Trong nghiên cứu này, hạt Nano oxy hóa khử có chứa nhóm silica (silica-containing redox nanoparticles, siRNP) được tổng hợp có kích thước khoảng 40 – 50 nm và được sử dụng để bao thuốc kháng sinh cephalothin và thuốc kháng ung thư sorafenib nhằm cải thiện tính tan cũng như tăng tính khả dụng của các thuốc này, làm tăng hiệu quả kháng khuẩn và kháng ung thư.
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học NGHIÊN CỨU LIỆU PHÁP NANO OXY HÓA KHỬ ỨNG DỤNG TRONG KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG UNG THƯ Vịng Bính Long*, Nguyễn Trịnh Quỳnh Như, Trần Ngọc Hân, Trịnh Thị Kim Xuyến, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Quỳnh Anh, Mai Thị Huyền Trang Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh * Tác giả liên lạc: vblong@hcmus.edu.vn TÓM TẮT Các bệnh nhiễm khuẩn kháng kháng sinh ung thư nguyên nhân gây tử vong hàng đầu giới, dư thừa gốc oxy hóa mạnh (ROS) tác nhân gây kháng kháng sinh ung thư ROS phân tử tín hiệu đóng vai trị quan trọng việc trì chức sinh lý thể, nhiên nồng độ cao ROS gây phá hủy DNA, protein, lipid dẫn đến nhiều bệnh lý Ngoài ra, nhiều loại thuốc sử dụng thương mại lại khó hịa tan nước, hạn chế hiệu ứng dụng lâm sàng Trong nghiên cứu này, hạt Nano oxy hóa khử có chứa nhóm silica (silica-containing redox nanoparticles, siRNP) tổng hợp có kích thước khoảng 40 – 50 nm sử dụng để bao thuốc kháng sinh cephalothin thuốc kháng ung thư sorafenib nhằm cải thiện tính tan tăng tính khả dụng thuốc này, làm tăng hiệu kháng khuẩn kháng ung thư Khi sử dụng phương pháp đo vịng kháng khuẩn, hoạt tính kháng khuẩn cephalothin bao siRNP (cephalothin@siRNP) cho thấy kết tương đương với sử dụng celphalothin hai chủng vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus (S aureus) Gram âm Escherichia coli (E coli) Đáng ý tái nhiễm E coli vào vòng kháng khuẩn xảy nhiều nhóm xử lý với cephalothin, cephalothin@siRNP giảm đáng kể tái nhiễm này, cho thấy khả giảm kháng kháng sinh Đối với hoạt tính kháng ung thư, hạt siRNP bao sorafenib (sorafenib@siRNP) tăng khả gây độc hai dòng tế bào ung thư gan (HepG2) ung thư đại trực tràng (C-26), đồng thời giảm độc tính tế bào nội mơ bình thường (BAEC) Từ khóa: Kháng ung thư, kháng thuốc, kháng oxy hóa, nano oxy hóa khử REDOX NANOPARTICLES FOR ANTIMICROBIAL AND ANTICANCER THERAPIES Vong Binh Long*, Nguyen Trinh Quynh Nhu, Tran Ngoc Han, Trinh Thi Kim Xuyen, Nguyen Thi Thu Ha, Nguyen Quynh Anh, Mai Thi Huyen Trang University of Science – VNU Ho Chi Minh City * Corresponding Author: vblong@hcmus.edu.vn ABSTRACT Cancer and bacterial infections induced by antibiotic resistance are leading causes of death globaly and are strongly related to reactive oxygen species (ROS) which are signaling mocules that play an important role in maintaining physiological functions of the body However, the high levels of ROS incur 104 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học damage to DNA, protein or lipids, which lead to many types of diseases including cancer and antibiotic resistance On the other hand, most of commercially available drugs are low bioavailability due to poor water solubility, which limit their effectiveness and clinical application In this research, silica-containing redox nanoparticles (siRNP) with 40-50 nm in size is used in loading cephalothin and sorafenib which have the potential to improve the solubility and efficency of drugs When antibiotic susceptibility testing is used, the antimicrobial activity of cephalothin-loaded siRNP (cephalothin@siRNP) showed similar results to celphalothin free