HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG UNG THƯ CỦA LOÀI TẦM GỬI NĂM NHỊ (DENDROPHTHOE PENTANDRA (L ) MIQ ) NGUYỄN THỊ HẰNG*, TRẦN THỊ THANH XUÂN** TÓM TẮT Loài Tầm gửi năm nhị (Dendrophthoe pentandra(L ) Miq[.]
Nguyễn Thị Hằng tgk TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG UNG THƯ CỦA LỒI TẦM GỬI NĂM NHỊ (DENDROPHTHOE PENTANDRA (L.) MIQ.) NGUYỄN THỊ HẰNG*, TRẦN THỊ THANH XN** TĨM TẮT Lồi Tầm gửi năm nhị (Dendrophthoe pentandra(L.) Miq.) lồi bán kí sinh thường dùng để trị ho, viêm loét, ung thư Trong báo này, xác định cao nước, cao ethanol lồi kí sinh chủ (Lumnitzera racemosa Willd., Excoecaria agallocha L., Artocarpus heterophyllus Lam., Swietenia macrophylla King.) có hoạt tính kháng khuẩn chủng Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Tuy nhiên, mẫu khơng có hoạt tính kháng ung thư dòng tế bào Hela, MCF-7 NCI-H460 Từ khóa: Dendrophthoe pentandra(L.) Miq., kháng khuấn, kháng ung thư ABSTRACT Antibacterial and anticancer activities of DenfrophthoePentand (L.) Miq Dendrophthoe pentandra (L.) Miq., a semi-parasitic plant, is commonly used to treat coughs, ulcers, cancer In this study, we found that water and ethanol extracts of this mistletoe species on different host plants (including Lumnitzera racemosa Willd., Excoecaria agallocha L., Artocarpus heterophyllus Lam and Swietenia macrophylla King.) possess antibacterial activities against Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus However, these samples not have anticancer activities against Hela, MCF-7 and NCI- H460 cell lines Keywords: Dendrophthoe pentandra (L.) Miq., antibacterial, anticancer Mở đầu Loài Tầm gửi năm nhị (TGNN) (Dendrophthoe pentandra(L.) Miq.) lồi bán kí sinh nhiều lồi chủ khác Ở Ấn Độ, người ta thường dùng để trị viêm loét Ở Java, Indonesia, sử dụng để trị bệnh ung thư Ở Việt Nam, TGNN phân bố đa dạng phong phú thường dùng để trị bệnh viêm tim mạch Năm 2006, Nina artani, Yelli Ma’arifa Muhammad Hanafi tách hai hỡp chất quercitrin (C21H20O11) querceti (C15H10O7) từ cao ethanol TGNN kí sinh Khế (Averrhoa carambola) Cả hai hợp chất chứng minh có khả kháng oxi hóa cao [7] * ** ThS, Trường Đại học Sư phạm TPHCM; Email: ngthhang@yahoo.com CN, Trường Đại học Sư phạm TPHCM Cao ethanol từ cành nhỏ TGNN thu nhận từ từ rừng trồng Bogor, West Java, Indonesia có hoạt tính chống oxy hóa cao Tuy nhiên, cơng trình nghiên cứu cho thấy cao chiết TGNN khơng thể hoạt tính kháng tăng sinh tế bào ung thư vú T47D (với giá trị IC50 = 728,05 mg/mL) [11] Năm 2012, Nina Artanti, Taufik Firmansyah Akhmad Darmawan chứng minh hoạt tính gây độc tế bào ung thư, khả chống oxy hóa chống bệnh tiểu đường cao methanol cao nước lồi TGNN kí sinh bốn chủ khác (Stelechocarpus burahol, Spondias dulcis, Annona squamosa Camellia sinensis) Từ cho thấy lồi TGNN có tiềm việc trị bệnh tiểu đường nhiên khơng thể hoạt tính gây độc tế bào ung thư [6] Nik Aina Syazana Nik Zainuddin cộng (2015) nghiên cứu khả gây độc tế bào cao chiết: ether dầu hỏa, cao methanol cao nước loài TGNN thu Malaysia dòng tế bào: nguyên bào sợi (L929), tế bào cật chó MadinDarby (MDCK), tế bào cật khỉ xanh châu Phi (Vero) Các tác giả khơng xác định giá trị IC50 tất mẫu cao chiết thử nghiệm đề tài khơng thể độc tính tế bào giá trị IC50 lớn 100 µg/mL [5] Bước đầu, cơng trình nghiên cứu Phạm Văn Ngọt cộng cho thấy