Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme này

-1ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC KHOA HỌC Nguyễn Ngọc Mai “Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh trùng Lecanicillium lecanii đánh giá tính chất enzyme này” Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -2- MỞ ĐẦU Chitin phân bố rộng rãi tự nhiên, polysaccharide phổ biến thứ hai sau cellulose Nó chuỗi polymer chứa đơn phân N-acetylglucosamine liên kết liên kết β-1,4-glucoside, có trọng lượng phân tử cao, khơng hòa tan nước dung môi hữu khác Chitin thành phần cấu trúc vỏ lớp biểu bì động vật chân đốt, giáp xác, lồi côn trùng thành tế bào nấm Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân, phân cắt chitin thành sản phẩm khác N-acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose Chitinase có nhiều loại thể sống khác bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật không xương sống, thực vật động vật có xương sống Chitinase ứng dụng nhiều ngành nông nghiệp tác nhân nhằm kiểm soát nấm gây bệnh thực vật, kiểm sốt trùng Trong y dược, chitinase có giá trị phòng trừ dịch bệnh, tổng hợp chitooligosaccharide hoạt hóa… Hiện nay, người ta nghiên cứu tách chiết chitinase phân giải chitin từ nguồn khác vi khuẩn, nấm, động vật, thực vật… có chitinase vi sinh vật tổng hợp, đặc biệt từ nấm sợi có hoạt tính cao, ổn định với nhiệt độ pH Hiện nay, việc phòng ngừa trùng có hại cho trồng biện pháp biến sử dụng thuốc trừ sâu hóa học Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học với liều lượng ngày cao, tần suất nhiều ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người môi trường sinh thái Với ưu điểm vượt trội thân thiện với người môi trường thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học lựa chọn có tiềm lớn xu hướng phát triển nông nghiệp bền vững Lecanicillium lecanii số chủng nấm entomopathogenic, mà trước biết đến rộng rãi Verticillium lecanii, hiểu dạng anamorphic nhóm Trùng thảo Hầu Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -3hết, entomopathogens kí sinh thể trùng Tuy nhiên, số entomopathogens tồn trồng Vì vậy, L lecanii spp có hai vật chủ trùng thực vật Trong tự nhiên, nấm Lecanicillium spp kí sinh gây bệnh côn trùng phá hoại cây, đặc biệt rệp Lecanicillium có độc lực mạnh số loài rệp như: rệp đào (Myzus persicae) rệp (Aphis gossypii) Do vậy, bào tử nấm Lecanicillium spp quan tâm vấn đề kiểm sốt trùng sâu hại Từ vấn đề thực tiễn nêu trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh trùng Lecanicillium lecanii đánh giá tính chất enzyme này” Mục tiêu đề tài: Sử dụng biện pháp đột biến để cải biến chủng, tăng hoạt tính chitinase Đồng thời, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase Nội dung đề tài: - Gây đột biến chủng nấm lecanicillium lecanii cách sử dụng hóa chất gây đột biến NTG (N–methyl–N'–nitron–nitrosoguanidine) tia UV (tia cực tím) - Sàng lọc chủng nấm kí sinh trùng có hoạt tính chitinase cao - Tối ưu mơi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh trùng đột biến sàng lọc - Xác định tính chất chitinase Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -4- Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITINASE 1.1.1 Giới thiệu chitinase Chitinase [poly-β-1,4-(2-acetalmido-2-deoxy)-D-glucoside glucanohydrolase] thuộc nhóm glycosyl hydrolase, enzyme thùy phân chitin thành đơn phân chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác thủy giải liên kết β-1,4-glucoside C1 C4 hai phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp chitin Kí hiệu chitinase EC3.2.1.14 Trong đó: → Hydrolase → Glycosylase → Glycosidase 14 → Chitinase Chitinase có tên gọi khác tùy theo xuất xứ enzyme chitodextrinase, β-poly-N-acetylglucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC (Streptomyces griceus)…[98] Chitinase tìm thấy lồi có thành phần cấu trúc