in Gram-positive Staphylococcus aureus and Gram-negative Escherichia coli Interestingly, the reinfection of E coli colonies in cephalothin@siRNP was significantly less than in cephalothin free In in vitro anti-cancer study, siRNP significantly increased the toxicity of sorafenib to hepatocellular carcinoma (HepG2) and colorectal cancers (C-26), while sorafenib@siRNP remarkly decreased the toxicity of sorafenib in bovine aortic endothelial cell (BAEC) Keywords: Anti-cancer, antioxidant, drug resistance, redox nanoparticles TỔNG QUAN Việc điều trị bệnh kháng kháng sinh ung thư ngày trở nên khó khăn nhiều nguyên nhân, chủ yếu tính chất thuốc điều trị khó tan có tính độc, gây hệ không mong muốn thể người bệnh, đồng thời tượng kháng thuốc tế bào vi khuẩn tế bào ung thư trở thành vấn đề cấp bách cho toàn nhân loại (Khan, et.al, 2017; Tanwar, et.al, 2014) Vi khuẩn đa kháng thuốc trở thành thách thức ngành y học phần lạm dụng thuốc người bệnh khơng có định từ bác sĩ, từ dẫn đến hình thành chủng vi khuẩn đa kháng thuốc với chế kháng thuốc khác Đặc biệt nguyên nhân gây đa kháng thuốc đến từ việc cân gốc tự chất kháng oxy hóa (Mao, et.al, 2001) Sự có mặt nhiều gốc tự làm thay đổi cấu trúc bên cạnh làm thay đổi tương tác ổn định phân tử thuốc đích đến thuốc dẫn đến làm tác dụng thuốc Ngồi ra, việc hình thành stress oxy hóa thúc đẩy hoạt động gen có khả bơm thuốc ngược khỏi tế bào nồng độ thuốc kháng sinh cao, chế gây tượng kháng thuốc Vì vậy, việc tìm loại kháng sinh tóa n khó nhà nghiên cứu Mất cân các gốc tự chất kháng oxy hóa nguyên nhân gây ung thư Khi có mặt gốc tự tăng lên đột ngột làm hư tổn cấu trúc DNA tế bào dẫn đến đột biến phá hủy DNA, kết trình dẫn đến việc hình thành khối u Hiện nay, cơng nghệ Nano cân nhắc liệu pháp cải thiện hiệu điều trị bệnh (Seleci et.al, 2016) Nhiều hạt Nano tạo thành có tiềm ứng dụng y học, đa phần hạt Nano có chức vận chuyển thuốc, mà khơng có hoạt tính sinh học Trong nghiên cứu này, hệ Nano có hoạt tính oxy hóa khử sử dụng hệ thống phân phối thuốc giúp tăng hiệu điều trị thuốc Hạt Nano oxy hóa khử (silica-containing redox nanoparticles, siRNP) hình thành từ vật liệu Nano polymer có tương thích sinh học cao thiết kế 105 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 gồm chuỗi ưa nước (PEG) chuỗi kị nước (PMNT) có chứa Tempol có khả bắt gốc tự ROS nhóm silica tăng khả bao thuốc hình 1A (Vong, et.al, 2017), thuận lợi cho việc đóng gói thuốc giúp tăng hiệu giảm độc tính không mong muốn thuốc Do vậy, mục tiêu nghiên cứu sử dụng hạt Nano oxy hóa khử bao thuốc kháng sinh (cephalothin) thuốc kháng ung thư (sorafenib) nhằm mục đích tăng hoạt tính kháng khuẩn kháng ung thư hai loại thuốc thương mại thông qua việc bắt gốc tự ROS tăng tính khả dụng thuốc Thí nghiệm kháng khuẩn thực hai chủng vi khuẩn S aureus (Gram dương) E coli (Gram âm) thí nghiệm kháng ung thư khảo sát hai dòng tế bào tế bào ung thư gan (HepG2) tế bào ung thư đại tràng (C-26), kèm với đối chứng tế bào nội mô thường (BAEC) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Mạch polymer PEG-siPMNT dùng để tạo siRNP tổng hợp từ phịng thí nghiệm Khoa học Vật liệu đại học Tsukuba Nhật Bản Hai chủng vi khuẩn: E coli, S aureus (ATCC® 25922™; ATCC® 29213™) Thuốc kháng khuẩn celphalothin (Tokyo Chemical Industry Co Ltd) thuốc kháng ung thư sorafenib (LC Laboratories) Dòng tế bào nội mô thường BAEC, tế bào ung thư gan HepG2 tế bào ung thư đại tràng C26 từ viện RIKEN, Nhật Bản Phương pháp Phương pháp bao thuốc: Cephalothin sorafenib bao hạt Nano siRNP phương pháp thẩm tích thuốc với polymer PEG-b-siPMNT