lồi kí sinh Mít có hoạt tính kháng khuẩn [2] Tuy nhiên, chứng khoa học hoạt tính sinh học lồi cịn hạn chế Chính thế, đề tài tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn kháng ung thư cao nước, cao ethanol lồi TGNN kí sinh số loài chủ khác nhằm tầm sốt mẫu có hoạt tính kháng khuẩn kháng ung thư cao cung cấp dẫn liệu cho y dược Vì vậy, mục tiêu nghiên cứu xác định hoạt tính kháng khuẩn kháng ung thư lồi TGNN kí sinh số đối tượng chủ Từ đó, đề tài cung cấp dẫn liệu có ý nghĩa khoa học cho nghiên cứu sâu dược học Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu nghiên cứu Lá cành nhỏ lồi TGNN kí sinh Cóc trắng (Lumnitzera racemosa Willd.), Giá (Excoecaria agallocha L.), Mít (Artocarpus heterophyllus Lam.), Nhạc Ngựa (Swietenia macrophylla King.) thu nhận TP Hồ Chí Minh Mẫu định danh theo từ điển Cây cỏ Việt Nam [ 1] Mẫu sấy khô nhiệt độ 500C trọng lượng khơng đổi, sau dùng để thu nhận cao nước vào cao ethanol Mẫu bảo quản nhiệt độ -200C Phịng Thí nghiệm Di truyền - Thực Vật (Khoa Sinh học, Trường ĐHSP TPHCM) Các chủng vi khuẩn thử nghiệm Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Shigella sp mua Viện Pasteur TPHCM, cất giữ bảo quản Phịng Thí nghiệm Sinh hóa - Vi sinh (Khoa Sinh học - Trường ĐHSP TPHCM) Dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela, ung thư vú MCF-7, ung thư phổi NCIH460 mua ngân hàng tế bào châu Âu, lưu giữ nitơ lỏng - 1960C bảo quản Phịng Thí nghiệm Sinh học phân tử - Bộ mơn Di truyền (Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TPHCM) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thu nhận cao nước, cao ethanol (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007 [3]) Cao nước thu nhận cách cho 100g mẫu khô xay nhuyễn ngâm với nước cất lần (4 giờ) nhiệt độ 70- 80 0C Dịch chiết thu nhận sau li tâm cô qua đêm nhiệt độ 50 - 600C có khối lượng khơng đổi Cao ethanol thu nhận cho 100g mẫu khô xay nhuyễn ngâm với lít ethanol tuyệt đối 48 Dịch chiết cô quay đuổi dung môi 450C, 175 mbar thu nhận cao ethanol Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư Các dịng tế bào ung thư ni môi trường E'MEM (Sigma), bổ sung phenol red 0,4%, L-glutamine 200 mM, NaHCO3 7,5%, HEPES 1M, Penicillin Streptomycin 200 IU/mL, Amphotericin - B 0,1% huyết phôi thai bò 5%, đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/giếng, điều kiện vô trùng, 370C, 5% CO2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn (Kirby - Bauer, 1966 [8]) Mật độ tế bào vi khuẩn 100.000 CFU/ đĩa Petri (d=10cm) xác định phương pháp đo mật độ quang OD bước sóng 610nm Bổ sung 100 µl dịch chiết TGNN, để 40C - giờ, kiểm tra đường kính vịng vơ khuẩn sau -12 giờ.Hoạt tính kháng khuẩn đánh giá giá trị D - d Với D: đường kính vịng phân giải, d: đường kính lỗ thạch Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư - Phương pháp Sulforhodarmine –B (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007 [4]) Các dòng tế bào ung thư ni cấy 24 giờ, sau xử lí với dịch chiết TGNN 100 µg/mL Sau 48 giờ, tế bào nhuộm với sulforhodarmine B, đo mật độ quang bước sóng 490nm 620nm Chứng dương Camptothecin 0,01µg/mL, chứng âm nước cất lần vô trùng 10% pha môi trường DMSO 0,25% Tỉ lệ ức chế tăng trưởng tế bào tính theo cơng thức: I(%) = (1 – (ODThử nghiệm/ODChứng)) x 100% Tất thí nghiệm lặp lại lần Số liệu xử lí dựa vào phần mềm Microsoft Office Excel 2007 phân tích thống kê phần mềm SPSS 11.5 Kết 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 3.1.1 Hoạt tính kháng khuẩn cao nước Cao nước pha nồng độ 100 µg/mLvà kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn Chứng âm thử nghiệm nước cất vô trùng Qua kết thí nghiệm, chúng tơi ghi nhân tất cao nước thử nghiệm nồng độ 100µg/mL có hoạt tính kháng khuẩn chủng Bacillus subtilis Staphylococcus aureus (bảng 3.1) trừ mẫu TGNN kí sinh Nhạc ngựa Trong đó, hoạt tính kháng khuẩn TGNN kí sinh Giá cao (sự khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê) Tất mẫu thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chủng Escherichia coli Shigella sp Đồng thời, ghi nhận hình ảnh ức chế tăng trưởng vi khuẩn thử nghiệm với mẫu nước sắc nồng độ 100% (hình 3.1) Bảng 3.1 Giá trị đường kính vịng vơ khuẩn mẫu cao nước nồng độ 100 µg/mL chủng vi khuẩn Mẫu/Chủng vi khuẩn Cóc trắng B subtilis S aureus 0,64a± 0,07 0,45a± 0,02 b E coli b Shigella sp - - Giá 1,11 ± 0,33 1,02 ± 0,07 - - Mít 0,96b± 0,04 0,73c± 0,06 - - Nhạc ngựa - - - - H2O - - - - Ghi chú: (-): Không có hoạt tính; a, b, c khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê so sánh theo cột Mẫu Cóc trắng Giá Các chủng vi khuẩn thử nghiệm B subtilis S aureus E coli Shigella sp Mít Nhạc ngựa Chứng âm (H2O) Hình 3.1 Vịng vơ khuẩn chủng vi khuẩn xử lí với cao nước TGNN kí sinh chủ khác 3.1.2 Hoạt tính kháng khuẩn cao ethanol Kết thử hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanolở nồng độ 100µg/mL tất mẫu thử nghiệmđều có hoạt tính chủng Bacillus subtilis Staphylococcus aureustương tự kết thử nghiệm cao nước (bảng 3.2) Theo đó, hoạt tính kháng khuẩn chủngBacillus subtilis cao mẫu TGNN kí sinh Mít thấp mẫu TGNN kí sinh Cóc trắng Giá (sự khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê) Hoạt tính kháng khuẩn chủng Staphylococcus aureus cao mẫu TGNN kí sinh Cóc trắng Nhạc ngựa thấp mẫu TGNN kí sinh Giá Tất mẫu thử khơng có hoạt tính kháng khuẩn Escherichiacoli Shigella sp Đồng thời, chúng tơi ghi nhận hình ảnh vịng vơ khuẩn thử nghiệm với mẫu cao ethanol nồng độ 100µg/mL (hình 3.2) Theo đó, tất mẫu cao ethanol có xuất vịng vơ khuẩn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Chứng tỏ cao ethanol ức chế phát triển chủng vi khuẩn thử nghiệm so với mẫu đối chứng Tóm lại, kết thử hoạt tính kháng khuẩn cao nước cao ethanol TGNN kí sinh số chủ có hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Staphylococcus aureus nồng độ khảo sát Bảng 3.2 Giá trị đường kính vịng vô khuẩn mẫu cao ethanol nồng độ 100 µg/mL chủng vi khuẩn Mẫu/Chủng vi khuẩn Cóc trắng Giá Mít Nhạc ngựa B subtilis S aureus 1,18a± 0,04 1,38a± 0,11 a 1,23 ± 0,03 b 1,47 ± 0,03 c E coli Shigella sp - - b - - c - - a 0,81 ± 0,05 1,12 ± 0,06 1,40 ± 0,02 1,37 ± 0,04 - - - - - - DMSO 50% Ghi chú: (-): Không có hoạt tính; a, b, c khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê so sánh theo cột Các chủng vi khuẩn thử nghiệm Mẫu B subtilis Cóc trắng Giá Mít S aureus E coli Shigella sp Nhạc ngựa DMSO 50% Hình 3.2 Vịng vơ khuẩn chủng vi khuẩn xử lí với cao ethanol TGNN kí sinh chủ khác 3.2 Hoạt tính kháng ung thư mẫu TGNN 3.2.1 Hoạt tính kháng ung thư cao ethanol TGNN nồng độ 100 μg/mL Tại nồng độ khảo sát 100µg/mL (nồng độ sàng lọc hợp chất có hoạt tính sinh học theo NCBI), tất mẫu thử nghiệm khơng