chứa chitin nấm, côn trùng, giáp xác, đến lồi khơng có chitin vi khuẩn, thực vật [59] Ở sinh vật chứa chitin, chitinase đóng vai trò q trình phát sinh hình thái phân chia tế bào Tùy thuộc vào loài sinh vật khác mà tổng hợp chitinase với mục đích khác Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân hủy chitin tạo nguồn carbon Ở thực vật động vật, chitinase nằm hệ thống chống lại tác nhân gây bệnh nấm cách phá vỡ thành tế bào chứa chitin nấm [91] Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -5Cơ chất chitinase chitin số dẫn xuất Chitin [111] Chitin [(C8H13O5N)n] dạng polysaccharide phổ biến tự nhiên, tạo thành đơn phân N-acetylglucosamine liên kết với liên kết β-1,4-glucoside Về mặt cấu trúc , chitin có cấu trúc tương tự cellulose, điểm khác biệt nhóm acetamido vị trí số khung carbon chitin thay nhóm hdroxyl (-OH) cellulose [71] Hình 1.1: Cấu trúc hóa học chitinase Chitin có hoạt tính hóa học thấp, màu trắng, cứng có chứa nitrogen Nó khơng hòa tan nước, kiềm lỗng hay đặc, rượu hầu hết dung mơi hữu thơng thường Nó tan axit vơ đặc (HCl, H2SO4, H3PO4…) số dung môi khác (hexafluro isopropanol, hexafluro acetone…) [69], [94] Một số động vật không xương sống côn trùng, huyễn thể, giáp xác giun tròn, chitin thành phần cấu trúc quan trọng lớp vỏ Ở động vật thủy sản, đặc biệt vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực, hàm lượng chitin chiếm cao từ 14 – 35% so với trọng lượng khô [10] Trong giới thực vật, chitin có thành tế bào nấm số tảo Chlorophiceae [85] Các dẫn xuất chitinase Chitinase thủy phân số dẫn xuất chitin glycol-chitin, carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfat, 4-methylumbellferyl-tri N-acetyl chititrioside (MUC – phát huỳnh quang) [33], [60] không thủy phân số chất: chitin nitrat, cellulose, hyaluronic acid, alginic acid mucin Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B 1.1.2 Phân loại chitinase  Dựa vào phản ứng phân cắt Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-β-chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) [60] Endochitinase (EC 3.2.1.14): nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin cách ngẫu nhiên tạo đoạn oligosaccharide Các enzyme nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 ± 0,2 M2 = 40kDa, pI2 = 3,9), Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 78) Chitin-1,4-β-chitobiosidase: enzyme phân cắt chitin tạo thành sản phẩm dimer chitobiose N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase): enzyme tiếp tục phân cắt chitin từ đầu cho sản phẩm nhóm monomer N-acetyl-D-glucosamin Hình 1.2: Sơ đồ phân cắt chitinase enzyme thuộc nhóm chitinase [117]  Dựa vào cấu trúc phân tử Chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18, Glycohydrolase 19 Glycohydrolase 20 [60] Họ Glycohydrolase 18: Là họ lớn với khoảng 180 chi, tìm thấy hầu hết loài thuộc Eukaryote, Prokaryote virus Họ bao gồm chủ yếu chitinase, ngồi có chitodextrinase, chitobiase N-acetyl glucosaminidase Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm xoắn α/β cuộn tròn, hoạt động thơng qua chế kiểm sốt mà đoạn β-polymer bị phân cắt tạo sản phẩm β-anomer [43] Chúng thủy phân liên kết GlcNAc – GlcNAc, GlcNAc – GlcN chế giữ ngun cấu hình anomeric Hoạt tính chitinase thuộc họ 18 bị ức chế allosamidin [53] Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 bao gồm chitinase từ thực vật (Arabidosis, dưa leo, họ đậu, thuốc lá…), nấm (Aphanocladium, Rhizopus, Saccharomyces…), vi khuẩn (Alteromonas, Bacillus, Serratia, Streptomyces…), virus động vật [53] Họ Glycohydrolase 19: Họ gồm 130 chi, thường thấy chủ yếu thực vật cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum)… ngồi có xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với vòng xoắn hoạt động thông qua chế nghịch chuyển Họ Glycohydrolase 20 Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces người Hình 1.3: Cấu trúc khơng gian họ Glycohydrolase 18 (A) họ Glycohydrolase 19 (B) [118]  Dựa vào trình tự amino acid Ngồi ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), định vị enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành nhóm [88]: Nhóm I: đồng phân enzyme phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua đoạn giàu glycin prolin đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng gắn kết enzyme chất chitin không cần cho hoạt động xúc tác Nhóm II: đồng phân enzyme phân tử có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein đầu N peptid nhận biết đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase nhóm I Chitinase nhóm II có thực vật, nấm, vi khuẩn Chúng cảm ứng tác nhân bên ngồi Nhóm III: trình tự amino acid hồn tồn khác với chitinase nhóm I II Nhóm IV: đồng phân enzyme chủ yếu có hai mầm, 41 – 47% trình tự amino acid tâm xúc tác chúng tương tự chitinase nhóm I, phân tử có đoạn giàu cystein kích thước phân tử nhỏ đáng kể so với chitinase nhóm I Nhóm V: dựa liệu trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) giảm nhiều lần q trình tiến hóa thực vật bậc cao 1.1.3 Nguồn thu nhận chitinase Chitinase diện hầu hết giới sinh vật bao gồm vi sinh vật, thực vật động vật [37], [60], [94]  Chitinase vi khuẩn Chitinase tìm thấy Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus đặc biệt nhóm Streptomycetes Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân giải chitin môi trường nhằm sử dụng nguồn cacbon cho sinh trưởng phát triển Chitinase vi khuẩn enzyme cấu trúc enzyme cảm ứng Tuy nhiên môi trường nuôi cấy vi sinh vật người ta cho thêm chitin nguồn chất kích thích làm tăng khả tổng hợp chitinase, đồng thời ổn định hoạt tính chitinase sau q trình tách chiết  Chitinase nấm Các loài nấm sợi có khả tạo chitinase Các chủng nấm mốc cho chitinase cao Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia đặc biệt nấm lớn Lycoperdon, Coprinus Tương tự vi khuẩn, chitinase nấm đóng vai trò quan trọng mặt dinh dưỡng, khác hoạt động chúng linh hoạt trình phát triển phát sinh hình thái nấm chitin thành phần vách tế bào nấm Chitinase giữ vai trò hoạt động kí sinh nấm nhằm đối kháng lại loài nấm gây bệnh thực vật  Chitinase thực vật Những thực vật bậc cao có khả sinh chitinase thuốc lá, cao su, lúa mạch, cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) Ngoài ra, số loài tảo biển nguồn cung cấp chitinase [41] Chitinase thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại loại trùng nấm kí sinh gây bệnh cho trồng [44] Người ta quan sát thấy chitinase tách chiết từ cần tây có khả ức chế sợi nấm phát triển Tuy nhiên có tác giả cho chitinase có vai trò khác tham gia vào q trình hình thành phơi [35]  Chitinase động vật Ở số động vật nguyên sinh, từ mô tuyến khác hệ tiêu hóa nhiều lồi động vật khơng xương ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt thu nhận chitinase (ví dụ dịch ruột ốc sên Helix aspersa) Đối với động vật có xương sống, chitinase tiết từ tuyến tụy dịch dày loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, dịch dày loài chim, thú ăn sâu bọ Ngồi ra, chitinase thu nhận từ dịch biểu bì giun tròn suốt q trình phát triển dịch tiết biểu bì lồi chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngồi (cuticun) chúng q trình biến thái hay lột xác [33] 1.2 NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHITINASE 1.2.1 Sơ lược nghiên cứu chitinase  Nghiên cứu giới So với enzyme protease, amylase… chitinase nghiên cứu chậm Chitinase lần đầu mô tả Bernad (1911) ảnh hưởng Bảng phụ lục 9: Ảnh hưởng pH môi trường đến khả sản xuất chitinase chủng N30.8 Hoạt tính chitinase (UI/ml) pH môi trường lên men Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) pH 0,892 0,736 0,728 0,785 ± 0,093 pH 1,298 1,462 1,251 1,337 ± 0,111 pH 1,415 1,345 1,330 