(Đồ án hcmute) tổng hợp và đánh giá các đặc tính xúc tác giả enzyme horseradish peroxidase của hệ hemin biến tính bằng gelatin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ VẬT LIỆU TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH XÚC TÁC GIẢ ENZYME HORSERADISH PEROXIDASE CỦA HỆ HEMIN BIẾN TÍNH BẰNG GELATIN GVHD: ĐÀO VĨNH ÁI GVHD: NGUYỄN VĂN TOÀN SVTH: DƯƠNG ANH TÚ MSSV: 16130083 SKL 0 5 Tp Hồ Chí Minh, tháng 08/2020 an TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ VẬT LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH XÚC TÁC GIẢ ENZYME HORSERADISH PEROXIDASE CỦA HỆ HEMIN BIẾN TÍNH BẰNG GELATIN GVHD: TS ĐÀO VĨNH ÁI NCS NGUYỄN VĂN TOÀN SVTH: DƯƠNG ANH TÚ MSSV: 16130083 Khóa: 2016-2020 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2020 an TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ VẬT LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH XÚC TÁC GIẢ ENZYME HORSERADISH PEROXIDASE CỦA HỆ HEMIN BIẾN TÍNH BẰNG GELATIN GVHD: TS ĐÀO VĨNH ÁI NCS NGUYỄN VĂN TOÀN SVTH: DƯƠNG ANH TÚ MSSV: 16130083 Khóa: 2016-2020 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2020 an TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HCM KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BM CƠNG NGHỆ VẬT LIỆU CỢNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc Tp Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 08 năm 2020 NHIỆM VỤ KHĨA ḶN TỚT NGHIỆP Giảng viên hướng dẫn: TS Đào Vĩnh Ái, NCS Nguyễn Văn Toàn Cơ quan công tác giảng viên hướng dẫn: Phịng thí nghiệm FM&D, Viện nghiên cứu Khoa học Cơ Ứng dụng, Đại học Duy Tân Sinh viên thực hiện: Dương Anh Tú MSSV: 16130083 Tên đề tài: Tổng hợp và đánh giá các đặc tính xúc tác giả enzyme Horseradish Peroxidase hệ Hemin biến tính bằng Gelatin Nội dung khóa luận: – Tổng hợp hệ xúc tác Gelatin–Histamine–Hemin – Đánh giá hoạt lực xác tác Guiaicol – Đánh giá hoạt tính xúc tác Pyrogallol – Đánh giá khả tạo hydrogel Gelatin–Tyramine Các sản phẩm dự kiến - Bài báo cáo Ngày giao đồ án: 25/05/2020 Ngày nộp đồ án: 31/08/2020 Tiếng Anh  Tiếng Việt  Trình bày bảo vệ: Tiếng Anh  Tiếng Việt  Ngơn ngữ trình bày: Bản báo cáo: TRƯỞNG BỘ MÔN GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN (Ký, ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) an KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ VẬT LIỆU CỢNG HÒA XÃ HỢI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Đợc lập – Tự – Hạnh phúc ******* NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ và tên Sinh viên: Dương Anh Tú MSSV: 16130083 Ngành: Công nghệ Vật liệu Tên đề tài: Tổng hợp và đánh giá các đặc tính xúc tác giả enzyme Horseradish Peroxidase hệ Hemin biến tính bằng Gelatin Họ và tên Giáo viên hướng dẫn: TS Đào Vĩnh Ái, NCS Nguyễn Văn Toàn Cơ quan công tác GV hướng dẫn: Đại học Duy Tân Địa chỉ: Phịng thí nghiệm FM&D, Viện Nghiên cứu Khoa học Cơ Ứng dụng, Trường Đại học Duy Tân, Số 01A đường TL29, Phường Thạnh Lộc, Quận 12, Tp Hờ Chí Minh NHẬN XÉT Về nội dung đề tài và khối lượng thực hiện:  Về nội dung đề tài: Sinh viên Dương Anh Tú thực đề tài “Tổng hợp và đánh giá các đặc tính xúc tác giả enzyme Horseradish Peroxidase hệ Hemin biến tính bằng Gelatin” Thực đầy đủ nội dung u cầu, bao gờm (1) tìm hiểu về các quá trình hình thành liên kết ngang bằng phương pháp vật lý và hoá học để tạo thành hydrogel; (2) tìm hiểu về các đặc tính xúc tác enzyme Horseradish Peroxidase, Hemin và các phương pháp biến tính để tăng độ hoà tan Hemin môi trường nước trung tính; (3) tìm hiểu về các đặc tính Gelatin và hydrogel sở Gelatin; (4) nghiên cứu tổng hợp các hệ xúc tác Gelatin-Histamine-Hemin ở các tỉ lệ (w/w) khác nhau; (5) đánh giá hiệu suất tổng hợp, hoạt lực enzyme, hoạt tính xúc tác, độc tính nguyên bào sợi và khả tạo hydrogel hệ xúc tác; (6) phân tích các đặc tính hệ xúc tác thông qua các phép đo phổ đại phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1HNMR), phổ hấp thụ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR), quang phổ tán xạ Raman và phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis)  Khối lượng thực hiện: Khối lượng thực nhiều từ lý thuyết đến thực nghiệm phân tích kết Để hồn thành tốt đề tài, sinh viên Dương Anh Tú việc thực quy trình thực nghiệm nghiêm túc, cịn phải hiểu được nguyên tắc, các cách xử lý số liệu kết hợp với đồ thị kèm (sử dụng phần mềm Origin) phép đo xác định hoạt lực và hoạt tính xúc tác, các phép phân tích phổ để chứng minh tổng hợp hệ xúc tác thành công, đặc biệt là phương pháp xác định độc tính nguyên bào sợi sử an dụng phương pháp nhuộm Sulforhodamine B và phương pháp nhuộm Acridine Orange/Ethidium Bromide Tinh thần học tập, nghiên cứu sinh viên: Sinh viên Dương Anh Tú chịu khó tìm tòi đọc các tài liệu liên quan đến khoá luận, chủ động công việc, thực nghiêm túc quy trình thực nghiệm được yêu cầu bởi giảng viên hướng dẫn và tuân thủ đúng nội quy và quy định phòng thí nghiệm FM&D Kết đạt được từ khoá luận hoàn toàn xứng đáng với thời gian và công sức sinh viên Ưu điểm: Đề tài đã thành công việc biến tính tính Hemin bằng chất mang Gelatin nhằm cải thiện khả hoà tan Hemin môi trường nước trung tính Ngoài ra, hoạt lực, hoạt tính và khả tạo hydrogel hệ xúc tác cũng cải thiện đáng kể so với Hemin chỉ được hoạt hoá môi trường kiềm (không có chất mang Gelatin) Đây là hướng nghiên cứu về việc sử dụng protein tự nhiên để biến tính Hemin ứng dụng xúc tác cho quá trình hình thành liên kết ngang tạo hydrogel, từ đó đánh giá khả thay thế enzyme Horseradish Peroxidase Khuyết điểm: Mặc dù là hướng nghiên cứu bằng việc kết hợp các tính chất vượt trội Gelatin để biến tính Hemin và đạt kết khá tốt, nhiên, đề tài không có đủ thời gian để khảo sát nhiều yếu tố sinh học hoạt tính sinh học, khả tương hợp sinh học, giảm cấp sinh học mơi trường khống,… để làm phong phí thêm cho các kết thực nghiệm Đồng thời, sinh viên Tú về kỹ xử lý số liệu và phân tích đặc trưng các phổ chưa thực gây ấn tượng Đề nghị cho bảo vệ hay không? Đồng ý cho sinh viên Dương Anh Tú bảo vệ trước Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp Điểm: (Bằng chữ: ) Tp Hồ Chí Minh, ngày 11 tháng 09 năm 2020 Giáo viên hướng dẫn (Ký & ghi rõ họ tên) an KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ VẬT LIỆU CỘNG HÒA XÃ HỢI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Đợc lập – Tự – Hạnh phúc ******* NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN Họ và tên Sinh viên: MSSV: Ngành: Tên đề tài: Họ và tên Giáo viên phản biện: Cơ quan công tác GV phản biện: Địa chỉ: NHẬN XÉT Về nội dung đề tài và khối lượng thực hiện: Ưu điểm: Khuyết điểm: Kiến nghị câu hỏi: Đề nghị cho bảo vệ hay không? Điểm: (Bằng chữ: ) Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 20 Giáo viên phản biện (Ký & ghi rõ họ tên) an LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp, ngoài nổ lực thân, nhận được quan tâm, hỗ trợ và giúp đỡ thầy cô, gia đình và bạn bè Tôi xin gửi lời cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hờ Chí Minh nói chung và q thầy Bộ mơn Cơng nghệ Vật Liệu nói riêng đã giúp đỡ, tạo điều kiện và hỗ trợ rất nhiều suốt quá trình học tập cũng suốt quá trình thực luận văn tốt nghiệp Để thực được luận văn này, đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS Đào Vĩnh Ái và NCS Ngũn Văn Toàn thuộc Phịng thí nghiệm FM&D, Viện nghiên cứu Khoa học Cơ Ứng dụng, Đại học Duy Tân Hai thầy đã định hướng, cung cấp kiến thức, kinh nghiệm cũng là chỉ bảo tận tình suốt thời gian thực khoá luận tốt nghiệp Bên cạnh đó, xin cảm ơn anh Nguyễn Đình Trung cùng các anh chị, các bạn làm việc phòng Vật Liệu Hoá Dược, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng TPHCM đã giúp đỡ thực đề tài luận văn tốt nghiệp Sau cùng, xin cảm ơn gia đình, thầy cô, bạn bè đã tin tưởng, bên cạnh ủng hộ, giúp đỡ và động viên tinh thần để có thể thực tốt đề tài luận văn tốt nghiệp mình Một lần nữa, chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 08 năm 2020 Sinh viên thực Dương Anh Tú i an LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn nội dung, kết được trình bày khóa ḷn tốt nghiệp tơi thực hướng dẫn khoa học TS Đào Vĩnh Ái và NCS Nguyễn Văn Toàn Tôi xin cam đoan các nội dung được tham khảo khóa luận tốt nghiệp đã được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo qui định Nếu phát có bất kỳ gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về nội dung khoá luận Luận văn này được thực sử dụng máy móc thiết bị có sẵn Phòng thí nghiệm FM&D Trường Đại học Duy Tân, Phịng Vật liệu Hóa dược Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng và các đối tác Phịng thí nghiệm Đờng thời, TS Đào Vĩnh Ái và NCS Nguyễn Văn Toàn cũng hỗ trợ gần toàn kinh phí (hóa chất sử dụng máy móc) cho nghiên cứu Kết chỉ sử dụng để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp HCM Chỉ TS Đào Vĩnh Ái và NCS Nguyễn Văn Toàn được quyền sử dụng kết nghiên cứu để công bố khoa học TP.Hờ Chí Minh, ngày 31 tháng 08 năm 2020 Sinh viên thực Dương Anh Tú ii an MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ ix DANH MỤC PHỤ LỤC xii LỜI MỞ ĐẦU xiii CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Hydrogel 1.2 Các xúc tác cho quá trình tạo hydrogel 11 1.2.1 Enzyme Horseradish Peroxidase (HRP enzyme) 11 1.2.2 Hemin 18 1.3 Hydrogel sở Gelatin 22 1.4 Cơ sở, mục tiêu và ý nghĩa khoa học đề tài 26 1.4.1 Cơ sở đề tài 26 1.4.2 Mục tiêu và ý nghĩa khoa học đề tài 27 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 28 2.1 Hoá chất và thiết bị sử dụng thực nghiệm 28 2.1.1 Hoá chất 28 2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 29 2.2 Tổng hợp hệ xúc tác Gelatin–Histamine–Hemin 30 2.2.1 Tổng hợp Gelatin–Histamine 30 2.2.2 Tổng hợp Gelatin–Histamine–Hemin 31 iii an aggregate system under UV/solar light irradiation: A surface modification method” Surf Interfaces 1, pp 52–58 [47] Yuezhen H., Xiaoxun W., Jian S., Shoufeng J., Hongqi C., Feng G., Lun W (2014) “Fluorescent blood glucose monitor by hemin–functionalized graphene quantum dots based sensing system” Anal Chim Acta 810, pp.71–78 [48] Renjis T and Pradeep T (2005) “Interaction of azide ion with hemin and cytochrome c immobilized on Au and Ag nanoparticles” Langm 21 (25), pp 11896– 11902 [49] Peter A., Julio D (2010), “Physical Chemistry”, Oxford University Press, Great Britain, pp 876-884 [50] Ana E., Fernanda S., Orlando F., Oldair D (2008) “Development of a spot test for peroxidase activity monitoring during a purification procedure” Quim Nova 31 (4), pp 731–734 [51] Minami T., Kuroishi T., Ozawa A., Shimauchi H., Endo Y., Sugawara S (2007) “Histamine amplifies immune response of gingival fibroblasts” Journal of dental research, 86 (11), pp 1083-1088 [52] Leonardi A., DeFranchis G., De Paoli M., Fregona I., Plebani M and Secchi, A.G (2002) “Histamine-induced cytokine production and ICAM-1 expression in human conjunctival fibroblasts” Current eye Res 25 (3), pp.189-196 s 75 an PHỤ LỤC PL1.1 Phổ 1H–NMR Gel–His dung môi D2O PL1.2 Phổ hồng ngoại Ge 76 an PL1.3 Phổ hồng ngoại His PL1.4 Phổ hồng ngoại Ge–His 77 an PL1.5 Phổ hồng ngoại He PL1.6 Phổ hồng ngoại hệ xúc tác Ge–His–He 78 an PL1.7 Kết dựng đường chuẩn để xác định hiệu suất phản ứng (EE) và hiệu suất mang He (HL) 79 an PL1.8 Kết đo hoạt lực hệ xúc tác Ge–His–He (1:0,25) 80 an PL1.9 Kết đo hoạt lực hệ xúc tác Ge–His–He (1:0,5) 81 an PL1.10 Kết đo hoạt lực hệ xúc tác Ge–His–He (1:0,75) 82 an PL1.11 Kết đo hoạt lực hệ xúc tác Ge–His–He (1:1) 83 an PL1.12 Kết đo hoạt lực He được hoạt hoá NaOH (He–Na) 84 an PL1.13 Kết đo hoạt lực HRP 85 an PL1.14 Các thông số về hiệu suất phản ứng và hiệu tạo liên liên kết phức giữa He và hệ Gel–His Hệ xúc tác : 0,25 : 0,5 : 0,75 1:1 Nồng độ He theo lý thuyết (ppm) 8,33 10,71 12,5 Nồng độ He thực tế đo (ppm) 3,149 4,859 6,124 6,477 Độ hấp thụ trung bình bước sóng 385.5nm 0,367 0,558 0,699 0,740 Nồng độ Hemin hệ xúc tác trung bình– C (%) 12,60 ± 0,50 19,44 ± 0,20 24,50 ± 0,3 25,91 ± 0,4 Hiệu suất tổng hợp hệ xúc tác trung bình– H (%) 62,98 ± 2,40 58,31 ±0,54 57,16 ± 0,75 51,82 ± 0,76 Thông số PL1.15 Kết khảo sát thời gian gel hoá hệ xúc tác Ge–His–He ứng với các hàm lượng H2O2 khác Hàm lượng H2O2 (%) Hàm lượng H2O (%) Thời gian gel hoá (giây) 0.01 84,89 130 ± 0.02 84,88 38 ± 3 0.03 84.87 27 ± 0.04 84,86 20 ± STT Hệ xúc tác (Gel–His)– He Hàm lượng xúc tác (%) Hàm lượng Gel–Tyr (%) : 0,75 0,1 15 86 an PL1.16 Kết khảo sát thời gian gel hoá hệ xúc tác Gel–His–He ứng với các hàm lượng xúc tác khác STT Hệ xúc tác (Ge–His)– He Hàm lượng xúc tác (%) Hàm lượng Ge–Tyr (%) Hàm lượng H2O2 (%) 0,04 : 0,75 0,06 0.04 15 0.08 0,1 Hàm lượng H2O (%) Thời gian gel hoá (giây) 84,92 121 ± 84,90 37 ± 84.88 25 ± 84,86 20 ± PL1.17 Các thông số tối ưu cho quá trình tạo hydrogel Hàm lượng xúc tác (%) Hàm lượng Ge–Tyr (%) Hàm lượng H2O2 (%) Hàm lượng H2O (%) 0,1 15 0,04 84,86 PL1.18 Kết khảo sát thời gian gel hoá ba hệ xúc tác với các thông số tối ưu STT Xúc tác Hệ Ge–His–He 1:0,75 HRP He–Na Hàm lượng xúc tác (%) Hàm lượng Ge–Tyr (%) Hàm lượng H2O2 (%) Hàm lượng H2O (%) Thời gian gel hoá (giây) 20 ± 0,1 15 0,04 84.86 17 ± 70 ± 87 an PL19 Kết gây độc tế bào nguyên bào sợi (Fibroblast) 88 an S an K L 0 ... tính xúc tác giả enzyme Horseradish Peroxidase hệ Hemin biến tính bằng Gelatin Nội dung khóa luận: – Tởng hợp hệ xúc tác Gelatin? ??Histamine? ?Hemin – Đánh giá hoạt lực xác tác Guiaicol –... hệ xúc tác Gelatin? ??Histamine? ?Hemin 30 2.2.1 Tổng hợp Gelatin? ??Histamine 30 2.2.2 Tổng hợp Gelatin? ??Histamine? ?Hemin 31 iii an 2.2.3 Hoạt hoá Hemin môi trường kiềm (Hemin? ??NaOH)... suất tổng hợp Gelatin? ??Histamine? ?Hemin 32 2.3 Đánh giá hoạt lực Gelatin? ??Histamine? ?Hemin Guaiacol 33 2.4 Đánh giá hoạt tính xúc tác hệ xúc tác Gelatin? ??Histamine? ?Hemin Pyrogallol