có hoạt tính gây độc tế bào ung thư ba dòng tế bào (bảng 3.3) so với chứng dương camptothecin 3.2.2 Hoạt tính kháng ung thư cao nước TGNN nồng độ 100μg/mL Tương tự cao ethanol, kết khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư theo phương pháp Sulforhodarmine B cao nước nồng độ 100µg/mL khơng có hoạt tính kháng ung thư ba dịng tế bào (theo bảng 3.4) so với chứng dương Bảng 3.3 Tỉ lệ % gây độc tế bào ung thư mẫu cao ethanol TGNN nồng độ 100 µg/mL dòng tế bào Mẫu/Dòng tế bào ung thư HeLa MCF-7 NCI-H460 Cóc trắng 10,64b± 2,51 6,09a± 3,82 Giá 4,90a± 2,41 9,83ab±1,55 10,85a± 2,33 Mít 5,02a± 3,63 11,13b± 2,56 11,21a±3,78 Nhạc ngựa 23,58c±4,51 15,88c± 2,58 19,87b± 2,78 Camptothecin 0,01 µg/ml 43,62d±0,75 53,12d±1,18 88,08c±0,47 DMSO 0,25% 0,00 8,36a±1,31 0,00 Ghi chú: a, b, c, d khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê so sánh theo cột 0,00 Bảng 3.4 Tỉ lệ % gây độc tế bào ung thư mẫu cao nước TGNN nồng độ 100 µg/mL dịng tế bào Mẫu/Dòng tế bào ung thư HeLa MCF-7 NCI-H460 0,11a± 0,2 1,31b± 0,16 1,99ab± 0,13 Giá 2,91b± 0,31 2,92c± 0,39 2,93bc± 0,72 Mít 3,13b± 0,24 1,35b± 1,04 3.71c± 0,17 Nhạc ngựa -0,39a± 0,45 -0,42a± 1,33 1,54a± 0,57 Camptothecin 0,01 µg/ml 48,71c± 1,31 53,08d± 0,43 88,15d± 0,67 0,00 0,00 Cóc trắng DMSO 0,25% 0,00 Ghi chú: a, b, c, d khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê so sánh theo cột Các kết nghiên cứu chúng tơi hoạt tính kháng khuẩn mẫu TGNN Bacillus subtilis Staphylococcus aureus phù hợp với Y học cổ truyền Ở Ấn Độ, Indonesia, người ta thường dùng TGNN phối hợp với chè nấu nước uống trị ho, viêm [6] Kết nghiên cứu phù hợp với cơng trình nghiên cứu Phạm Văn Ngọt (2010) cho thấy lồi TGNN có hoạt tính kháng khuẩn chủng thử nghiệm [2] Ngoài ra, hợp chất chiết xuất từ TGNN quercitrin, quercetin… chứng minh có hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae [6, 7, 9] Ngồi ra, nghiên cứu cịn ghi nhận lồi TGNN kí sinh chủ khác có hoạt tính kháng khuẩn khác Mặc dù TGNN lồi bán kí sinh, q trình sống lấy nước, muối khống từ chủ; theo kết nghiên cứu này, cảm nghĩ hoạt tính sinh học TGNN cụ thể hoạt tính kháng khuẩn phụ thuộc vào chủ [10] Đặc biệt nghiên cứu này, ghi nhận mẫu TGNN kí sinh Giá Mít thể hoạt tính kháng khuẩn tất dung môi nồng độ thử nghiệm Theo từ điển Cây cỏ Việt Nam Phạm Hoàng Hộ, tác giả cho Giá có nhựa độc Nhựa có tác dụng trị ung nhọt nghiên cứu tiềm kháng ung thư [1] Bên cạnh đó, tất phận mít dùng làm thuốc như: Lá mít dùng làm thuốc lợi sữa, chữa ăn uống không tiêu, tiêu chảy trị cao huyết áp Ở Ấn Độ, người ta dùng mít chữa bệnh ngồi da rắn cắn Như vậy, nói tính chất chủ ảnh hưởng đến hoạt tính lồi bán kí sinh TGNN Mặt khác, kết nghiên cứu cho thấy có khác biệt hoạt tính kháng khuẩn mẫu TGNN chiết xuất từ cao nước cao ethanol Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, ghi nhận cao chiết ethanol thể hoạt tính kháng khuẩn cao so với cao nước điều kiện thí nghiệm, Điều chứng tỏ, dung mơi khác chất có hoạt tính sinh học chiết xuất khác ảnh hưởng đến kết thí nghiệm Vì vậy, cần phải xác định dung môi tốt để chiết xuất chất có tiềm sinh học để ứng dụng lĩnh vực khác dược học Tuy nhiên, nồng độ khảo sát 100µg/mL, tất cao nước cao ethanol mẫu TGNN khơng thể hoạt tính kháng ung thư dòng tế bào thử nghiệm Kết phù hợp với cơng trình nghiên cứu trước số nhà khoa học [5, 11] Có lẽ, nước