Luận văn nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trong quá trình bảo quản sản phẩm

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Danh mục hóa chất sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 2 Các dung dịch sử dụng nghiên cứu 24 Bảng Công thức môi trường nuôi cấy vi sinh vật .25 Bảng Chủng vi sinh vật làm chứng dương tính cho phép thử vi sinh .27 Bảng Các máy móc thiết bị sử dụng nghiên cứu .28 Bảng Thành phần gel polyacrylamide 12,5% 35 Bảng 2.7 Lượng vi khuẩn gram âm dung nạp mật có chế phẩm 36 Bảng Hướng dẫn đọc kết kit API 20 E 40 Bảng Hàm lượng protein hoạt tính thủy phân fibrin mẫu enzyme thu kết tủa phân đoạn 43 Bảng Hàm lượng protein hoạt tính thủy phân fibrin mẫu enzyme tủa amonium sulphate .45 Bảng 3 Hàm lượng protein hoạt tính thủy phân fibrin phân đoạn enzyme sau qua cột sephadex G100 48 Bảng Tóm tắt q trình tinh enzyme lumbrokinase từ giun quế 51 Bảng Hoạt tính thủy phân casein mẫu trước sau tinh .51 Bảng Hoạt tính thủy phân fibrin sản phẩm enzyme lumbrokinase 52 Bảng Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) sản phẩm sau 54 Bảng Tổng số vi nấm (CFU/g) sản phẩm sau thời gian bảo quản 55 Bảng Kết thử giới hạn nhiễm khuẩn chế phẩm LK theo dược điển Việt Nam dành cho thuốc uống có nguồn gốc tự nhiên 64 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Cơ chế hoạt hoá plasminogen Hình Vai trị antiplasmin chế điều hịa cục máu đơng Hình Cấu trúc bậc lumbrokinase tách chiết từ loài giun đất .13 Hình Cơ chế hoạt động lumbrokinase 14 Hình Đường chuẩn plasmin 32 Hình 2 Đường chuẩn BSA 33 Hình Đường chuẩn tyrosine 34 Hình (A) Hình ảnh giun quế Perionyx escavatus sử dụng nghiên cứu; (B) Hoạt tính thủy phân đĩa fibrin mẫu dịch nghiền 42 Hình (A) Hoạt tính thủy phân fibrin mẫu enzyme thu kết tủa phân đoạn; (B) Điện di đồ mẫu enzyme tinh kết tủa phân đoạn 44 Hình 3 (A) Điện di đồ mẫu enzyme tủa amonium sulphate ; (B) Hoạt tính thủy phân fibrin mẫu enzyme tủa amonium sulphate pha lỗng 10 lần .46 Hình Sắc kí đồ phân đoạn enzyme lumbrokinase sau qua cột sephadex G100 47 Hình Hoạt tính thủy phân fibrin phân đoạn enzyme lumbrokinase sau qua cột sephadex G100 .47 Hình Điện di đồ phân đoạn enzyme lumbrokinase sau qua cột sephadex G100 49 Hình (A) Điện di đồ mẫu enzyme tinh qua cột cut – off ; (B): Hình ảnh đánh giá phần mềm dolphin 1D .50 Hình Hoạt tính thủy phân fibrin sản phẩm lumbrokinase mẻ thời điểm ban đầu .53 Hình Tổng số vi sinh vật hiếu khí mơi trường thạch casein đậu tương nồng độ 10-3 sản phẩm mẻ sau bảo quản tháng nhiệt độ phòng 54 Hình 10 Tổng số vi nấm mơi trường thạch Sabouraud dextrose nồng độ 10-1 sản phẩm mẻ sau bảo quản tháng 40C 55 Hình 11 Hình ảnh mẫu thử mơi trường tăng sinh Enterobacteria –Mossel 56 Hình 12 Mẫu thử mơi trường muối mật violet-red .57 Hình 13 Hình ảnh vi sinh vật phân lập mơi trường Mac-Conkey agar 58 Hình 14 Hình ảnh tế bào vi sinh vật môi trường Mac-conkey 58 Hình 15 Hình ảnh vi sinh vật phân lập môi trường thạch Levine - eosin xanh methylen 59 Hình 16 Hình ảnh vi sinh vật kit API 20E 59 Hình 17 Kết kit API 20 E phần mềm API WEB 60 Hình 18 Hình ảnh vi sinh vật phân lập môi trường thạch muối Manitol 61 Hình 19 Hình ảnh vi sinh vật phân lập môi trường thạch muối xylose – lysin – desoxycholat 62 Hình 20 Hình ảnh vi sinh vật phân lập môi trường thạch xanh brilliant 62 Hình 21 Hình ảnh vi sinh vật phân lập môi trường 63 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ APS Ammonium persulfate BSA Bovine serum albumin (albumin huyết bò) Cs Cộng CFU Colony forming unit (đơn vị tạo thành khuẩn lạc) EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid kDa Kilo dalton M Marker (Thang chuẩn) OD Optical density (Mật độ quang học) LK Lumbrokinase