 Bảng 3.2 Các vi ̣tri ́ sai khác giữa trình tự amino acid suy diễn protein DAT ở mẫu dừa cạn TN1, TN2 protein mang mã số AAC99311 Ngân hàng Gen .38 Bảng 3.3 Kết biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào thuốc 46 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Hoa ba giống Catharanthus roseus Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn đường sinh tổng hợp terpenoid indole alkaloid (TIA) 12 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo vinblastine vincristine 16 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrDAT 25 Hinh ̀ 3.1 Kết điêṇ di kiểm tra sản phẩ m PCR nhân gen CrDAT 32 Hình 3.2 Tri nh ̀ tự nucleotide của gen CrDAT phân lâ ̣p từ dừa ca ̣n mẫu TN1, TN2 và tri nh ̀ tự mang mã số AF053307 Ngân hàng gen quốc tế 36 Hình 3.3 Tri nh ̀ tự amino acid suy diễn gen CrDAT từ hai mẫu dừa cạn TN1, TN2 và của protein mang mã số AAC99311 Ngân hàng Gen 37 Hình 3.4 Kết cắt vector tách dòng tái tổ hợp pBT-CrDAT với cặp enzyme giới hạn NcoI NotI 40 Hình 3.5 Kết cắt mở vịng vector pRTRA7/3 41 Hình 3.6 Kết tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrDAT 42 Hình 3.7 Kết tạo vector chuyển gen pBI121- CrDAT .43 Hình 3.8 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121-CrDAT kết điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR 44 Hình 3.9 Hình ảnh mơ tả q trình biến nạp, chọn lọc tái sinh tạo thuốc chuyển gen 45 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR xác định có mặt gen CrDAT thuốc chuyển gen đối chứng .47 Hình 3.11 Kết phân tích Southern blot dòng thuốc chuyển gen CrDAT .48 viii Hình 3.12 Kết phân tích Western blot dịng thuốc chuyển gen CrDAT 50 12 Con đường MEP Con đường Seco-Iridoid Con đường Shikmate Secologanin Tryptamine Geranyl diphosphate (GPP) Con đường Vindoline Tabersonine Dehydrosecodine Deacetylvindoline DAT Vindoline Catharanthine Vinblastine Vincristine Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn đường sinh tổng hợp terpenoid indole alkaloid (TIA) [53] : Phản ứng trực tiếp; : Qua nhiều phản ứng; Khung màu cam Con đường chuyển hóa; Các khung màu xanh : : Sản phẩm chuyển hóa Khi biểu mạnh gen TDC với mục đích làm tăng tổng hợp TIA lại khơng thành cơng biểu mức gen TDC phụ thuộc nhiều vào có sẵn tryptophan [76], [77] Secologanin kết hợp với tryptamine tạo nên phân tử strictosidine không bào xúc tác enzyme strictosidine synthase [13], [29], [65] 13 Từ strictosidine trải qua nhiều phản ứng trung gian với tham gia nhiều enzyme tạo nên dehydrosecodine Từ dehydrosecodine hướng tạo thành tabersonine đường vindoline, hướng tạo thành catharanthine để kết hợp với vindoline tạo thành Iminium Tabersonine chuyển hóa thành vindoline cần có tham gia ánh sáng ánh sáng tác động đến giai đoạn phát triển khác [13], [29], [63] Hầu nghiên cứu tập trung vào đường tổng hợp vindoline, vindoline liên quan trực tiếp đến hình thành alkaloid, có vinblastine vincristine Tuy nhiên q trình tích lũy tabersonine mức độ cao lại thường không tổng hợp vindoline [18] Con đường vindoline miêu tả kỹ, từ tabersonine trải qua phản ứng trung gian với tham gia loại enzyme để tạo nên deacetylvindoline Từ tabersonine chuyển thành 16 - hydroxytabersonine xúc