ethanol chưa phải dung mơi thích hợp để chiết xuất hợp chất có hoạt tính kháng ung thư Kết luận Như vậy, qua kết nghiên cứu, nhận thấy TGNN thể hoạt tính kháng khuẩn theo nồng độ loại dung môi khảo sát Tuy nhiên, chúng tơi ghi nhận lồi TGNN kí sinh chủ nghiên cứu chưa thể hoạt tính gây độc tế bào ung thư nồng độ khảo sát TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, II, tr 134, Nxb Trẻ Phạm Văn Ngọt, Nguyễn Hoàng Hạt, Quách Văn Toàn Em, Hoàng Văn Tới (2010), “Nghiên cứu khả kháng khuẩn lồi Mộc kí ngũ hùng (Dendrophthoepentadra (L.) Miq.) thuộc họ Tầm gửi (Loranthaceae)”, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh, tr 67-71 Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nxb Đại học Quốc gia TPHCM Nguyễn Thái Hoàng Tâm, Nguyễn Thụy Vy, Tố Tất Trinh, Nguyễn Thị Tuyết Giang, Hồ Huỳnh Thùy Dương (2007), “Chuẩn hóa thử nghiệm SRB để xác định độc tính tế bào hợp chất tự nhiên”, Hội nghị toàn quốc nghiên cứu khoa học sống, Quy Nhơn Nik Aina Syazana Nik Zainuddin Mohd Dasuki Sul’ain (2015), “Phytochemical analysis, toxicity and cytotoxicity evaluation of Dendropthoe pentandra leaves extracts”, International journal of applied biology and pharmaceutical technology, Vol 6(1), pp 108-116 Nina Artanti, Taufik Firmansyah and Akhmad Darmawan (2012), “Bioactivities Evaluation of Indonesian Mistletoes (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) LeavesExtracts”, Journal of Applied Pharmaceutical Science, Vol 02 (01), pp 2427 7 Nina Artani, Yelli Ma’arifa and Muhammad Hanafi (2006), “ Isolation and identification of active antioxidant compound from star friut (Averrhoa carambola) mistletoe (Dendrophthoe pentandra (L Miq) ethanol extract”, Journal of Applied Sciences, Vol 6(8), pp 1659-1663 N S Egorov (1985), Antibiotíc – A scientìic approach, MIR, pp 76 – 78 Sarvani Manthri, Chaitanya Sravanthi Kota, Manjula Talluri (2011), Pharmacognostic,phytochemical and pharmacological review ofdendrophthoe falcata, Journal of Phytology, Vol 3(3), pp.18-25 10 Sylvia L P Ang, Jean W H Yong ( 2005), “A protocol for in vitrogermination and sustainable growth of two tropica”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 80, pp.221228 11 Wahyu Widowati, Tjandrawati Mozef, Chandra Risdian, Hana Ratnawati, Susy Tjahjani, Ferry Sandra (2011), “The Comparison of Antioxidative and Proliferation Inhibitor Properties of Piper betle L., Catharanthusroseus [L] G.Don, Dendrophtoe petandra L., Curcumamangga Val Extracts on T47D Cancer Cell Line”, International Research Journal of Biochemistry and Bioinformatics, 1(2), pp 022028 (Ngày Tòa soạn nhận bài: 18-3-2015; ngày phản biện đánh giá: 21-4-2105; ngày chấp nhận đăng: 18-5-2015) ... tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn kháng ung thư cao nước, cao ethanol lồi TGNN kí sinh số lồi chủ khác nhằm tầm sốt mẫu có hoạt tính kháng khuẩn kháng ung thư cao cung cấp dẫn liệu cho... kê phần mềm SPSS 11.5 Kết 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 3.1.1 Hoạt tính kháng khuẩn cao nước Cao nước pha nồng độ 100 µg/mLvà kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn Chứng âm thử nghiệm nước... ngựa DMSO 50% Hình 3.2 Vịng vơ khuẩn chủng vi khuẩn xử lí với cao ethanol TGNN kí sinh chủ khác 3.2 Hoạt tính kháng ung thư mẫu TGNN 3.2.1 Hoạt tính kháng ung thư cao ethanol TGNN nồng độ 100