1,363 ± 0,046 pH 1,337 1,322 1,439 1,366 ± 0,064 pH 1,017 1,064 1,142 1,074 ± 0,063 pH 1,056 0,947 0,744 0,915 ± 0,159 pH 0,705 0,830 0,837 0,790 ± 0,075 pH 10 0,439 0,283 0,267 0,330 ± 0,095 Bảng phụ lục 10: Ảnh hưởng độ dày chất đến khả sản xuất chitinase chủng N30.8 Độ dày chất Hoạt tính chitinase (UI/ml) Hoạt tính trung bình (UI/ml) Lần Lần Lần 5g 1.285 1.400 1.337 1.341 ± 0.057 10g 1.484 1.434 1.384 1.434 ± 0.050 15g 1.494 1.517 1.611 1.540 ± 0.062 20g 1.408 1.525 1.376 1.436 ± 0.078 25g 1.189 1.134 1.322 1.215 ± 0.096 30g 1.056 1.173 1.220 1.150 ± 0.085 Bảng phụ lục 11: Ảnh hưởng nguồn Nitơ đến khả sản xuất chitinase chủng N30.8 Hoạt tính chitinase (UI/ml) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) cao nấm men 1.369 1.369 1.384 1.374 ± 0.009 pepton 1.400 1.298 1.181 1.293 ± 0.109 cao thịt 1.572 1.330 1.165 1.356 ± 0.204 bột đậu tương 1.337 1.673 1.517 1.509 ± 0.168 NH4Cl 1.595 1.697 1.494 1.595 ± 0.102 NH4NO3 1.165 1.220 1.165 1.184 ± 0.032 (NH4)2SO4 1.447 1.376 1.173 1.332 ± 0.142 KNO3 1.025 1.478 1.611 1.371 ± 0.307 ure 1.001 0.876 1.119 0.999 ± 0.121 Nguồn nitơ Bảng phụ lục 12: Ảnh hưởng nguồn muối kim loại đến khả sản xuất chitinase chủng N30.8 Hoạt tính chitinase (UI/ml) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) MnCl2 1.322 1.447 1.275 1.348 ± 0.104 MgSO4 1.455 1.361 1.540 1.452 ± 0.113 FeSO4 1.353 1.337 1.228 1.306 ± 0.101 CaCl2 1.244 1.267 1.501 1.337 ± 0.143 Muối kim loại Bảng phụ lục 13: Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sản xuất chitinase chủng N30.8 Hoạt tính chitinase (UI/ml) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) days 0.236 0.330 0.587 0.384 ± 0.182 days 1.087 1.134 0.915 1.046 ± 0.115 days 1.806 1.908 2.001 1.905 ± 0.098 days 1.572 1.634 1.439 1.548 ± 0.100 days 1.408 1.376 1.611 1.465 ± 0.127 days 1.345 1.337 1.220 1.301 ± 0.070 days 1.634 1.736 1.798 1.723 ± 0.083 days 0.955 1.126 1.025 1.035 ± 0.086 10 days 0.861 1.087 0.798 0.915 ± 0.152 Thời gian lên men Bảng phụ lục 14: Hoạt tính chitinase L lecanii N30.8 loại mơi trường Hoạt tính chitinase (UI/ml) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) MT 1,048 0,837 0,853 0,913 ± 0,118 MT bổ sung crapek 1,314 1,423 1,220 1,319 ± 0,102 MT tối ưu 1,486 1,634 1,712 1,611 ± 0,115 Môi trường Bảng phụ lục 15: Ảnh hường nồng độ chitin keo đến hoạt tính chitinase Hoạt tính chitinase (UI/ml) Nồng độ chitin keo (%) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) 0,01% 1,056 1,197 1,125 1,126 ± 0,071 0,05% 1,443 1,586 1,675 1,568 ± 0,117 0,1% 1,919 1,889 1,635 1,814 ± 0,156 0,5% 2,001 2,119 1,871 1,997 ± 0,124 1,0% 1,236 1,145 1,141 1,174 ± 0,054 1,5% 1,092 1,239 1,107 1,146 ± 0,081 2,0% 1,028 1,205 1,004 1,079 ± 0,110 2,5% 0,996 0,813 0,957 0,922 ± 0,096 Bảng phụ lục 16: Ảnh hường nhiệt độ đến hoạt tính chitinase Hoạt tính chitinase (µmol/ml) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) 30 C 1,563 1,229 1,319 1,370 ± 0,173 40 C 1,774 1,487 1,428 1,563 ± 0,185 50 C 1,878 2,065 2,132 2,025 ± 0,132 55 C 1,810 1,836 1,747 1,798 ± 0,046 60 C 1,639 1,599 1,322 1,520 ± 0,173 65 C 1,245 0,948 0,916 1,036 ± 0,181 0,331 0,391 0,293 0,338 ± 0,049 Nhiệt độ 70 C Bảng phụ lục 17: Ảnh hường pH đến hoạt tính chitinase Hoạt tính chitinase (µmol/ml) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) 0,719 0,805 0,727 0,750 ± 0,048 1,756 1,982 1,876 1,871 ± 0,113 2,108 2,151 1,953 2,071 ± 0,104 1,879 1,885 2,067 1,944 ± 0,107 1,394 1,425 1,519 1,446 ± 0,065 1,153 1,249 1,136 1,179 ± 0,061 0,504 0,436 0,641 0,527 ± 0,104 10 0,473 0,619 0,518 0,537 ± 0,075 pH Bảng phụ lục 18: Ảnh hường ion kim loại đến hoạt tính chitinase Hoạt tính chitinase (µmol/ml) Ion kim loại Lần Lần không 2,011 2+ Ca Mg Fe 2+ 2+ Mn K 2+ + Cu 2+ So sánh Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) 2,109 1,953 2,024 ± 0,079 - 2,325 2,429 