tác enzyme tabersonine -16 - hydroxylase (T16H), sau methyl hóa 16-hydroxytabersonine-16-O-methyl transferase (16OMT) tạo nên 16- methoxytabersonine [60] Sau trải qua bước oxi hóa để biến đổi từ 16methoxy tabersonine thành 16 methoxy -2, 3-dihydrotabersonine enzyme tabersonine 3-oxygenase (T3O) Các bước liên quan đến enzyme N - methyltransferase (NMT) để tạo nên deacetoxy vindoline [37] Hai phản ứng cuối xúc tác hai enzyme deacetoxy vindoline – hydroxylase (D4H) tạo deacetylvindoline enzyme deacetylvindoline – – O - acetyltransferase (DAT) tạo nên vindoline Vindoline tiền chất quan trọng chuỗi chuyển hóa tổng hợp nên vinblastine vincristine Sau vindoline kết hợp với catharanthine tạo nên iminium, từ iminium tạo thành α 3’4’anhydrovinblastine (AVLB) với 14 xúc tác perosidase (Prx1) để hình thành nên vinblastine sau hình thành nên vincristine đánh dấu hồn thiện q trình sinh tổng hợp TIA hữu ích dừa cạn [16], [32] Cả catharanthine vindoline tổng hợp thân, rễ dừa cạn [34] Khi phân tích alkaloid phương pháp sắc ký cho thấy, hàm lượng vindoline catharanthine rễ thân thấp, khoảng từ 0,16 đến 1,8% thấp so với Điều cho thấy khả tích lũy alkaloid cao phận khác cây, đặc biệt cao biểu bì dừa cạn Các nghiên cứu trước cho rằng, tích lũy catharanthine phụ thuộc vào có mặt TIA bề mặt [54] Một phần catharanthine kết hợp với vindoline tạo sản phẩm cuối vinblastine vincristine, phần catharanthine có bề mặt hoạt động lớp sáp chống lại phá hại côn trùng nấm mốc Bằng thực nghiệm nghiên cứu rằng, phần hòa tan chloroform bề mặt dừa cạn chứa 100% catharanthine 3–5% vindoline so với tồn Sự tích lũy chiết xuất catharanthine bề mặt cho thấy đường sinh tổng hợp catharanthine xảy biểu bì [54] Roepke cs (2010) nghiên cứu ảnh hưởng catharanthine đến loài nấm Phytopthora nicotianiae cho thấy, catharanthine ức chế phát triển nấm mơi trường có nồng độ 10 μg /ml Đây nồng độ thấp nhiều so với nồng độ trung bình catharanthine non già 14 μg 23 μg/ml Các tác dụng chống côn trùng xâm hại catharanthine thí nghiệm cách cho lồi côn trùng Spodoptera littoralis, Spodoptera eridania, Helicoverpa armigera, Phaedon cochleariaeand Bombyx mori ăn dừa cạn Kết cho thấy, ấu trùng S eridania 15 không ăn dừa cạn, hai loài Spodoptera B mori ăn mà không bị chết Ngược lại, P cochleariae khơng ăn vịng ngày bị chết đói Khi cho ấu trùng B mori ăn với chế độ ăn trộn dừa cạn với dâu tằm cho thấy tỷ lệ tử vong giảm nghiền thành bột Mặt khác, cho ấu trùng ăn dâu tằm trộn với catharanthine tinh khiết chúng bị chết tỷ lệ chết phụ thuộc vào liều lượng catharanthine [54] Vinblastine hay gọi vincaleucoblastine tinh thể hình kim kết tinh methanol, không tan nước ether dầu hỏa, tan alcol, aceton, ethyl acetat, chloroforme [7] Vinblastine có khả ức chế hình thành cấu trúc vi ống, sử dụng điều trị tế bào tiền ung thư, khối u ác tính, u sùi dạng nấm, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư tinh hồn ung thư thai Vincristine hay cịn gọi leurocristine tinh thể hình phiến, sau tiêm vincristine nhanh chóng phân bố vào mơ thể gắn với yếu tố máu hình thành, đặc biệt hồng cầu tiểu cầu Vincristine thường dùng để điều trị khối u ác tính trẻ em liều lượng thích hợp Mặt khác