Cấu trúc PEG-b-siPMNT trình bày hình 1A Kỷ yếu khoa học Khảo sát đặc tính hạt Nano: Kích thước (nm), điện tích bề mặt, phân bố hình thái hạt Nano xác định phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) (Vong, et.al, 2017; Hossain et.al, 2014) Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa: Hoạt tính kháng oxy hóa hạt Nano siRNP phương pháp DPPH (2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl, SigmaAldrich) thông qua khả bắt gốc tự DPPH làm giảm màu tím đặc trưng, xác định cách đo độ hấp thu bước sóng 517 nm máy đo quang phổ (Bhaigyabati et.al, 2014) Hoạt tính kháng khuẩn: Hoạt tính kháng khuẩn khảo sát phương pháp khuếch tán thạch dựa kích thước đường kính vùng ức chế tăng trưởng xung quanh giếng thạch sau thời gian ủ 37ºC 24 Sự tái nhiễm vi khuẩn xác định số khuẩn lạc mọc lại vòng kháng khuẩn sau thời gian định Khảo sát hoạt tính kháng ung thư in vitro: Hoạt tính kháng ung thư xác định phương pháp MTT (3(4,5-dimethylthiazol bromide, USB Corporation Cleveland, OH USA) dựa biểu thị màu MTT với enzyme ti thể tế bào sống thành formazan Độ hấp thu formazan đo bước sóng 540 nm Khả sống sót tế bào tỷ lệ thuận với mức độ màu formazan Phương pháp thống kê: Các kết đề tài sử dụng phương pháp thống kê Student’s T-test Excel Mỗi kết lặp lại ba lần với độ lệch chuẩn xử lý thống kê Giá trị p < 0.05 hai nhóm cho thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 106 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học Hình Đặc tính hạt Nano kháng oxy hóa chứa nhóm silica (siRNP) (A) Cấu trúc mô hạt Nano siRNP; (B) Kích thước hạt Nano trước sau bao thuốc sorafenib; (C) Khả tan cephalothin bao hạt siRNP; (D) Khả kháng oxy hóa hạt Nano siRNP so với acid ascorbic Thuốc bao hạt Nano siRNP phương pháp thẩm tích Sorafenib@siRNP kích thước hạt đạt 46.19 ± 0.83 nm lớn kích thước siRNP 44.26 ± 0.57 nm (Hình 1B), điều cho thấy thuốc bao thành công hạt siRNP Ngồi ra, siRNP làm tăng tính tan cephalothin kháng sinh tan nước (Hình 1C) Kết cho thấy siRNP có khả bao tốt thuốc hòa tan nước làm tăng tính khả dụng thuốc Đồng thời, hoạt tính kháng oxy hóa hạt siRNP khảo sát phương pháp bắt gốc tự DPPH Kết cho thấy siRNP có khả kháng oxy hóa nồng độ 500 µg/ml lên đến 80% (Hình 1D), so với chứng dương acid ascorbic nồng độ Cùng với khả vận chuyển thuốc, hoạt tính kháng oxy hóa hạt nano siRNP đặc tính quan trọng làm tăng hiệu điều trị Đây điểm hạt nano siRNP so với nghiên cứu khác Hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn xác định phương pháp đo vòng kháng khuẩn Kết cho thấy vòng kháng khuẩn mẫu cephalothin cephalothin@siRNP tương tự dòng vi khuẩn E coli S aureus Tuy nhiên, điều thú vị nhận thấy mốc thời khảo sát với nồng độ khác nhau, vi khuẩn E coli xử lý với cephalothin có xuất nhiều khuẩn lạc vòng kháng khuẩn cephalothin@siRNP (Hình 2) Điều cho thấy khả làm giảm tái nhiễm E.coli hạt Nano siRNP giúp phóng thích thuốc chậm mơi trường thạch nhằm đảm bảo hoạt tính thời gian tác động lâu dài E.coli, đồng thời cho thấy khả kháng kháng sinh E coli Các nghiên cứu sâu tương lai tiến hành để tìm hiểu chế thú vị 107 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học Hình Hoạt tính kháng khuẩn cephalothin bao siRNP (A) Sự tái nhiễm E coli xử lý với cephalothin cephalothin@siRNP sau 48 (mũi tên màu đỏ); (B) Sự tái nhiễm chủng E coli hai nhóm cephalothin cephalothin@siRNP 250 µg/ml 500 µg/ml (*p < 0.05, so với nhóm xử lý với cephalothin) Hoạt tính kháng ung thư Hoạt tính kháng ung thư xác định phương pháp MTT sau tế bào xử lý với mẫu 24 Phần trăm tế bào sống sót xử lý với