SDS Sodium dodecyl sulfate SDS- PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TCA Trichloroacetic acid t-PA Tisue plasminogen activator TEMED N, N, N', N'-Tetramethylethylenediamine u-PA Urokinase plasminogen activator WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT MỤC LỤC MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÁC BỆNH TẮC MẠCH MÁU NÃO 1.1.1 Sơ lược tình hình chung bệnh tắc nghẽn mạch máu 1.1.2 Khái niệm nguyên nhân bệnh tắc nghẽn mạch máu 1.1.3 Cơ chế đông máu chế tan huyết khối 1.1.4 Một số thuốc điều trị huyết khối 10 1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME LUMBROKINASE 12 1.2.1 Cấu trúc, đặc tính chế hoạt động lumbrokinase 12 1.2.2 Tình hình nghiên cứu enzyme Lumbrokinase giới 14 1.2.3 Tình hình nghiên cứu enzyme lumbrokinase Việt Nam 17 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC SẢN PHẨM THUỐC VÀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH HUYẾT KHỐI 18 CHƯƠNG 23 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 23 2.1.1 Nguyên liệu 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Các dung dịch đệm 23 2.1.4 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 25 2.1.5 Chủng vi sinh vật 27 2.1.6 Máy móc thiết bị 27 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.2.1 Lựa chọn nguồn nguyên liệu chuẩn bị mẫu enzyme thô 28 2.2.2 Các phương pháp tinh lumbrokinase 29 2.2.3 Xác định hoạt tính thủy phân fibrin 31 2.2.4 Xác định hàm lượng protein 32 2.2.5 Xác định hoạt tính thủy phân casein 33 2.2.6 Điện di biến tính protein gel polyacrylamide 34 2.2.7 Thử giới hạn nhiễm khuẩn 35 2.2.8 Định danh vi khuẩn Kit API 20 E 39 2.2.9 Xử lý số liệu 41 CHƯƠNG 42 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 LỰA CHỌN NGUỒN NGUYÊN LIỆU TỪ GIUN QUẾ PERIONYX ESCAVATUS 42 3.2 NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH LUMBROKINASE 43 3.2.1 Tủa phân đoạn dung môi hữu 43 3.2.2 Tủa phân đoạn kết tủa muối amonium sulphate 44 3.2.3 Tinh phương pháp sắc ký lọc gel 46 3.2.5 Thử hoạt tính thủy phân casein 51 3.3 KIỂM TRA SỰ NHIỄM KHUẨN TRONG SẢN PHẨM ENZYME LUMBROKINASE KHI BẢO QUẢN Ở NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN KHÁC NHAU 53 3.3.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí vi nấm 53 3.3.2 Tổng số vi khuẩn Gram âm dung nạp mật 56 3.3.3 Tìm vi khuẩn gây bệnh 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 KÊT LUẬN 65 KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ MỞ ĐẦU Rối loạn tim mạch mạch máu dẫn đến khoảng 26 triệu ca tử vong năm toàn giới Các rối loạn tim mạch não khơng có tỷ lệ tử vong cao tồn cầu mà cịn dẫn đến biến chứng sau tan huyết khối ảnh hưởng xấu đe dọa tính mạng nhồi máu tim, huyết khối tĩnh mạch não huyết khối tĩnh mạch [1] Trên 80% ca tử vong xảy nước có thu nhập thấp trung bình Tại nước phát triển bệnh tim mạch ngày gia tăng với phát triển xã hội [2] Tại Việt Nam, theo thống kê hội tim mạch, có khoảng 16% dân số mắc bệnh tim mạch đột quỵ Có nhiều nguyên nhân gây bệnh tim mạch như: cao huyết áp, tràn mạch máu não, xơ cứng động mạch Trong số bệnh nhân bị tai biến mạch máu não có đến 24% tử vong, 50% sống bị di chứng nặng nhẹ, có 26% bệnh nhân sống làm việc bình thường Nguyên nhân chủ yếu cục máu đông gây tắc động mạch cản trở lưu thơng máu, việc làm tan cục máu đơng đóng vai trị quan trọng việc điều trị bệnh Việc nghiên cứu, bào chế thuốc để phục vụ điều trị bệnh tim mạch nhiệm vụ cấp thiết vô quan trọng Các thuốc tan huyết khối chủ yếu nhập ngoại, số dạng thuốc tiêm, gây khó khăn cho người sử dụng, giá thành cao có nhiều tác dụng phụ khơng mong muốn, nên việc nghiên cứu, bào chế tạo sản phẩm sử dụng đường uống, an toàn, hiệu quả, giá thành rẻ nhu cầu cấp thiết