Nghiên cứu phát triển chủng tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme này

-1ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC KHOA HỌC Nguyễn Ngọc Mai “Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh trùng Lecanicillium lecanii đánh giá tính chất enzyme này” Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -2- MỞ ĐẦU Chitin phân bố rộng rãi tự nhiên, polysaccharide phổ biến thứ hai sau cellulose Nó chuỗi polymer chứa đơn phân N-acetylglucosamine đƣợc liên kết liên kết β-1,4-glucoside, có trọng lƣợng phân tử cao, khơng hịa tan nƣớc dung môi hữu khác Chitin thành phần cấu trúc vỏ lớp biểu bì động vật chân đốt, giáp xác, lồi trùng thành tế bào nấm Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân, phân cắt chitin thành sản phẩm khác nhƣ N-acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose Chitinase có nhiều loại thể sống khác bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật không xƣơng sống, thực vật động vật có xƣơng sống Chitinase đƣợc ứng dụng nhiều ngành nông nghiệp nhƣ tác nhân nhằm kiểm soát nấm gây bệnh thực vật, kiểm sốt trùng Trong y dƣợc, chitinase có giá trị phòng trừ dịch bệnh, tổng hợp chitooligosaccharide hoạt hóa… Hiện nay, ngƣời ta nghiên cứu tách chiết chitinase phân giải chitin từ nguồn khác nhƣ vi khuẩn, nấm, động vật, thực vật… nhƣng có chitinase vi sinh vật tổng hợp, đặc biệt từ nấm sợi có hoạt tính cao, ổn định với nhiệt độ pH Hiện nay, việc phịng ngừa trùng có hại cho trồng biện pháp biến sử dụng thuốc trừ sâu hóa học Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học với liều lƣợng ngày cao, tần suất nhiều ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe ngƣời môi trƣờng sinh thái Với ƣu điểm vƣợt trội thân thiện với ngƣời môi trƣờng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học lựa chọn có tiềm lớn xu hƣớng phát triển nông nghiệp bền vững Lecanicillium lecanii số chủng nấm entomopathogenic, mà trƣớc đƣợc biết đến rộng rãi nhƣ Verticillium lecanii, nhƣng đƣợc hiểu dạng anamorphic nhóm Trùng thảo Hầu Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -3hết, entomopathogens kí sinh thể trùng Tuy nhiên, số entomopathogens tồn trồng Vì vậy, L lecanii spp có hai vật chủ trùng thực vật Trong tự nhiên, nấm Lecanicillium spp kí sinh gây bệnh côn trùng phá hoại cây, đặc biệt rệp Lecanicillium có độc lực mạnh số loài rệp nhƣ: rệp đào (Myzus persicae) rệp (Aphis gossypii) Do vậy, bào tử nấm Lecanicillium spp đƣợc quan tâm vấn đề kiểm sốt trùng sâu hại Từ vấn đề thực tiễn nêu trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh trùng Lecanicillium lecanii đánh giá tính chất enzyme này” Mục tiêu đề tài: Sử dụng biện pháp đột biến để cải biến chủng, tăng hoạt tính chitinase Đồng thời, tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase Nội dung đề tài: - Gây đột biến chủng nấm lecanicillium lecanii cách sử dụng hóa chất gây đột biến NTG (N–methyl–N'–nitron–nitrosoguanidine) tia UV (tia cực tím) - Sàng lọc chủng nấm kí sinh trùng có hoạt tính chitinase cao - Tối ƣu mơi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh trùng đột biến sàng lọc - Xác định tính chất chitinase Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -4- Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITINASE 1.1.1 Giới thiệu chitinase Chitinase [poly-β-1,4-(2-acetalmido-2-deoxy)-D-glucoside glucanohydrolase] thuộc nhóm glycosyl hydrolase, enzyme thùy phân chitin thành đơn phân chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác thủy giải liên kết β-1,4-glucoside C1 C4 hai phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp chitin Kí hiệu chitinase EC3.2.1.14 Trong đó: → Hydrolase → Glycosylase → Glycosidase 14 → Chitinase Chitinase cịn có tên gọi khác tùy theo xuất xứ enzyme chitodextrinase, β-poly-N-acetylglucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC (Streptomyces griceus)…[98] Chitinase đƣợc tìm thấy lồi có thành phần cấu trúc chứa chitin nhƣ nấm, côn trùng, giáp xác, đến lồi khơng có chitin nhƣ vi khuẩn, thực vật [59] Ở sinh vật chứa chitin, chitinase đóng vai trị q trình phát sinh hình thái phân chia tế bào Tùy thuộc vào loài sinh vật khác mà tổng hợp chitinase với mục đích khác Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân hủy chitin tạo nguồn carbon Ở thực vật động vật, chitinase nằm hệ thống chống lại tác nhân gây bệnh nhƣ nấm cách phá vỡ thành tế bào chứa chitin nấm [91] Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -5Cơ chất chitinase chitin số dẫn xuất Chitin [111] Chitin [(C8H13O5N)n] dạng polysaccharide phổ biến tự nhiên, đƣợc tạo thành đơn phân N-acetylglucosamine liên kết với liên kết β-1,4-glucoside Về mặt cấu trúc , chitin có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cellulose, điểm khác biệt nhóm acetamido vị trí số khung carbon chitin đƣợc thay nhóm hdroxyl (-OH) cellulose [71] Hình 1.1: Cấu trúc hóa học chitinase Chitin có hoạt tính hóa học thấp, màu trắng, cứng có chứa nitrogen Nó khơng hịa tan nƣớc, kiềm loãng hay đặc, rƣợu hầu hết dung mơi hữu thơng thƣờng Nó tan axit vơ đặc (HCl, H2SO4, H3PO4…) số dung môi khác (hexafluro isopropanol, hexafluro acetone…) [69], [94] Một số động vật không xƣơng sống nhƣ côn trùng, huyễn thể, giáp xác giun tròn, chitin thành phần cấu trúc quan trọng lớp vỏ Ở động vật thủy sản, đặc biệt vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực, hàm lƣợng chitin chiếm cao từ 14 – 35% so với trọng lƣợng khô [10] Trong giới thực vật, chitin có thành tế bào nấm số tảo Chlorophiceae [85] Các dẫn xuất chitinase Chitinase thủy phân số dẫn xuất chitin nhƣ glycol-chitin, carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfat, 4-methylumbellferyl-tri N-acetyl chititrioside (MUC – phát huỳnh quang) [33], [60] không thủy phân số chất: chitin nitrat, cellulose, hyaluronic acid, alginic acid mucin Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -6- 1.1.2 Phân loại chitinase  Dựa vào phản ứng phân cắt Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-β-chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) [60] Endochitinase (EC 3.2.1.14): nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin cách ngẫu nhiên tạo đoạn oligosaccharide Các enzyme đƣợc nghiên cứu từ dịch chiết môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 ± 0,2 M2 = 40kDa, pI2 = 3,9), Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 78) Chitin-1,4-β-chitobiosidase: enzyme phân cắt chitin tạo thành sản phẩm dimer chitobiose N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase): enzyme tiếp tục phân cắt chitin từ đầu cho sản phẩm nhóm monomer N-acetyl-D-glucosamin Hình 1.2: Sơ đồ phân cắt chitinase enzyme thuộc nhóm chitinase [117]  Dựa vào cấu trúc phân tử Chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18, Glycohydrolase 19 Glycohydrolase 20 [60] Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -7- Họ Glycohydrolase 18: Là họ lớn với khoảng 180 chi, đƣợc tìm thấy hầu hết lồi thuộc Eukaryote, Prokaryote virus Họ bao gồm chủ yếu chitinase, ngồi cịn có chitodextrinase, chitobiase N-acetyl glucosaminidase Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm xoắn α/β cuộn tròn, hoạt động thơng qua chế kiểm sốt mà đoạn β-polymer bị phân cắt tạo sản phẩm β-anomer [43] Chúng thủy phân liên kết GlcNAc – GlcNAc, GlcNAc – GlcN chế giữ ngun cấu hình anomeric Hoạt tính chitinase thuộc họ 18 bị ức chế allosamidin [53] Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 bao gồm chitinase từ thực vật (Arabidosis, dƣa leo, họ đậu, thuốc lá…), nấm (Aphanocladium, Rhizopus, Saccharomyces…), vi khuẩn (Alteromonas, Bacillus, Serratia, Streptomyces…), virus động vật [53] Họ Glycohydrolase 19: Họ gồm 130 chi, thƣờng thấy chủ yếu thực vật nhƣ cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum)… ngồi cịn có xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với vịng xoắn hoạt động thông qua chế nghịch chuyển Họ Glycohydrolase 20 Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces ngƣời Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -8- Hình 1.3: Cấu trúc khơng gian họ Glycohydrolase 18 (A) họ Glycohydrolase 19 (B) [118]  Dựa vào trình tự amino acid Ngồi ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), định vị enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết vùng cảm ứng, ngƣời ta phân loại enzyme chitinase thành nhóm [88]: Nhóm I: đồng phân enzyme phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua đoạn giàu glycin prolin đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trị quan trọng gắn kết enzyme chất chitin nhƣng khơng cần cho hoạt động xúc tác Nhóm II: đồng phân enzyme phân tử có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein đầu N peptid nhận biết đầu C, có trình tự amino acid tƣơng tự chitinase nhóm I Chitinase nhóm II có thực vật, nấm, vi khuẩn Chúng đƣợc cảm ứng tác nhân bên Nhóm III: trình tự amino acid hồn tồn khác với chitinase nhóm I II Nhóm IV: đồng phân enzyme chủ yếu có hai mầm, 41 – 47% trình tự amino acid tâm xúc tác chúng tƣơng tự nhƣ chitinase nhóm I, phân tử có đoạn giàu cystein nhƣng kích thƣớc phân tử nhỏ đáng kể so với chitinase nhóm I Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -9Nhóm V: dựa liệu trình tự, ngƣời ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) giảm nhiều lần q trình tiến hóa thực vật bậc cao 1.1.3 Nguồn thu nhận chitinase Chitinase diện hầu hết giới sinh vật bao gồm vi sinh vật, thực vật động vật [37], [60], [94]  Chitinase vi khuẩn Chitinase đƣợc tìm thấy Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus đặc biệt nhóm Streptomycetes Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân giải chitin môi trƣờng nhằm sử dụng nguồn cacbon cho sinh trƣởng phát triển Chitinase vi khuẩn enzyme cấu trúc enzyme cảm ứng Tuy nhiên môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật ngƣời ta cho thêm chitin nhƣ nguồn chất kích thích làm tăng khả tổng hợp chitinase, đồng thời ổn định hoạt tính chitinase sau q trình tách chiết  Chitinase nấm Các lồi nấm sợi có khả tạo chitinase Các chủng nấm mốc cho chitinase cao nhƣ Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia đặc biệt nấm lớn nhƣ Lycoperdon, Coprinus Tƣơng tự nhƣ vi khuẩn, chitinase nấm đóng vai trị quan trọng mặt dinh dƣỡng, nhƣng khác hoạt động chúng linh hoạt trình phát triển phát sinh hình thái nấm chitin thành phần vách tế bào nấm Chitinase cịn giữ vai trị hoạt động kí sinh nấm nhằm đối kháng lại loài nấm gây bệnh thực vật Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -10 Chitinase thực vật Những thực vật bậc cao có khả sinh chitinase nhƣ thuốc lá, cao su, lúa