sorafenib@siRNP thấp so với xử lý với sorafenib nồng độ (50 µg/ml) dịng tế bào ung thư gan HepG2 Trên dòng tế bào ung thư đại trực tràng C-26, nồng độ 50 µg/ml siRNP không gây chết tế bào ung thư, xử lý với sorafenib@siRNP số lượng tế bào sống 50% thấp số lượng tế bào sống nhóm xử lý với sorafenib Kết cho thấy kết hợp thuốc sorafenib với hạt nano siRNP làm tăng khả kháng ung thư sorafenib Ngoài ra, tế bào nội mô thường BAEC, nồng độ µg/ml sorafenib, sorafenib@siRNP siRNP không gây ảnh hưởng lớn đến tế bào BAEC tăng nồng độ lên 25 50 µg/ml, tỷ lệ tế bào sống sót xử lý với sorafenib thấp (nhỏ 15%), cho thấy sorafenib có độc tính cao dịng tế bào thường, làm hạn chế hiệu điều trị thuốc Tuy nhiên, nhóm tế bào BAEC xử lý với sorafenib@siRNP, số lượng tế bào sống 61% 82% nồng độ thuốc 25 50 µg/ml sorafenib, kết cho thấy tiềm ứng dụng hạt Nano siRNP điều trị ung thư, làm giảm tác dụng phụ thuốc hóa trị lên tế bào bình thường KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, hạt Nano oxy hóa khử siRNP tổng hợp Sau bao thuốc sorafenib kích thước hạt đạt 46.19 ± 0.83 nm khoảng giá trị phù hợp ứng dụng y sinh siRNP cải thiện tính tan thuốc cephalothin sorafenib giúp tăng tính khả dụng thuốc Trong nghiên cứu kháng khuẩn, hạt Nano 108 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 cephalothin@siRNP có hoạt tính kháng khuẩn hai chủng vi khuẩn Gram dương Gram âm cao tương tự cephalothin, cephalothin@siRNP hạn chế đáng kể tái nhiễm E coli, tăng hiệu thuốc kháng sinh Trong nghiên cứu kháng ung thư hạt Nano sorafenib@siRNP, hoạt tính Kỷ yếu khoa học kháng ung thư thuốc cao đáng kể so với thuốc sorafenib dòng ung thư đại trực tràng C-26 ung thư gan HepG2, đồng thời giảm đáng kể tác dụng phụ sorafenib dòng tế bào thường Kết nghiên cứu cho thấy tiềm ứng dụng cao hạt Nano siRNP lĩnh vực y sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO BHAIGYABATI, T., P G DEVI, AND G C BAG Total Flavonoid Content and Antioxidant Activity of Aqueous Rhizome Extract of Three Hedychium Species of Manipur Valley Research Journal of Pharmaceutical, Biological, and Chemical Sciences 5.5 (2014): 970-6 KHAN SHAKIR, KHAN SHAHPER N, MEENA RAMOVATAR, DAR AYAZ M, PAL RUCHITA, KHAN ASAD U (2017) Photoinactivation of multidrug resistant bacteria by monomeric methylene blue conjugated gold nanoparticles Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 174, pp 150-161 SELECI MUHARREM, SELECI DIDEM AG, JONCYZK REBECCA, STAHL FRANK, BLUME CORNELIA, SCHEPER THOMAS (2016) Smart multifunctional nanoparticles in nanomedicine BioNanoMaterials 17(12), pp 33-41 TANWAR, JYOTI, ET AL Multidrug resistance: an emerging crisis Interdisciplinary perspectives on infectious diseases 2014 (2014) VONG LONG BINH, KIMURA SHINYA, NAGASAKI YUKIO (2017) Newly Designed Silica‐Containing Redox Nanoparticles for Oral Delivery of Novel TOP2 Catalytic Inhibitor for Treating Colon Cancer Advanced healthcare materials 6(20), p 1700428 109 ... mục tiêu nghiên cứu sử dụng hạt Nano oxy hóa khử bao thuốc kháng sinh (cephalothin) thuốc kháng ung thư (sorafenib) nhằm mục đích tăng hoạt tính kháng khuẩn kháng ung thư hai loại thuốc thư? ?ng... hạt Nano siRNP điều trị ung thư, làm giảm tác dụng phụ thuốc hóa trị lên tế bào bình thư? ??ng KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, hạt Nano oxy hóa khử siRNP tổng hợp Sau bao thuốc sorafenib kích thư? ??c... tính sinh học Trong nghiên cứu này, hệ Nano có hoạt tính oxy hóa khử sử dụng hệ thống phân phối thuốc giúp tăng hiệu điều trị thuốc Hạt Nano oxy hóa khử (silica-containing redox nanoparticles,