2,285 2,346 ± 0,074 ↑ 1,887 1,918 1,995 1,933 ± 0,056 ↓ 2,005 1,976 1,871 1,951 ± 0,071 ↓ 1,630 1,724 1,618 1,657 ± 0,058 ↓ 2,442 2,368 2,337 2,382 ± 0,054 ↑ 1,692 1,866 1,732 1,763 ± 0,091 ↓ -i- LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Văn Hạnh, Trưởng Phòng Các chất chức Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, chỉnh sửa luận văn tạo điều kiện hóa chất thiết bị nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán nghiên cứu Phòng Các chất chức sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ việc tiến hành thí nghiệm Tơi xin chân thành cảm ơn đến thầy cô khoa Khoa học Sự sống, Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên quý thầy cô Viện Cơng nghệ Sinh học tận tình truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình bạn bè, người ln ln động viên, hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho thời gian học tập thực luận văn Thái Nguyên, tháng 10 năm 2013 Giáo viên hướng dẫn Học viên thực TS Vũ Văn Hạnh Nguyễn Ngọc Mai Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -ii- MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ iv MỞ ĐẦU Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITINASE 1.1.1 Giới thiệu chitinase 1.1.2 Phân loại chitinase 1.1.3 Nguồn thu nhận chitinase 1.2 NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHITINASE 10 1.2.1 Sơ lược nghiên cứu chitinase 10 1.2.2 Ứng dụng chitinase 12 1.3 NẤM KÍ SINH CƠN TRÙNG LECANICILLIUM LECANII 15 1.4 ĐỘT BIẾN VÀ CẢI BIỂN CHỦNG 17 1.4.1 Giới thiệu đột biến 17 1.4.2 Sự cải biến chủng giới 17 1.4.3 Sự cải biến chủng Việt Nam 18 1.5 RỆP VÀ THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC 19 1.5.1 Tổng quan rệp hại trồng 19 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B 1.5.2 Tình hình rệp hại trồng 20 1.5.3 Thuốc diệt trùng có nguồn gốc sinh học 23 1.5.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất sử dụng 24 Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 28 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -iii2.1.1 Chủng vi sinh vật 28 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 28 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 28 2.1.4 Dung dịch đệm 29 2.1.5 Thiết bị thí nghiệm 29 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Phương pháp định lượng vi sinh vật 31 2.2.2 Quy trình tạo chitin từ vỏ tôm, vỏ cua 33 2.2.3 Phương pháp đột biến NTG 34 2.2.4 Phương pháp gây đột biến NTG kết hợp với tia UV 35 2.2.5 Tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase 36 2.2.6 Xác định hoạt tính chitinase 37 2.2.7 Xác định số tính chất lý hóa chitinase 41 Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 KẾT QUẢ ĐỘT BIẾN VÀ SÀNG LỌC CHỦNG 43 3.1.1 Ảnh hưởng NTG tia UV đến sống sót bào tử 43 3.1.2 Hoạt tính dòng đột biến NTG 44 3.1.3 Hoạt tính dòng đột biến NTG + UV 46 3.1.4 Sàng lọc tổng hợp dòng có hoạt tính cao 47 3.2 TỐI ƯU MÔI TRƯỜNG LÊN MEN XỐP SẢN XUẤT CAO SẢN CHITINASE 49 3.2.1 Tối ưu nguồn chất lên men xốp 49 3.2.2 Tối ưu tỷ lệ chất 50 3.2.3 Ảnh hưởng độ ẩm nhiệt độ 51 3.2.4 Ảnh hưởng nồng độ chitin (%) 52 3.2.5 Ảnh hưởng pH 53 3.2.6 Ảnh hưởng độ dày chất Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B54 -iv3.2.7 Ảnh hưởng nguồn Nitơ 55 3.2.9 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 56 3.2.10 So sánh môi trường tối ưu môi trường 58 3.3 TÍNH CHẤT LÝ HĨA CỦA CHITINASE 59 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt tính enzyme 59 3.3.2 Nhiệt độ tối ưu 59 3.3.3 pH tối ưu cho hoạt động chitinase 60 3.3.4 Ảnh hưởng ion kim loại 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -i- LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: - Luận văn sản phẩm nghiên cứu - Số liệu luận văn điều tra trung thực - Tôi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Học viên Nguyễn Ngọc