mạch, cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) Ngoài ra, số loài tảo biển nguồn cung cấp chitinase [41] Chitinase thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại loại trùng nấm kí sinh gây bệnh cho trồng [44] Ngƣời ta quan sát thấy chitinase đƣợc tách chiết từ cần tây có khả ức chế sợi nấm phát triển Tuy nhiên có tác giả cho chitinase cịn có vai trị khác nhƣ tham gia vào q trình hình thành phôi [35]  Chitinase động vật Ở số động vật nguyên sinh, từ mô tuyến khác hệ tiêu hóa nhiều lồi động vật khơng xƣơng nhƣ ruột khoang, giun trịn, thân mềm, chân đốt thu nhận đƣợc chitinase (ví dụ dịch ruột ốc sên Helix aspersa) Đối với động vật có xƣơng sống, chitinase đƣợc tiết từ tuyến tụy dịch dày loài cá, lƣỡng cƣ, bò sát ăn sâu bọ, dịch dày loài chim, thú ăn sâu bọ Ngoài ra, chitinase cịn đƣợc thu nhận từ dịch biểu bì giun trịn suốt q trình phát triển dịch tiết biểu bì lồi chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngồi (cuticun) chúng q trình biến thái hay lột xác [33] 1.2 NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHITINASE 1.2.1 Sơ lƣợc nghiên cứu chitinase  Nghiên cứu giới So với enzyme nhƣ protease, amylase… chitinase đƣợc nghiên cứu chậm Chitinase lần đầu đƣợc mô tả Bernad (1911) ảnh hƣởng Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -83Bảng phụ lục 7: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sản xuất chitinase chủng N30.8 Hoạt tính chitinase (UI/ml) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) 260C 1,205 1,298 1,337 1,280 ± 0,068 280C 1,142 1,173 1,306 1,207 ± 0,087 300C 0,642 0,908 0,744 0,764 ± 0,134 370C 0,000 0,000 0,000 0,000 ± 0,000 Nhiệt độ Bảng phụ lục 8: Ảnh hƣởng nồng độ chitin (%) đến khả sản xuất chitinase chủng N30.8 Hoạt tính chitinase (UI/ml) Nồng độ chitin (%) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) 0,01% 0,642 0,611 0,830 0,694 ± 0,118 0,05% 0,915 1,158 1,134 1,069 ± 0,134 0,1% 1,283 1,314 1,259 1,285 ± 0,027 0,5% 1,345 1,267 1,244 1,285 ± 0,053 1% 1,298 1,314 1,228 1,280 ± 0,046 5% 0,744 0,915 0,798 0,819 ± 0,088 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -84Bảng phụ lục 9: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng đến khả sản xuất chitinase chủng N30.8 Hoạt tính chitinase (UI/ml) pH mơi trƣờng lên men Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) pH 0,892 0,736 0,728 0,785 ± 0,093 pH 1,298 1,462 1,251 1,337 ± 0,111 pH 1,415 1,345 1,330 1,363 ± 0,046 pH 1,337 1,322 1,439 1,366 ± 0,064 pH 1,017 1,064 1,142 1,074 ± 0,063 pH 1,056 0,947 0,744 0,915 ± 0,159 pH 0,705 0,830 0,837 0,790 ± 0,075 pH 10 0,439 0,283 0,267 0,330 ± 0,095 Bảng phụ lục 10: Ảnh hƣởng độ dày chất đến khả sản xuất chitinase chủng N30.8 Hoạt tính chitinase (UI/ml) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) 5g 1.285 1.400 1.337 1.341 ± 0.057 10g 1.484 1.434 1.384 1.434 ± 0.050 15g 1.494 1.517 1.611 1.540 ± 0.062 20g 1.408 1.525 1.376 1.436 ± 0.078 25g 1.189 1.134 1.322 1.215 ± 0.096 30g 1.056 1.173 1.220 1.150 ± 0.085 Độ dày chất Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -85Bảng phụ lục 11: Ảnh hƣởng nguồn Nitơ đến khả sản xuất chitinase chủng N30.8 Hoạt tính chitinase (UI/ml) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) cao nấm men 1.369 1.369 1.384 1.374 ± 0.009 pepton 1.400 1.298 1.181 1.293 ± 0.109 cao thịt 1.572 1.330 1.165 1.356 ± 0.204 bột đậu tƣơng 1.337 1.673 1.517 1.509 ± 0.168 NH4Cl 1.595 1.697 1.494 1.595 ± 0.102 NH4NO3 1.165 1.220 1.165 1.184 ± 0.032 (NH4)2SO4 1.447 1.376 1.173 1.332 ± 0.142 KNO3 1.025 1.478 1.611 1.371 ± 0.307 ure 1.001 0.876 1.119 0.999 ± 0.121 Nguồn nitơ Bảng phụ lục 12: Ảnh hƣởng nguồn muối kim loại đến khả sản xuất chitinase chủng N30.8 Hoạt tính chitinase (UI/ml) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) MnCl2 1.322 1.447 1.275 1.348 ± 0.104 MgSO4 1.455 1.361 1.540 1.452 ± 0.113 FeSO4 1.353 1.337 1.228 1.306 ± 0.101 CaCl2 1.244 1.267 1.501 1.337 ± 0.143 Muối kim loại Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -86Bảng phụ lục 13: Ảnh hƣởng thời gian lên men đến khả sản xuất chitinase chủng N30.8 Hoạt tính chitinase (UI/ml) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) days 0.236 0.330 0.587 0.384 ± 0.182 days 1.087 1.134 0.915 1.046 ± 0.115 days 1.806 1.908 2.001 1.905 ± 0.098 days 1.572 1.634 1.439 1.548 ± 0.100 days 1.408 1.376 1.611 1.465 ± 0.127 days 1.345 1.337 1.220 1.301 ± 0.070 days 1.634 1.736 1.798 1.723 ± 0.083 days 0.955 1.126 1.025 1.035 ± 0.086 10 days 0.861 1.087 0.798 0.915 ± 0.152 Thời gian lên men Bảng phụ lục 14: Hoạt tính chitinase L lecanii N30.8 loại mơi trƣờng Hoạt tính chitinase (UI/ml) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) MT 1,048 0,837 0,853 0,913 ± 0,118 MT bổ sung crapek 1,314 1,423 1,220 1,319 ± 0,102 MT tối ƣu 1,486 1,634 1,712 1,611 ± 0,115 Môi trƣờng Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -87Bảng phụ lục 15: Ảnh hƣờng nồng độ chitin keo đến hoạt tính chitinase Hoạt tính chitinase (UI/ml) Hoạt tính trung bình Nồng độ chitin keo (%) Lần Lần Lần (UI/ml) 0,01% 1,056 1,197 1,125 1,126 ± 0,071 0,05% 1,443 1,586 1,675 1,568 ± 0,117 0,1% 1,919 1,889 1,635 1,814 ± 0,156 0,5% 2,001 2,119 1,871 1,997 ± 0,124 1,0% 1,236 1,145 1,141 1,174 ± 0,054 1,5% 1,092 1,239 1,107 1,146 ± 0,081 2,0% 1,028 1,205 1,004 1,079 ± 0,110 2,5% 0,996 0,813 0,957 0,922 ± 0,096 Bảng phụ lục 16: Ảnh hƣờng nhiệt độ đến hoạt tính chitinase Nhiệt độ Hoạt tính chitinase (µmol/ml) Hoạt tính trung bình Lần Lần Lần (UI/ml) 300C 1,563 1,229 1,319 1,370 ± 0,173 400C 1,774 1,487 1,428 1,563 ± 0,185 500C 1,878 2,065 2,132 2,025 ± 0,132 550C 1,810 1,836 1,747 1,798 ± 0,046 600C 1,639 1,599 1,322 1,520 ± 0,173 650C 1,245 0,948 0,916 1,036 ± 0,181 700C 0,331 0,391 0,293 0,338 ± 0,049 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -88Bảng phụ lục 17: Ảnh hƣờng pH đến hoạt tính chitinase Hoạt tính chitinase (µmol/ml) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) 0,719 0,805 0,727 0,750 ± 0,048 1,756 1,982 1,876 1,871 ± 0,113 2,108 2,151 1,953 2,071 ± 0,104 1,879 1,885 2,067 1,944 ± 0,107 1,394 1,425 1,519 1,446 ± 0,065 1,153 1,249 1,136 1,179 ± 0,061 0,504 0,436 0,641 0,527 ± 0,104 10 0,473 0,619 0,518 0,537 ± 0,075 pH Bảng phụ lục 18: Ảnh hƣờng ion kim loại đến hoạt tính chitinase Hoạt tính chitinase (µmol/ml) Ion kim loại So sánh Lần Hoạt tính trung bình (UI/ml) Lần Lần không 2,011 2,109 1,953 2,024 ± 0,079 - Ca2+ 2,325 2,429 2,285 2,346 ± 0,074 ↑ Mg2+ 1,887 1,918 1,995 1,933 ± 0,056 ↓ Fe2+ 2,005 1,976 1,871 1,951 ± 0,071 ↓ Mn2+ 1,630 1,724 1,618 1,657 ± 0,058 ↓ K+ 2,442 2,368 2,337 2,382 ± 0,054 ↑ Cu2+ 1,692 1,866 1,732 1,763 ± 0,091 ↓ Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -i- LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Văn Hạnh, Trƣởng Phòng Các chất chức Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn thí nghiệm, chỉnh sửa luận văn tạo điều kiện hóa chất thiết bị nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán nghiên cứu Phòng Các chất chức sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ việc tiến hành thí nghiệm Tôi xin chân thành cảm ơn đến thầy cô khoa Khoa học Sự sống, Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên quý thầy cô Viện Cơng nghệ Sinh học tận tình truyền đạt kiến thức quý báu nhƣ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình bạn bè, ngƣời ln ln động viên, hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho thời gian học tập thực luận văn Thái Nguyên, tháng 10 năm 2013 Giáo viên hƣớng dẫn Học viên thực TS Vũ Văn Hạnh Nguyễn Ngọc Mai Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -ii- MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ iv MỞ ĐẦU Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITINASE 1.1.1 Giới thiệu chitinase 1.1.2 Phân loại chitinase 1.1.3 Nguồn thu nhận chitinase 1.2 NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHITINASE 10 1.2.1 Sơ lƣợc nghiên cứu chitinase 10 1.2.2 Ứng dụng chitinase 12 1.3 NẤM KÍ SINH CƠN TRÙNG LECANICILLIUM LECANII 15 1.4 ĐỘT BIẾN VÀ CẢI BIỂN CHỦNG 17 1.4.1 Giới thiệu đột biến 17 1.4.2 Sự cải biến chủng giới 17 1.4.3 Sự cải biến chủng Việt Nam 18 1.5 RỆP VÀ THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC 19 1.5.1 Tổng quan rệp hại trồng 19 1.5.2 Tình hình rệp hại trồng 20 1.5.3 Thuốc diệt côn trùng có nguồn gốc sinh học 23 1.5.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất sử dụng 24 Chƣơng II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 28 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -iii- 2.1.1 Chủng vi sinh vật 28 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 28 2.1.3 Môi trƣờng nuôi cấy 28 2.1.4 Dung dịch đệm 29 2.1.5 Thiết bị thí nghiệm 29 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật 31 2.2.2 Quy trình tạo chitin từ vỏ tơm, vỏ cua 33 2.2.3 Phƣơng pháp đột biến NTG 34 2.2.4 Phƣơng pháp gây đột biến NTG kết hợp với tia UV 35 2.2.5 Tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase 36 2.2.6 Xác định hoạt tính chitinase 37 2.2.7 Xác định số tính chất lý hóa chitinase 41 Chƣơng III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 KẾT QUẢ ĐỘT BIẾN VÀ SÀNG LỌC CHỦNG 43 3.1.1 Ảnh hƣởng NTG tia UV đến sống sót bào tử 43 3.1.2 Hoạt tính dịng đột biến NTG 44 3.1.3 Hoạt tính dòng đột biến NTG + UV 46 3.1.4 Sàng lọc tổng hợp dịng có hoạt tính cao 47 3.2 TỐI ƢU MÔI TRƢỜNG LÊN MEN XỐP SẢN XUẤT CAO SẢN CHITINASE 49 3.2.1 Tối ƣu nguồn chất lên men xốp 49 3.2.2 Tối ƣu tỷ lệ chất 50 3.2.3 Ảnh hƣởng độ ẩm nhiệt độ 51 3.2.4 Ảnh hƣởng nồng độ chitin (%) 52 3.2.5 Ảnh hƣởng pH 53 3.2.6 Ảnh hƣởng độ dày chất 54 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -iv3.2.7 Ảnh hƣởng nguồn Nitơ 55 3.2.9 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 56 3.2.10 So sánh môi trƣờng tối ƣu môi trƣờng 58 3.3 TÍNH CHẤT LÝ HĨA CỦA CHITINASE 59 3.3.1 Ảnh hƣởng nồng độ chất đến hoạt tính enzyme 59 3.3.2 Nhiệt độ tối ƣu 59 3.3.3 pH tối ƣu cho hoạt động chitinase 60 3.3.4 Ảnh hƣởng ion kim loại 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -i- LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: - Luận văn sản phẩm nghiên cứu - Số liệu luận văn đƣợc điều tra trung thực - Tôi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Học viên Nguyễn Ngọc Mai Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -ii- DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU ∆OD : Hiệu số mật độ quang mẫu test mẫu blank bp : Base pair CFU : Colony forming unit cs : Cộng ĐC : Đối chứng DNS : Dinitrosalicylic acid ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay EMS : Ethyl methanesulfonate EPN : Entomopathogenic nematodes kDa : Kilodalton M : Khối lƣợng riêng NTG : N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine OD : Optical density PDA : Potato dextrose agar PDB : Potato dextrose broth pI : Điểm đẳng điện (Isoelectric point) spp : Species pluriel UI : International Unit UV : Ultra violet v/w : Volume/weight W : Watte w/v : Weight/volume w/w : Weight/weight Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -iii- DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tình hình thiệt hại số trồng rệp Anh 20 Bảng 2.1: Cách pha dung dịch đệm 28 Bảng 2.2: Danh sách thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng 28 Bảng 2.3: Số lƣợng khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên sau xử lý NTG 34 Bảng 2.4: Số lƣợng khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên sau xử lý NTG + UV 35 Bảng 2.5: Pha nồng độ glucosamine 37 Bảng 3.1: Hoạt tính số dòng đột biến xử lý NTG 44 Bảng 3.2: Hoạt tính số dòng đột biến với NTG UV 46 Bảng 3.3: Hoạt tính dịng đột biến tổng hợp qua sàng lọc 47 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -iv- DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1: Cấu trúc hóa học chitinase Hình 1.2: Sơ đồ phân cắt chitinase enzyme thuộc nhóm chitinase Hình 1.3: Cấu trúc không gian họ Glycohydrolase 18 (A) họ Glycohydrolase 19 (B) Hình 1.4: Sợi nấm bào tử L.lecanii 14 Hình 1.5: Cấu tạo rệp 18 Hình 2.1: Cách đếm tế bào buồng đếm 31 Hình 2.2: Phƣơng pháp cấy chan bề mặt đĩa thạch 31 Hình 2.3: Cơ sở hóa học phản ứng định lƣợng đƣờng khử 37 Hình 2.4: Đồ thị đƣờng chuẩn Glucosamine 38 Hình 3.1: Tỷ lệ sống sót bào tử Ne180.7 sau 30, 60, 90, 120 150 phút xử lý NTG (A) NTG kết hợp UV (B) 43 Hình 3.2: Ảnh hƣởng nguồn chất đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 48 Hình 3.3: Ảnh hƣởng tỷ lệ chất đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 49 Hình 3.4: Ảnh hƣởng độ ẩm đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 50 Hình 3.5: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 51 Hình 3.6: Ảnh hƣởng nồng độ chitin đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 52 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -vHình 3.7: Ảnh hƣởng pH đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 52 Hình 3.8: Ảnh hƣởng độ dày chất đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 53 Hình 3.9: Ảnh hƣởng nguồn Nitơ đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 54 Hình 3.10: Ảnh hƣởng nguồn muối kim loại đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 55 Hình 3.11: Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sản xuất chitinase chủng đột biến N30.8 chọn lọc 56 Hình 3.12: Hoạt tính chitinase Lecanicillium lecanii N30.8 môi trƣờng lên men khác 57 Hình 3.13: Ảnh hƣởng nồng độ chất đến hoạt tính chitinas 58 Hình 3.14: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính chitinase 59 Hình 3.15: Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính chitinase 60 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B ... soát côn trùng sâu hại Từ vấn đề thực tiễn nêu trên, tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh trùng Lecanicillium. .. N30.8 đƣợc sử dụng nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất chitinase 3.2 TỐI ƢU MÔI TRƢỜNG LÊN MEN XỐP SẢN XUẤT CAO SẢN CHITINASE 3.2.1 Tối ƣu nguồn chất lên men xốp Từ kết bảng phụ lục... chitinase cao - Tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng đột biến sàng lọc - Xác định tính chất chitinase Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -4- Chƣơng