người lớn trẻ em, vincristine phần cần thiết liệu pháp hóa học để chữa viêm bạch cầu cấp tính, bệnh lymphoma Hodgkin… Vincristine đóng vai trị liệu pháp điều trị khối u Wilms, u nguyên bào thần kinh, tế bào ung thư phổi người lớn Vinblastine vincristine tạo thành từ ghép nối catharanthine (indole) vindoline (dihydroindole) trạng thái tự Vincristine có cấu trúc tương tự vinblastine, cấu tạo vincristine, phân tử nitrogen indole vindoline nhóm formyl (CHO), cịn vinblastine nhóm methyl (CH3) [49], [80] 16 A B Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo vinblastine vincristine [80] Nghiên cứu Amirjani (2013) cho thấy, gây hạn nhẹ cho dừa cạn môi trường nuôi cấy in vitro làm tăng hàm lượng vinblastine vincristine Tuy nhiên, bị hạn nặng ảnh hưởng đến việc tổng hợp vinblastine vincristine [8] Hiện nay, tạo biến đổi vinblastine thành vincristine phương pháp hóa học hay thơng qua chuyển hóa vi sinh vật Vinblastine vincristine liên kết đặc hiệu với tubulin protein vi ống thoi phân bào ngăn cản kết hợp cấu trúc hình ống có ngun sinh chất nhiều tế bào di động, ngăn cản phân chia tế bào từ giai đoạn kỳ nguyên phân, hạn chế tăng sinh số lượng tế bào Vinblastine có tác dụng chống ung thư tác động chuyển hố glutamate aspartate, cịn vincristine tác dụng chống ung thư ngăn cản tổng hợp mRNA protein Ở nồng độ cao vinblastine vincristine diệt tế bào, cịn nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào kỳ Vì thế, chúng sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thư [7] 17 1.2.2 Hoạt động enzyme DAT gen DAT DAT enzyme chìa khóa xúc tác cho phản ứng cuối chuỗi tổng hợp vindoline từ deacetylvindoline dừa cạn [63], [50] Trong nghiên cứu Benoit cs (1998), hoạt động enzyme DAT xác định quan khác dừa cạn Enzyme DAT hoạt động cao non, giảm xuống 76% già, thân 5%, hoa khoảng 11% rễ không đáng kể [10] Mối quan hệ hoạt động enzyme tích lũy protein DAT xác định kết phân tích Western blot [10] Để chứng minh mức độ hoạt động enzyme DAT gen CrDAT tương quan với tích lũy mRNA người ta tách chiết mRNA từ phận khác Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích mRNA gen CrDAT phận khác dừa cạn cho thấy mRNA gen CrDAT có kích thước khoảng 1,3 kb xuất nhiều non, trưởng thành giảm dần thân hoa, lại khơng có rễ [10] Khảo sát tác động ánh sáng đến hoạt động enzyme DAT cho thấy, dừa cạn non tối enzyme DAT hoạt động kém, sau điều chỉnh ánh sáng hoạt động DAT tăng dần theo thời gian Phân tích Western blot cho thấy, tối protein DAT có trọng lượng phân tử khoảng 50 kDa sáng trọng lượng phân tử DAT tăng lên đạt khoảng 52 kDa [10],[66] Ánh sáng kích thích q trình phiên mã gen CrDAT với gen mã hóa enzyme tham gia vào trình sinh tổng hợp alkaloid khác deacetoxy vindoline hydroxylase (D4H) tryptophan decarboxylase (TDC) [54], [74], [75] Khi nghiên cứu gen DAT người ta xác định gen DAT có 18 lồi thực vật (17-30%), số lại chưa biết hết chức Trong đó, 13 gen phân lập từ lồi Arabidopsis thaliana, 19 gen phân lập từ hoa cẩm chướng [8] 18 Theo St-Pierre cs (1998), gen CrDAT phân lập từ DNA genome dừa cạn có kích thước 1320 bp, mã hóa enzyme DAT có 439 amino acid DAT gồm chuỗi polypeptid tham gia vào bước cuối trình sinh tổng hợp vindoline dừa cạn [63] Quá trình phiên mã gen liên quan đến chức nhân tố khởi đầu phiên mã, có mã mở đầu Tuy nhiên, phiên mã phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: vùng promoter, vùng mã hóa, protein nhân tố phiên mã Các nghiên cứu cho thấy gen CrDAT biểu có tín hiệu ánh sáng tín hiệu methyl jasmonate [106] Wang cs (2010), mơ tả trình tự đoạn TGACG liên quan đến đường tín hiệu methyl jasmonate vùng khởi động gen CrDAT Các phân tích vùng promoter gen CrDAT có đoạn motif liên quan đến tín hiệu ánh sáng Ngồi ra, số motif khác có liên quan đến nhân tố vơ sinh hữu sinh, hormon sinh trưởng gibberellin auxin [77] Gen CrDAT biểu mạnh biểu bì dừa cạn, Arabidopsis thaliana có thêm số promoter khác liên quan tới việc biểu gen CrDAT tế bào biểu bì [77 ] 19 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Vật liệu thực vật Hạt giống dừa cạn màu hoa hồng tím (TN1) màu hoa trắng (TN2) thu thập tỉnh Thái Nguyên Giống thuốc Nicotinana tabacum K326 có nguồn gốc từ Viện kinh tế kỹ thuật thuốc lá, Phịng tế bào Thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cung cấp 2.1.2 Chủng vi khuẩn loại vector Các chủng vi khuẩn E Coli (DH5α), chủng A tumefaciens CV58 Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cung cấp Các loại vector tách dòng pBT, vector pCB-gusplus, vector pRTRA7/3, vector chuyển gen pBI121 (Phụ lục 1) Phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cung cấp 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Hóa chất Hóa chất tinh khiết sử dụng phân tích sinh học phân tử có nguồn gốc từ hãng Fermentas, Bio-Neer, Invitrogen, Trizol Reagents, kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis, kít GenJET PCR Purification, kít Plasmid Extraction, taq-polymerase, buffer PCR, EDTA, Tris, agarose, 20 enzyme giới hạn BamHI, NotI, NcoI, HindIII, T4 ligase, kháng sinh kanamycine, rifamycine, cefotaxime, carbenicillin số hóa chất khác có nguồn gốc từ hãng Fermentas, Invitrogen, Sigma, Amersham số hãng khác Thang chuẩn kb hãng Guangzhou Genshun Biotech Ltd Kháng thể (anti-cmyc từ chuột), kháng thể (anti-mouse-Ig, Horseradish peroxidase) đặt tổng hợp từ hãng GE Health UK Limited Thiết bị Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, BioRad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Plulser,… số thiết bị khác phục vụ cho nghiên cứu 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Các phương pháp sinh học phân tử 2.3.1.1 Nghiên cứu thông tin gen thiết kế cặp mồi nhân gen Dựa thơng tin trình tự gen CrDAT dừa cạn công bố Ngân hàng gen quốc tế mang mã số AF053307 [97] cặp mồi đặc hiệu DAT- NcoI/DATR-NotI thiết kế để khuếch đại đoạn mã hố enzyme DAT từ cDNA dự kiến kích thước đoạn cDNA nhân 1320 bp Cặp mồi XbaI-DAT-F/cmyc-KDEL-SacI-R sử dụng cho PCR để kiểm tra chuyển gen dự kiến có kích thước 1383 bp (Bảng 2.1) 2.3.1.2 Phân lập gen 21 Tách chiết RNA tổng số tổng hợp cDNA RNA tổng số tách chiết Trizol Reagent Kit cDNA tổng hợp theo quy trình Maxima® First Strand cDNA Synthesis Kit tách chiết theo quy trình hướng dẫn nhà sản xuất Bảng 2.1 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu Ký hiệu Sản phẩm dự kiến (bp) Trình tự nucleotide (5’-3’) DAT-NcoI-F/ CATGCCATGGATGGAGTCAGGAAAAATATC DAT-NotI-R TTGCGGCCGCATTAGAAACAAATTGAAGTA XbaI-DAT-F/ CGTCTAGAATGGAGTCAGGAAAAATATCGG 1320 1383 cmyc-KDELSacI-R CCGAGCTCCTAGAGTTCGTCTTTGGAACC Kỹ thuật PCR khuếch đại gen CrDAT Gen CrDAT khuếch đại kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu Thành phần phản ứng PCR trình bày bảng 2.2 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) PCR Master Mix 2X 12,5 DAT-NcoI 10pmol/ µl 1,0 DAT-NotI 10pmol/ µl 1,0 DNA cDNA khn 500ng/ µl 2,0 Nước khử ion - 8,5 22 Tổng thể tích 25 Phản ứng thực theo chu kỳ nhiệt: 94o phút, lặp lại 30 chu kỳ, chu kỳ nhiệt độ thời gian giai đoạn biến tính 94oC phút, gắn mồi 58oC phút, tổng hợp 72oC phút 30 giây); ổn định mẫu kết thúc phản ứng 72oC phút, bảo quản 4oC 2.3.1.3 Tách dòng gen Kỹ thuật tách dòng gen thực theo Sambrook Russell (2001) [90], gồm bước tinh gen, gắn đoạn DNA vào vector tách dòng pBT, chọn dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp kỹ thuật colony PCR, cắt kiểm tra gen CrDAT plasmid tái tổ hợp Tinh gen Gen CrDAT tinh kít GenJET PCR Purification hãng Fermentas theo quy trình hướng dẫn nhà sản xuất Gắn đoạn CrDAT vào vector tách dòng pBT Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1%; tinh sản phẩm PCR theo GenJET PCR Purification Kit gắn vào vector tách dòng pBT để tạo plasmid tái tổ hợp mang gen CrDAT với điều kiện phản ứng 20oC thành phần phản ứng trình bày bảng 2.3 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen CrDAT vào vector tách dòng STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) T4 DNA Ligase Buffer 10X 2,0 T4 DNA Ligase u/µl 1,0 CrDAT 100ng/ µl 12 23 pBT 100ng/ µl 3,0 Nước khử ion - 2,0 Tổng 20 Biến nạp vector tách dòng vào tế bào khả biến E.coli DH5α Sau tạo vector tách dòng pBT biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α sốc nhiệt (42oC phút 30 giây) Sau sốc nhiệt bổ sung 200 - 300 µl LB lỏng để nuôi phục hồi 37oC, nuôi lắc 200 rpm Vi khuẩn mang vector tái tổ hợp cấy chọn lọc môi trường LB đặc bổ sung X-gal 30 mg/l, IPTG 100 µM, kháng sinh carbenicillin 50 mg/l Sau ni 37oC 16 (Bảng 2.4) Bảng 2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn Môi trường LB lỏng Thành phần Bacto pepton 10 g/l +NaCl 10 g/l + Yeast Extract g/l, pH =7 LB đặc LB lỏng + agar 10 g/l Chọn dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp kỹ thuật colony - PCR Chọn lọc khuẩn lạc màu trắng có khả mang plasmid tái tổ hợp gen CrDAT, hịa vào µl nước khử ion, dùng dung dịch để làm DNA khuôn cho phản ứng colony - PCR Sử dụng cặp mồi đặc hiệu DATNcoI/DAT-NotI Thành phần phản ứng colony - PCR chu kỳ nhiệt thực phản ứng PCR mô tả phần Plasmid tái tổ hợp thu nhận cách tách chiết theo phương pháp tách dòng phân tử theo Sambrook Russell (2001) [56] 24 Cắt kiểm tra gen CrDAT plasmid tái tổ hợp Sử dụng enzyme giới hạn BamHI để xác định có mặt gen CrDAT với thành phần, điều kiện phản ứng 37oC thành phần phản ứng trình bày bảng 2.5 Sản phẩm kiểm tra kỹ thuật điện di gel agarose 0,8 % Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt DNA BamHI STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) BamHI Buffer 10X 1,0 BamHI u/µl 1,0 Plasmid 200ng/ µl 5,0 Nước khử ion - 3,0 Tổng 10 