Mai Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -ii- DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU ∆OD : Hiệu số mật độ quang mẫu test mẫu blank bp : Base pair CFU : Colony forming unit cs : Cộng ĐC : Đối chứng DNS : Dinitrosalicylic acid ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay EMS : Ethyl methanesulfonate EPN : Entomopathogenic nematodes kDa : Kilodalton M : Khối lượng riêng NTG : N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine OD : Optical density PDA : Potato dextrose agar PDB : Potato dextrose broth pI : Điểm đẳng điện (Isoelectric point) spp : Species pluriel UI : International Unit UV : Ultra violet v/w : Volume/weight W : Watte w/v : Weight/volume w/w : Weight/weight Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -3- DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tình hình thiệt hại số trồng rệp Anh 20 Bảng 2.1: Cách pha dung dịch đệm 28 Bảng 2.2: Danh sách thiết bị thí nghiệm sử dụng 28 Bảng 2.3: Số lượng khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên sau xử lý NTG 34 Bảng 2.4: Số lượng khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên sau xử lý NTG + UV 35 Bảng 2.5: Pha nồng độ glucosamine 37 Bảng 3.1: Hoạt tính số dòng đột biến xử lý NTG 44 Bảng 3.2: Hoạt tính số dòng đột biến với NTG UV 46 Bảng 3.3: Hoạt tính dòng đột biến tổng hợp qua sàng lọc 47 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -4- DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1: Cấu trúc hóa học chitinase Hình 1.2: Sơ đồ phân cắt chitinase enzyme thuộc nhóm chitinase Hình 1.3: Cấu trúc khơng gian họ Glycohydrolase 18 (A) họ Glycohydrolase 19 (B) Hình 1.4: Sợi nấm bào tử L.lecanii 14 Hình 1.5: Cấu tạo ngồi rệp 18 Hình 2.1: Cách đếm tế bào buồng đếm 31 Hình 2.2: Phương pháp cấy chan bề mặt đĩa thạch 31 Hình 2.3: Cơ sở hóa học phản ứng định lượng đường khử 37 Hình 2.4: Đồ thị đường chuẩn Glucosamine 38 Hình 3.1: Tỷ lệ sống sót bào tử Ne180.7 sau 30, 60, 90, 120 150 phút xử lý NTG (A) NTG kết hợp UV (B) 43 Hình 3.2: Ảnh hưởng nguồn chất đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 48 Hình 3.3: Ảnh hưởng tỷ lệ chất đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 49 Hình 3.4: Ảnh hưởng độ ẩm đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 50 Hình 3.5: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 51 Hình 3.6: Ảnh hưởng nồng độ chitin đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 52 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -5Hình 3.7: Ảnh hưởng pH đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 52 Hình 3.8: Ảnh hưởng độ dày chất đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 53 Hình 3.9: Ảnh hưởng nguồn Nitơ đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 54 Hình 3.10: Ảnh hưởng nguồn muối kim loại đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 55 Hình 3.11: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 56 Hình 3.12: Hoạt tính chitinase Lecanicillium lecanii N30.8 môi trường lên men khác 57 Hình 3.13: Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt tính chitinas 58 Hình 3.14: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chitinase 59 Hình 3.15: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính chitinase 60 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B ... soát côn trùng sâu hại Từ vấn đề thực tiễn nêu trên, tiến hành đề tài: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh trùng Lecanicillium. .. chitinase cao - Tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng đột biến sàng lọc - Xác định tính chất chitinase Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -4- Chương... Lecanicillium lecanii đánh giá tính chất enzyme này Mục tiêu đề tài: Sử dụng biện pháp đột biến để cải biến chủng, tăng hoạt tính chitinase Đồng thời, tối ưu mơi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase