Nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - BÙI THỊ TÂM NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ GLYCOSIDE TIM TRONG DƢỢC PHẨM VÀ DƢỢC LIỆU LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - BÙI THỊ TÂM NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ GLYCOSIDE TIM TRONG DƢỢC PHẨM VÀ DƢỢC LIỆU Chuyên ngành : Hố Phân Tích Mã số LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN VĂN RI Hà Nội – Năm 2015 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm LỜI CẢM ƠN! Sau thời gian học tập nghiên cứu tơi hồn thành luận văn cao học với đề tài: “Nghiên cứu phương pháp định lượng số glycoside tim dược phẩm dược liệu” dƣới hƣớng dẫn, bảo PGS.TS Nguyễn Văn Ri thầy cô, anh chị em, bạn mơn Hóa phân tích Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Ri, ngƣời giao đề tài tận tình dẫn tơi q trình hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tất quý Thầy Cô môn hóa Phân tích khoa Hóa học trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình làm luận văn Tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ThS Nguyễn Công Tuấn – phòng máy HPLC tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Cuối tơi xin chân thành cảm ơn tồn thể anh chị, bạn phịng thí nghiệm Hố phân tích, bạn cao học K23 giúp đỡ tơi thời gian thực đề tài Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN! MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái quát chung hợp chất glycoside tim 1.1.1 Cấu tạo, tên gọi 1.1.2 Tác dụng hợp chất glycoside tim 1.1.3 Liên quan cấu trúc tác dụng 1.1.4 Tính chất glycoside tim 10 1.1.5 Phân bố tự nhiên 12 1.1.6 Một số loại thuốc chứa glycoside tim 13 1.2 Khái quát digoxin digitoxin 13 1.2.1 Digoxin 14 1.2.2 Digitoxin 15 1.3 Các phƣơng pháp xác định glycoside tim 15 1.3.1 Phƣơng pháp sắc kí xác định glycoside tim 15 1.3.2 Phƣơng pháp khác xác định glycoside tim 17 1.3.3 Phƣơng pháp chiết tách glycoside tim khỏi mẫu thực 20 1.3.4 Phƣơng pháp định tính định lƣợng 21 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 23 2.1 Mục tiêu đối tƣợng nghiên cứu 23 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 23 2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị 24 2.2.1 Chất chuẩn 24 2.2.2 Hoá chất 24 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 24 2.3 Phƣơng pháp phân tích 25 2.3.1 Phƣơng pháp xử lý mẫu 25 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 2.3.2 Phƣơng pháp phân tích 26 2.4 Thực nghiệm 26 2.4.1 Khảo sát điều kiện tối ƣu 26 2.4.2 Xây dựng đƣờng chuẩn 27 2.4.3 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng 27 2.4.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 29 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Tối ƣu hoá điều kiện chạy sắc ký 30 3.1.1 Van bơm mẫu 30 3.1.2 Cột tách 30 3.1.3 Detector 31 3.1.4 Bƣớc sóng hấp thụ cực đại glycoside tim .31 1.1.5 Khảo sát chọn thành phần pha động tốc độ dòng .32 3.1.6 Khảo sát độ lặp lại thiết bị 39 3.1.7 Điều kiện tối ƣu cho trình phân tích glycoside tim 40 3.2 Đƣờng chuẩn glycoside tim 42 3.2.1 Khảo sát phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chất .42 3.2.2 Dựng đƣờng chuẩn 43 3.2.3 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng 45 3.3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 46 3.3.1 Đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp phân tích 46 3.3.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp 47 3.4 Phân tích mẫu thực tế 48 KẾT LUẬN 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 Tiếng Việt: 53 Tiếng Anh: 53 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 3.1: Phổ UV glycoside tim 32 Hình 3.2: Sắc đồ tách glycoside tim tỉ lệ dung môi pha động khác 37 Hình 3.3: Sắc đồ tách glycoside tim tốc độ dịng pha động khác 38 Hình 3.4: sắc đồ digoxin điều kiện tối ƣu 40 Hình 3.5: Sắc đồ digitoxin điều kiện tối ƣu 41 Hình 3.6: Sắc đồ tách chất glycoside tim ở điều kiện tối ƣu 42 Hình 3.8: Đƣờng chuẩn 02 glycoside tim nghiên cứu luận văn 45 Hình 3.9: Sắc đồ mẫu thực 51 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Tên gọi, công thức cấu tạo số glycoside tim [21] Bảng 2.2: Nồng độ dung dịch chuẩn glycoside tim 24 Bảng 3.1: Khảo sát tỉ lệ pha động digoxin 34 Bảng 3.2: Khảo sát tốc độ pha động digoxin 34 Bảng 3.3: Khảo sát tỉ lệ pha động digitoxin 35 Bảng 3.4: Khảo sát tốc độ pha động digitoxin 35 Bảng 3.5: Độ lặp lại thời gian lƣu Glycoside tim 39 Bảng 3.6: Độ lặp lại diện tích píc Glycoside tim 40 Bảng 3.7: Các dung dịch đƣờng chuẩn 44 Bảng 3.8: Diện tích pic trung bình thu đƣợc glycoside tim 44 Bảng 3.9: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng Glycoside tim .45 Bảng 3.10: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng phƣơng pháp .46 Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi glycoside tim 48 Bảng 3.13: Kết thu đƣợc mẫu 49 Bảng 3.14: Kết thu đƣợc mẫu 49 Bảng 3.15: Kết thu đƣợc mẫu 49 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ACN: Acetonitrin DD: dung dịch HPLC: High performance liquid chromatography LC-MS: liquid chromatography – spectrometry LOD: Limit of detection LOQ: Limit of quantity RP-HPLC: Reversed-phase performance liquid chromatography RSD: Relative standard deviation PDA: Photo-diode – array SD: Standard deviation UV: Ultraviolet UV- VIS: Ultraviolet visible Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm MỞ ĐẦU Ra đời từ sớm phƣơng pháp sắc kí lỏng – lỏng đƣợc phát triển mạnh vào cuối kỉ 20 Vào năm 1970, sắc kí đƣợc phát triển mạnh đạt đƣợc thành tựu đáng kể nhƣ tách đƣợc hỗn hợp chất giống nhƣ nguyên tố đất hiếm, ankaloid, hydrocacbon mẫu dầu Ngày nhiều cải tiến đƣợc thực để nâng cao độ nhạy phƣơng pháp, nhƣ sử dụng pha tĩnh mới, detector có độ nhạy cao HPLC (sắc kí lỏng hiệu cao) kỹ thuật thiếu phân tích để quản lí mảng chất phân tích mà phƣơng pháp khác khơng thể đáp ứng đƣợc Với việc áp dụng đƣợc cho nhiều loại đối tƣợng chất phân tích, từ khơng phân cực nhƣ: chất thơm PAHs, axit béo, dƣợc phẩm (digoxin, gitoxin, diginatin,…), mẫu sinh học phân tích lâm sàng (theobromine, theophilline, ) đến phân cực nhƣ: axit amin, phenol,…, phƣơng pháp RP – HPLC – UV ( RP – HPLC: sắc kí lỏng hấp phụ pha ngƣợc - Reversed-phase performance liquid chromatography) có độ nhạy tốt, độ chọn lọc cao hiệu tách cao, pic cân đối Thêm vào pha động thƣờng hỗn hợp nƣớc dung môi phân cực nên rẻ tiền, kinh tế Đây phƣơng pháp thành cơng [6,7] Glycoside tim nhóm chất bắt đầu đƣợc sử dụng y học bác sĩ ngƣời Anh - Withering vào năm 1985, glycoside tim có vị trí quan trọng thuốc điều trị bệnh tim Trong số nhiều loại glycoside tim có tự nhiên digoxin digitoxin đƣợc sử dụng rộng rãi điều trị suy tim sung huyết, loạn nhịp tim đƣợc nghiên cứu nhiều Tuy nhiên các chất glycoside tim thƣờng độc, sử dụng hàm lƣợng cho phép dẫn đến ngộ độc, chí dẫn tử vong cho ngƣời [18] Chính cần xác định xác hàm lƣợng glycoside tim loại thuốc để đƣa vào điều trị đạt hiệu cao không sử dụng liều ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng đƣợc trọng Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Yêu cầu đặt phải có phƣơng pháp phù hợp định lƣợng glycoside tim dƣợc liệu, dƣợc phẩm cách nhanh chóng xác Việc ứng dụng phân tích HPLC vào phân tích thuốc dƣợc phẩm đƣợc làm nhiều giới nhƣng Việt Nam cịn tƣơng đối mẻ chƣa có nhiều cơng trình lĩnh vực Chính lí xin lựa chọn thực đề tài “Nghiên cứu phương pháp định lượng số glycoside tim dược phẩm dược liệu” Trong đề tài sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detector PDA để định lƣợng số glycoside tim dƣợc phẩm dƣợc liệu 44 Luận văn thạc sĩ 2000000 1800000 1600000 1400000 pic 1200000 tich 1000000 Dien 800000 600000 400000 200000 0 Hình 3.8: Đƣờng chuẩn 02 glycoside tim nghiên cứu luận văn Phƣơng trình hồi qui đƣờng chuẩn digoxin digitoxin khoảng nồng độ khảo sát đến 100 ppm có hệ số tƣơng quan lớn 0,99984 0,99974; chứng tỏ có mối quan hệ tuyến tính tỷ lệ diện tích pic digoxin digitoxxin với nồng độ chất phân tích Phƣơng trình hồi qui đƣợc sử dụng để tính tốn nồng độ chất phân tích dịch chiết từ mẫu thơng qua tỷ lệ diện tích pic tƣơng ứng, qua tính tốn đƣợc hàm lƣợng chất phân tích mẫu 3.2.3 Giới hạn phát giới hạn định lượng LOD, LOQ thiết bị đƣợc xác định nhƣ mục 2.4.3 Kết đƣợc biểu diễn bảng sau: Bảng 3.9: Giới hạn phát giới hạn định lượng Glycoside tim Qua thực nghiệm, sau q trình tính tốn giới hạn phát giới hạn định lƣợng phƣơng pháp: 45 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Bảng 3.10: Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp Các glycoside tim Lần Lần Lần Lần Lần Lần TB S LOD MDL(mg/kg) MQL(mg/kg) 3.3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích Mẫu đƣợc xử lí theo quy trình nêu phần 2.3.1 – phần thực nghiệm Mẫu đƣợc phân tích máy HPLC – PDA điều kiện tối ƣu Sau đánh giá phƣơng pháp phân tích dựa kết đo đƣợc 3.3.1 Đánh giá độ lặp lại phương pháp phân tích Độ lặp lại phƣơng pháp phân tích đƣợc thực cách cân lƣợng 0,15 gam mẫu (tƣơng ứng với khối lƣợng viên thuốc), mẫu đƣợc chọn mẫu thuốc Digoxine nativelle 0,25mg (mẫu 2) Mẫu đƣợc cân cho vào ống thuỷ tinh 20ml tiến hành xử lí theo quy trình trình bày mục 2.3.1 Chúng tơi tiến hành làm mẫu (3 lần xử lí mẫu nhƣ nhau, với lƣợng cân nhƣ nhau) Trong trình thực nghiệm, chúng tơi phát đƣợc digoxin có mẫu thuốc này, cịn digitoxin khơng phát thấy Nồng độ digoxin mẫu sau tính trung bình lần đo tƣơng ứng là: C = 25,0ppm, C2 = 24,5ppm, C3 = 24,9ppm Hàm lƣợng chất