Mihara cs (1991) nghiên cứu thu nhận thành cơng enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, bao gồm izozyme đặt tên chung lumbrokinase Lumbrokinase có khả thủy phân mạnh sợi fibrin - loại protein có máu để làm tan cục máu đơng Lumbrokinase xem thuốc tan huyết khối đặc hiệu, sử dụng làm thuốc uống hấp thu từ ruột vào máu hoạt hóa hệ thống fibrin nội sinh [3], [4], [5] Một ưu điểm lớn lumbrokinase so với thuốc điều trị bệnh tắc nghẽn mạch thơng dụng khác khơng có tác dụng phụ, khơng gây chảy máu hệ thống Lumbrokinase có tác dụng trực tiếp thủy phân fibrin, làm tan cục máu đơng, chất hoạt hóa khác sử dụng tPA (tisue plasminogen activator) để có tác dụng phải hoạt hóa plasminogen thành plasmin, sau plasmin có khả thủy phân fibrin, ngồi lumbrokinase có tác dụng hoạt hóa tPA Nhờ có tác dụng kép nên lumbrokinase cho hiệu cao Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, thực đề tài “Nghiên cứu tinh enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trình bảo quản sản phẩm” với mục tiêu tạo sản phẩm lumbrokinase chất lượng cao đánh giá độ an toàn sản phẩm Với đề tài trên, tập trung giải vấn đề sau: (1) Nghiên cứu phương pháp tinh enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức (2) Tạo nguyên liệu xác định tiêu vi sinh vật sản phẩm lumbrokinase trình tạo sản phẩm CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 H ỘI CHỨNG TẮC MẠCH MÁU NÃO 1.1.1 Sơ lược hội chứng tắc nghẽn mạch máu Hội chứng tắc nghẽn mạch máu (huyết khối) gây rối loạn tim mạch tai biến mạch máu não một nguyên nhân gây tử vong hàng đầu giới Liên đoàn tim mạch giới đưa thống kê ba người có một người tử vong có một người tử vong bệnh tim mạch Ở Mỹ 29 giây có một người bị bệnh mạch vành, phút có một người tử vong Tử vong bệnh tim mạch chiếm 42% toàn bộ ca tử vong, phí tổn bệnh chiếm 128 tỉ USD năm Theo thống kê Hội Đột quỵ Mỹ, 45 giây trơi qua, giới có người bị đột quỵ Và phút trơi qua, giới lại có người tử vong đột quỵ Tại Việt Nam, năm có khoảng 200.000 người bị đột quỵ, khoảng 50% số tử vong Nếu trước đây, đột quỵ thường gặp người tuổi từ 50 trở lên nay, bệnh ngày trẻ hóa Theo thống kê bệnh viện, tỷ lệ đột quỵ người trẻ tuổi có xu hướng tăng lên, trung bình khoảng 2% năm Hiện giới số người chết hoặc chịu di chứng nặng nề từ bệnh tim mạch tai biết mạch máu não ngày gia tăng, nước phát triển Ngồi cịn có nhiều bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch máu não như: tràn máu não, nhồi máu cơ tim, tắc động mạch phổi Nguyên nhân chủ yếu bệnh cục máu đơng làm tắc nghẽn mạch máu Do để hạn chế thấp tỉ lệ tử vong biến chứng bệnh tim mạch gây ra, nhà khoa học theo hướng xử lý huyết khối hình thành thành mạch Và việc làm tan cục máu đơng đóng vai trị quan trọng việc điều trị bệnh tim mạch 1.1.2 Khái niệm nguyên nhân hội chứng tắc nghẽn mạch máu Hội chứng tắc nghẽn mạch máu một chứng bệnh cục máu đông tạo thành fibrin bị đóng cục lưu giữ mạch gây tắc mạch cản trở lưu thông máu Hội chứng huyết khối tác động lên hệ thống tĩnh mạch (thuyên tắc - huyết khối tĩnh mạch) hệ thống động mạch (huyết khối động mạch xơ vữa) [6] Thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch Thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch, tắc nghẽn tĩnh mạch máu cục máu đông, bệnh tim mạch phổ biến thứ ba nước phương Tây Hàng năm có 0,1% dân số giới mắc bệnh Biểu phổ biến thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch huyết khối tĩnh mạch sâu, tượng xảy có cục máu đơng hình thành lòng tĩnh mạch sâu chi Đây bệnh lý phổ biến bệnh nhân lớn tuổi nằm liệt giường, bệnh nhân sau phẫu thuật cử động thời gian dài bệnh nhân vừa trải qua đại phẫu, hay phẫu thuật chỉnh hình Bệnh xảy bệnh nhân có bệnh di truyền dẫn đến đông máu bất thường, xảy người già, phụ nữ trẻ không miễn nhiễm, đặc biệt thời kì sinh đẻ [7] Hậu nghiêm trọng huyết khối tĩnh mạch sâu thuyên tắc động mạch phổi Tắc mạch phổi xảy cục máu đơng hay mảnh bong di chuyển đến phổi gây tình trạng tắc nghẽn mạch máu phổi Thuyên tắc phổi bệnh lý nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong cao Huyết khối động mạch xơ vữa Huyết khối động mạch xơ vữa xảy cục máu đơng hình thành mảng xơ vữa thành động mạch Khi mảng xơ vữa bị vỡ ra, chỗ máu bị hoạt hóa đơng cục gây tắc động mạch [6] Đây bệnh nguy hiểm cục máu đơng phát triển làm tắc nghẽn hồn tồn, động mạch bị tổn thương, máu qua động mạch ngừng chảy mô bên động mạch cung cấp máu rơi vào nguy bị thiếu máu, dẫn đến hậu đe dọa tính mạng người bệnh Nếu huyết khối động mạch xơ vữa xảy động mạch cung cấp máu cho tim, tượng tạo hội chứng động mạch vành cấp 64 Bảng Kết thử giới hạn nhiễm khuẩn chế phẩm LK theo dược điển Việt Nam dành cho thuốc uống có nguồn gốc tự nhiên Chỉ tiêu Yêu cầu Mẫu thử thời điểm theo dược ban đầu điển Việt (CFU/g) Nam V Mẫu thử sau bảo quản tháng 40C (CFU/g) Mẫu thử sau bảo quản tháng nhiệt độ phòng (CFU/g) Kết luận theo dược điển Việt Nam Mẻ Mẻ Mẻ Mẻ Mẻ Mẻ ≤ 104 CFU/g 95x102 50x103 71x102 43x103 90x102 47x103 Đạt ≤ 102 CFU/g 2x101 2x101 2x101 101 3x101 101 Đạt ≤ 102 CFU/g  102 102 102 102 102 102 Đạt Định tính Khơng E.coli có g g Khơng phát g Không phát g Không phát g Không phát g Không phát g Đạt Định tính S.aureus g Khơng có g Không phát g Không phát g Không phát g Không phát g Không phát g Đạt Định tính Salmonella 10 g Khơng có 10 g Khơng phát 10 g Không phát 10 g Không phát 10 g Không Không phát phát 10 10 g g Đạt Tổng số vi sinh vật hiếu khí g Tổng số nấm g Tổng số vi khuẩn gram âm dung nạp mật g Không phát g Không phát g Không phát 10 g Như vậy, sau thời gian bảo quản tháng, sản phẩm enzyme lumbrokinase ổn định đạt tiêu vi sinh vật theo quy định dược điển Việt Nam hành, sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc thực phẩm chức để điều trị hỗ trợ điều trị bệnh huyết khối 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KÊT LUẬN Từ kết thu đến kết luận sau: Đã tinh thành cơng nhóm enzyme lumbrokinase từ giun quế Perionyx escavatus có kích thước phân tử từ 25 kDa đến 45 kDa thể điện di SDS- PAGE, mức độ tinh protein đạt 78,5% sau đánh giá phần mềm dolphin 1D Lumbrokinase có hoạt tính thủy phân fibrin đạt 33495,51 IU/mg, hiệu suất 11,2 % so với dịch enzyme thô ban đầu, hoạt tính thủy phân casein đạt 76,03 IU/mg Tạo sản phẩm bột nguyên liệu lumbrokinase với tỷ lệ enzyme: chất phụ gia 5:1, hoạt tính đạt từ 3848,8 IU/g đến 4112,0 IU/g trì 93% sau tháng bảo quản 40C nhiệt độ phòng Đã xác định mức độ nhiễm vi sinh vật bột nguyên liệu lumbrokinase hai mẻ riêng biệt: (1) Tổng số vi sinh vật hiếu khí mẻ đạt 95 x 102 CFU/g, mẻ đạt 50 x 103 CFU/g; (2) Tổng số nấm hai mẻ đạt 2x101 CFU/g; (3) Tổng số vi khuẩn gram âm dung nạp mật hai mẻ 102 CFU/g; (4) Không phát E coli, S aureus g, không phát Salmonella 10 g sản phẩm Toàn tiêu thử giới hạn nhiễm khuẩn đạt tiêu chuẩn theo dược điển Việt Nam hành chế phẩm thuốc dùng đường uống có nguồn gốc tự nhiên Sau thời gian bảo quản tháng 40C nhiệt độ phòng sản phẩm ổn định đạt tiêu thử giới hạn nhiễm khuẩn theo dược điển Việt Nam hành KIẾN NGHỊ Nghiên cứu hồn thiện quy trình thu nhận, tinh enzyme lumbrokinase đưa thông số kỹ thuật ổn định Đánh giá độ an toàn sản phẩm với tiêu hóa lý, dược lý khác nhằm mục đích tạo sản phẩm lumbrokinase chất lượng cao, hiệu an toàn tạo sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh huyết khối 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Mahendra, K.V and K.K Pulicherla 2011, Lumbrokinase – A Potent and Stable Fibrin–Specific Plasminogen Activator, International Journal of Bio-Science and Bio-Technology, 3(2), 57-70 Wolf, M and K Ransberger, 1972, Press., New York Enzyme therapy, Vantage Fan, Q., et al., 2001, Some features of intestinal absorption of intact fibrinolytic enzyme III-1 from Lumbricus rubellus, Biochimica et biophysica acta, 1526(3), 286-292 Vilhardt H, et al., 1986, In vitro intestinal transport of vasopressin and its analogues, Acta Physiol Scand, 126, 601-607 Yan, X M., et al., 2010, Intestinal absorption of fibrinolytic and proteolytic lumbrokinase extracted from earthworm, Eisenia andrei, The Korean journal of physiology & pharmacology : official journal of the Korean Physiological Society and the Korean Society of Pharmacology, 14(2), 71-75 Smith, H C and et al., 1981, Coronary artery thrombosis in patients with unstable 
angina, Br Heart J, 45(4), 411-416 Pomero, F and et al., 2014, Poor predictive value of contemporary bleeding risk scores during long-term treatment of venous thromboembolism A multicentre retrospective cohort study, Thromb Haemost, 112(3), 511-521 Back, N., et al., 1958, Study on the effect of streptokinase-activated plasmin on clots in various stages of organization, J Clin Invest, 37, 864871 Phạm Thị Minh Đức, 2007, Sinh lý học, Hà Nội, NXB Y học 10 Castellino, F.J., 1981, Recent advances in the chemistry of the fibrinolytic system, Chem Rev 81, 431-446 11 Ambrus, C M., et al., 1962, On the mechanism of thrombolysis by plasmin, Circulation research, 10, 161-165 67 12 Francis, C W and V.J Marder., 1991, Fibrinolytic therapy for venous thrombosis, Progress in cardiovascular diseases, 34(3), 193-204 13 Craven, L L., 1950, Coronary thrombosis can be prevented, J Insur Med, 5(4), 47-48 14 Craven, L L., 1950, Acetylsalicylic acid, possible preventive of coronary thrombosis, Annals of western medicine and surgery, 4(2), 95 15 Sikri, N and A Bardia., 2007, A history of streptokinase use in acute myocardial infarction, Texas Heart Institute journal, 34(3), 318-327 16 Kotb, E., 2014, The biotechnological potential of fibrinolytic enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombin, Biotechnology progress, 30(3), 656-672 17 Kunamneni, A., et al., 2007, Streptokinase-the drug of choice for thrombolytic therapy, Journal of thrombosis and thrombolysis, 23(1), 9-23 18 Nakajima, N., et al., 1993, Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 57(10), 1726-1730 19 Sumi, H., et al., 1987, A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet, Experientia, 43(10), 1110-1111 20 Tai, M W and B.V Sweet, 2006, Nattokinase for prevention of thrombosis, American journal of health-system pharmacy, 63(12), 1121-1123 21 Heyman, S N., et al., 2004, The fibrinolytic system attenuates vascular tone: effects of tissue plasminogen activator (tPA) and aminocaproic acid on renal microcirculation, British journal of pharmacology, 141(6), 971978 22 Ichinose, A., et al., 1986, Localization of the binding site of tissuetype plasminogen activator to fibrin, The Journal of clinical investigation, 78(1), 163-169 68 23 Wang, Q Q., et al., 2004, Hemorrhagic activity and mechanism of FIIa, a fibrinolytic enzyme from Agkistrodon acutus venom, Acta pharmacologica Sinica, 25(4), 514-521 24 Choong, P F and A.P Nadesapillai, 2003, Urokinase plasminogen activator system: a multifunctional role in tumor progression and metastasis, Clin Orthop Relat Res, 415(58), S46-58 25 Kim, C H., et al., 1993, Purification and biochemical properties of an alkaline pullulanase from alkalophilic Bacillus sp S-1, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 57(10), 1632-1637 26 Shim, J H., et al., 1998, The Effect of Lumbrokinase, a TrypsinLike Enzyme from Lumbricus rubellus, on Human Blood Cells Heart Replacement, 6471-475 27 Sun, H, et al., 2013, Lumbrokinase attenuates diabetic nephropathy through regulating extracellular matrix degradation in streptozotocin-induced diabetic rat, Diabetes Res Clin Pract, 100, 85-95 28 Wang, Y H, et al., 2017, Lumbrokinase attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury by inhibiting TLR4 signaling, J Mol Cell Cardiol, 99, 113-122 29 Mihara, H., et al., 1991, A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm, Lumbricus rubellus, Jpn J Physiol, 41(3), 461-472 30 Dong, G Q., et al., 2004, Molecular cloning and characterization of cDNA encoding fibrinolytic enzyme-3 from earthworm Eisenia fetida, Acta biochimica et biophysica Sinica, 36(4), 303-308 31 Jin, L., et al., 2000, Changes in coagulation and tissue plasminogen activator after the treatment of cerebral infarction with lumbrokinase, Clinical hemorheology and microcirculation, 23(2-4), 213-218 32 Hu, R., et al., 2004, Codon optimization, expression, and characterization of recombinant lumbrokinase in goat milk, Protein expression and purification, 37(1), 83-88 69 33 Yuan, X., et al., 2006, Expression and characterization of earthworm Eisenia fetida lumbrokinase-3 in Pichia pastoris, Preparative biochemistry & biotechnology, 36(3), 273-279 34 Liu, X H and F Ge, 2002, Factors influencing the activity of fibrinolytic enzymes from earthworm, Eisenia fetida, Zhongguo Zhong yao za zhi, 27(6), 423-426 35 Tang, Y., et al., 2003, Multi-isomorphous replacement phasing of the earthworm fibrinolytic enzyme component A from Eisenia fetida, Science in China Series C, Life sciences / Chinese Academy of Sciences, 46(3), 263272 36 Cho, I H., et al., 2004, Purification and characterization of six fibrinolytic serine-proteases from earthworm Lumbricus rubellus, Journal of biochemistry and molecular biology, 37(2), 199-205 37 Sun, H L., et al., 2006, The cardioprotective effect and mechanism of lumbrokinase, Yao xue xue bao, 41(3), 247-251 38 Lee H C., et al., 2015, Improved Peripheral Nerve Regeneration in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats by Oral Lumbrokinase, Am J Chin Med, 43(2), 215-230 39 Tang, M., et al., 2016, Studies on Separation and Properties of Lumbrokinase in Pheretima praepinguis, Sains Malaysiana, 45(1), 115-118 40 Tingming Fu., et al., 2016, Rapid Extraction and Purification of Lumbrokinase From Lumbricus Rubellus Using a Hollow Fiber Membrane and Size Exclusion Chromatography, Biotechnol Lett, 38(2), 251-258 41 Mahendra K.V and K K Pulicherla, 2017, Broad Substrate Affinity and Catalytic Diversity of Fibrinolytic Enzyme From Pheretima posthumous-Purification and Molecular Characterization Study, Int J Biol Macromol, 95, 1011-1021 42 Lê Văn Triển, 1995, Khu hệ giun đất miền Đông Bắc Việt Nam, Hà Nội, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 70 43 Lý Thị Bích Thủy, et al., 2006, tinh xác định số tính chất enzym thuỷ phân fibrin tách chiết từ loài trùn quế Perionyx excavatus, Tạp chí Sinh học, 28(3), 77-82 44 Phan Thị Bích Trâm, et al., 2008, Khảo sát đặc điểm serineprotease từ trùn quế Perionyx excavatus, Hội nghị khoa học tồn quốc lần thứ IV Hóa sinh sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghiệp thực phẩm, 123-127 45 Nguyễn Văn Rư, 2015, Chiết tách lumbrokinase dược dụng từ loài giun quế (Perionyx excavatus) đánh giá mức độ ảnh hưởng số yếu tố đến ổn định hoạt tính enzyme, tạp chí dược học, 470, 20-26 46 TCVN 6404: 2016 (ISO 7218: 2007), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - yêu cầu chung hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật 47 http://cesti.gov.vn/chi-tiet/9105/chuyen-giao-cong-nghe/chu-dongsan-xuat-nattokinase-cho-nganh-duoc Retrieved 03/03/2020 48 Lê Thanh Hoàng, et al., 2018, Xác định độc tính cấp bán trường diễn sản phẩm lumbrokinase tái tổ hợp, Tạp chí y học, 470, 133-138 49 Nguyễn Thanh Thảo, et al., 2010, Xác định hoạt tính enzyme streptokinase chế phẩm hỗn hợp chứa streptokinase streptodornase phương pháp đo vòng ly giải., Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, 8(29), 19-22 50 Nguyễn Thị Hằng, et al., 2019, Thẩm định quy trình xác định hoạt tính enzyme nattokinase phương pháp đo quang, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, 17(65), 11-16 51 Hội đồng Dược Điển Việt Nam, 2017, Dược Điển Việt Nam, Phụ lục 13.6, Hà Nội, Nhà xuất Y học 52 British pharmacopoeia Commision, 2019, British pharmacopoeia 2019, London: Statonery office 53 Paul T Wingfield, 2016, Protein Precipitation Using Ammonium Sulfate, Curr Protoc Protein Sci., 84A.3F.1-A.3F.9 54 Berg, J M, et al., 2002, biochemistry, New York, W H Freeman 71 55 Astrup, T and S Mullertz, 1952, The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity, The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity, 40, 346-351 56 Bradford, M M., 1976, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, 72, 248-254 57 Phạm Thị Trân Châu, et al., 1997, Thực hành sinh hóa, Nhà xuất Giáo Dục 58 Laemmli, U K., 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227(5259), 680-685 PHỤ LỤC Hàm lượng protein tổng số phân đoạn enzyme lumbrokinase từ giun quế Perionyx escavatus sau qua cột sắc ký lọc gel sephadex G100 Phân đoạn OD OD Độ Hàm lượng Hàm lượng Trung bình pha lỗng protein protein hàm lượng (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) Độ lệch chuẩn 0.071 0.077 -0.002 -0.002 -0.002 0.0001 0.391 0.41 0.008 0.009 0.009 0.0004 0.873 0.891 0.024 0.025 0.024 0.0004 0.9743 0.9743 0.027 0.027 0.027 0.0000 0.9458 0.945 0.053 0.053 0.053 0.0000 0.713 0.71 0.038 0.037 0.038 0.0001 0.578 0.568 0.029 0.028 0.029 0.0005 0.399 0.405 0.017 0.018 0.018 0.0003 0.413 0.423 0.009 0.009 0.009 0.0002 10 0.276 0.276 0.005 0.005 0.005 0.0000 11 0.251 0.255 0.004 0.004 0.004 0.0001 12 0.199 0.198 0.002 0.002 0.002 0.0000 13 0.19 0.191 0.002 0.002 0.002 0.0000 14 0.164 0.166 0.001 0.001 0.001 0.0000 15 0.048 0.044 -0.003 -0.003 -0.003 0.0001 16 0.071 0.074 -0.002 -0.002 -0.002 0.0001 17 -0.01 0.01 -0.005 -0.004 -0.004 0.0005 18 0.046 0.042 -0.003 -0.003 -0.003 0.0001 19 0.066 0.061 -0.002 -0.002 -0.002 0.0001 20 0.043 0.042 -0.003 -0.003 -0.003 0.0000 21 0.073 0.075 -0.002 -0.002 -0.002 0.0000 22 0.072 0.075 -0.002 -0.002 -0.002 0.0001 23 0.081 0.077 -0.002 -0.002 -0.002 0.0001 24 0.091 0.085 -0.001 -0.001 -0.001 0.0001 PHỤ LỤC Đánh giá mức độ biểu protein mẫu enzyme lumbrokinase phần mềm Dolphin 1D Lane Band Rf O.D % biểu AmplOD IntOD MW Mass 1 0.486 0.052 0.017 0.968 0 0.016 1.121 0.512 0.08 0.039 0.968 0 0.038 2.571 0.538 0.094 0.05 4.796 0 0.240 16.332 0.558 0.132 0.081 4.796 0 0.388 26.458 0.575 0.151 0.098 4.796 0 0.470 32.011 0.624 0.101 0.037 4.796 0 0.177 12.086 0.648 0.109 0.042 2.356 0 0.099 6.739 0.823 0.125 0.02 1.073 0 0.021 1.462 0.97 0.143 0.023 0.778 0 0.018 1.219 25-45 kDa 78.5 PHỤ LỤC Cơ chế phản ứng kit Api 20E Test Cơ chất Enzyme/ Phản ứng ONPG 2-nitrophenylβDgalactopyranose Βgalactosidase ADH Arginin dihydrolase L-arginin Cơ chế Vi sinh vật có enzym phân hủy chất tạo thành onitrophenol có mầu vàng Vi sinh vật có enzym phân hủy chất tạo sản phẩm làm Lysine decarboxylase thay đổi pH dẫn đến thay đổi màu môi trường Ornithin decarboxylase LDC L-lysin ODC L-ornithin CIT Trisodium citrat Thử nghiệm xác định khả vi sinh vật sử dụng citrate, sinh CO2 làm kiềm hóa mơi trường H2S Sodium thiosulfat Thiosulfat reductase Enzym phân giải chất giải phóng H2S H2S tạo tủa màu đen với ion sắt, chì URE Ure Urease Vi sinh vật có enzym phân hủy chất thành NH3 CO2 làm thay đổi pH môi trường dẫn đến thay đổi màu thị đỏ phenol từ vàng sang đỏ TDA L-tryptophan Tryptophan Deaminase Vi sinh vật có enzym phân giải chất tạo sản phẩm, sản phẩm phản ứng với FeCl3 (thuốc thử TDA) tạo phức chất có màu đỏ nâu IND L-tryptophan Tryptophane Vi sinh vật có enzym phân deaminase VP Sodium pyruvat GEL Gelatin GLU D-glucose MAN D-manitol INO Inositol SOR D-sorbitol RHA L-rhamnose SAC D-sucrose MEL D-melibiose AMY Amygdalin ARA L-arabinose giải chất tạo indol Indol phản ứng với thuốc thử James tạo phức màu đỏ hồng Vi sinh vật lên men glucose tạo sản phẩm acetoin Acetoin + thuốc thử VP1, VP2 (KOH naphtol) tạo phức màu hồng gelatinase Vi sinh vật có enzym phân giải gelatin tạo polypeptid acid amin Lên men/oxi hóa đường Thay đổi pH môi trường → thay đổi màu thị PHỤ LỤC Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn theo Dược điển việt nam Loại chế phẩm Tổng số Tổng số vi sinh nấm vật hiếu (CFU/g khí (CFU/g CFU/ml) CFU/ml) Thuốc dùng điều trị bỏng vết loét sâu Vi sinh vật gây bệnh Khơng có vi sinh vật g (ml) Nguyên liệu hóa dược 103 102 Thành phẩm hóa dược dùng để uống (dạng khô: viên nén, viên nang) 103 102 Khơng có Escherichia coli g (ml) Thành phẩm hóa dược dùng để uống (dạng nước: siro, dung dịch) 102 101 Khơng có Escherichia coli g (ml) Thuốc dùng theo đường trực tràng 103 102 Thuốc dùng theo đường niêm mạc miệng, lợi, răng, da, mũi, tai Thuốc dùng theo đường âm đạo Thuốc dán (áp dụng cho miếng dán) 102 102 102 - - 101 Khơng có Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa g (ml) 101 Khơng có Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans g (ml) 101 Khơng có Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa miếng dán Thuốc hít (bao gồm dạng khí dung) Thuốc uống có nguồn gốc tự nhiên (động, thực vật, khoáng chất); cao thuốc, cồn thuốc dùng để sản xuất thuốc uống từ dược liệu Thuốc từ dược liệu (thuốc thang…) xử lý ethanol thấp độ nước nóng (khơng sơi) trước dùng Thuốc từ dược liệu (thuốc thang, trà…) xử lý nước sôi trước dùng 102 104 105 101 Khơng có Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, vi khuẩn gram âm dung nạp mật g (ml) 102 Không 102 CFU vi khuẩn gram âm dung nạp mật g (ml) Khơng có Salmonella 10 g Khơng có Escherichia coli, Staphylococcus aureus g (ml) 104 Không 104 CFU vi khuẩn gram âm dung nạp mật g (ml) Khơng có Salmonella 10 g Khơng có Escherichia coli g (ml) 107 105 Số lượng Số lượng tối đa tối đa được chấp chấp nhận x nhận x 107 105 Không 103 CFU Escherichia coli g (ml) Khơng có Salmonella 10 g (ml) CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Nguyễn Thị Thu Hương, Lê Thanh Hoàng, Nguyễn Thị Thảo, Nguyễn Thị Hiền Trang, Nguyễn Thị Ánh Tuyết, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Nguyễn Thị Trung, Đỗ Thị Tuyên (2019) Nghiên cứu tạo chế phẩm lumbrokinase chất lượng cao đánh giá độ ổn định chế phẩm Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc năm 2019: 102-106 ... sau: (1) Nghiên cứu phương pháp tinh enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức (2) Tạo nguyên liệu xác định tiêu vi sinh vật sản phẩm lumbrokinase trình tạo sản phẩm CHƯƠNG... từ giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trình bảo quản sản phẩm? ?? với mục tiêu tạo sản phẩm lumbrokinase chất lượng cao đánh giá độ an toàn sản phẩm Với... hoạt động lumbrokinase 12 1.2.2 Tình hình nghiên cứu enzyme Lumbrokinase giới 14 1.2.3 Tình hình nghiên cứu enzyme lumbrokinase Vi? ??t Nam 17 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC SẢN PHẨM THUỐC VÀ