Trình tự gen CrDAT xác định thiết bi giải ̣ trình tự gen tự động ABI Prism 3130 - Hoa Kỳ Số liệu xử lý phần mềm Tin sinh học, Blast NCBI, BioEdit DNAStar 2.3.2 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT Tải FULL (77 trang): https://bit.ly/3HJSohw Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net Vector chuyển gen mang gen CrDAT thiết kế theo hai bước (1) Thiết kế cấu trúc độc lập mang gen chuyển CrDAT; (2) Gắn cấu trúc chứa gen CrDAT vào vector chuyển gen thực vật pBI121 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT phân lập từ dừa cạn tóm tắt sơ đồ hình 2.2 2.3.2.1 Thiết kế cấu trúc độc lập mang gen chuyển CrDAT 25 Xử lý vector tái tổ hợp pBT - CrDAT vector pRTRA 7/3 cặp enzyme giới hạn NcoI/NotI tạo đầu dính tương ứng với thành phần điều kiện phản ứng trình bày bảng 2.6 Dựa vào kích thước phân đoạn DNA, lựa chọn tinh băng điện di theo kít GenJET PCR Purification để thu nhận thành phần cần cho thiết kế vector gồm gen đích mang gen CrDAT Tải FULL (77 trang): https://bit.ly/3HJSohw Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net vector trung gian pRTRA 7/3 Nco I Not I Nco I CrDAT Not I 2SP, antiABA 35S pBT – CrDAT cmyc KDEL polyA p R T R A7 /3 Hind III Hind III Hind III HindIII 35S CrDAT cmyc KDEL polyA RB nptII nptII GUS LB pBI121 pRTRA7/3-CrDAT RB MSC 35S CrDAT cmyc KDEL polyA LB pBI121-CrDAT Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrDAT Tiến hành phản ứng ghép nối gen CrDAT với vector pRTRA 7/3 mở vòng sau tinh sạch, bổ sung T4 ligase xúc tác cho trình gắn nối nhằm tạo vector trung gian tái tổ hợp pRTRA 7/3 chứa cấu trúc mang gen chuyển CrDAT (35S-DAT-cmyc-KDEL) Vector tái tổ hợp pRTRA 7/3 mang gen chuyển CrDAT (pRTRA 7/3 – DAT) đưa vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α biến nạp nhờ sốc nhiệt chọn dòng tái tổ hợp colony - PCR với cặp mồi đặc hiệu DAT-NcoI/DAT-NotI 26 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid NotI/ NcoI STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) Orange Buffer 10X 2,0 NcoI u/µl 2,0 NotI u/µl 1,5 Plasmid 200ng/ µl 8,0 Nước khử ion - 6,5 Tổng 20 2.3.2.2 Gắn cấu trúc mang gen chuyển CrDAT vào vector chuyển gen pBI121 Xử lý vector pRTRA - CrDAT pBI121 với enzyme giới hạn HindIII với thành phần thể bảng 2.7 Dựa vào kích thước phân đoạn DNA, lựa chọn tinh băng điện di theo kít GenJET PCR Purification để thu nhận thành phần cần thiết Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt plasmid HindIII STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) Red Buffer 10X 2,0 HindIII u/µl 2,0 Plasmid 200ng/ µl 10 8309939 ... cao Xuất phát từ lý thực đề tài: ? ?Tách dịng biểu gen mã hóa enzyme deacetylvindoline-4-Oacetyltransferase (DAT) tham gia tổng hợp alkaloid từ dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) ” Mục tiêu... NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC Tên đề tài TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DEACETYL VINDOLINE 4-O-ACETYLTRASFERASE (DAT) THAM GIA. .. sinh tổng hợp alkaloid dừa cạn Trong năm g? ??n đây, đường chuyển hóa tổng hợp alkaloid dừa cạn nghiên cứu chi tiết Ở mức độ phân tử, đường chuyển hóa tổng hợp terpenoid indole alkaloid (TIA) dừa cạn