phân tích có viên thuốc đƣợc tính theo công thức: 46 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Digoxin, digitoxin(mg/viên) = C(mg/l).10 (ml) - C (mg/l) nồng độ chất phân tích đƣợc suy từ đƣờng chuẩn Trong đó: - 10 (ml) thể tích dung dịch mẫu phân tích Kết độ lặp lại đƣợc thể bảng 3.12 Bảng 3.11: Độ lặp lại phƣơng pháp phân tích Các glycoside tim Digoxin Digitoxin KHP: không phát Ta thấy %RSD < 5%, nhƣ lần sử lý mẫu có lặp lại tốt, điều cho thấy phƣơng pháp xử lý mẫu có độ lặp lại đáng tin cậy 3.3.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp Hiệu suất thu hồi phƣơng pháp phá mẫu đại lƣợng quan trọng để đánh giá hiệu phƣơng pháp Nó cho biết lƣợng chất bị Đánh giá hiệu suất thu hồi đánh giá độ tin cậy phƣơng pháp sử lý mẫu chọn Để đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp, lựa chọn loại mẫu không phát glycoside tim, thêm chuẩn vào mẫu xử lý tƣơng tự nhƣ mẫu thực Mẫu đƣợc chọn mẫu thuốc paracetamol Mẫu đƣợc cân với khối lƣợng 0,15 gam cân phân tích, chuyển vào ống thuỷ tinh 20 ml xử lý theo quy trình trình bày mục 2.3.1 Nồng độ glycoside tim thêm vào đƣợc tính theo sau định mức Bình 0: mẫu trắng, chứa 10 ml dung mơi pha động (50%ACN) Bình 2: chứa lƣợng mẫu cân 47 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Bình 4: mẫu lƣợng glycoside tim thêm chuẩn mức (25ppm) Bình 6: mẫu lƣợng glycoside tim thêm chuẩn mức (50ppm) Hiệu suất thu hồi glycoside tim đƣợc xác định theo công thức: H = C − C spike blank x 100% C0 Trong đó: Cspike: nồng độ thực tế thu đƣợc mẫu thêm chuẩn sau phân tích (ppm) Cblank: nồng độ mẫu (ppm) C0: nồng độ ban đầu thêm chuẩn (ppm) Kết đƣợc trình bày bảng sau: Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi glycoside tim Các glycoside tim Digoxin Digitoxin Kết hiệu suất thu hồi glycoside tim cao, từ 96,1% đến 105,5% Vì kết luận phƣơng pháp xử lý mẫu đáng tin cậy 3.4 Phân tích mẫu thực tế Chúng tơi tiến hành phân tích mẫu thực máy HPLC – PDA điều kiện tối ƣu Mẫu thuốc: Với mẫu thuốc, cân lƣợng tƣơng ứng với viên 0,15 gam với mẫu 2, 0,1 gam với mẫu 1(quy trình mục 2.3.1) Mỗi mẫu làm lần, lần đo hệ HPLC lần lấy kết trung bình Hàm lƣợng chất phân tích viên thuốc tính theo cơng thức: 48 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Digoxin, digitoxin(mg/viên) = C(mg/l).10 (ml) - C (mg/l) nồng độ chất phân tích Trong đó: - 10 (ml) thể tích dung dịch mẫu phân tích Dƣới kết thu đƣợc mẫu thực: Mẫu 1: Chỉ phát thấy digoxin với nồng độ tƣơng ứng với lần tiến hành là: 24,8ppm, 24,4ppp, 24,7ppm Kết phân tích cho thấy khơng phát (KPH) thấy digitoxin có mẫu thuốc Kết tính theo hàm lƣợng chất/viên bảng sau: Bảng 3.13: Kết thu mẫu Các glycoside tim Digoxin Digitoxin Mẫu 2: Chỉ phát thấy digoxin với nồng độ tƣơng ứng với lần tiến hành là: 25ppm, 24,5ppp, 24,9ppm Kết tính theo hàm lƣợng chất/viên thể bảng sau: Bảng 3.14: Kết thu mẫu Các glycoside tim Digoxin Digitoxin Mẫu 3: Cũng phát thấy digoxin với nồng độ tƣơng ứng với lần tiến hành là: 24,1ppm, 24,3ppp, 24,6ppm Bảng 3.15: Kết thu mẫu 49 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Các glycoside tim Digoxin Digitoxin Nhƣ vậy, dựa vào bảng 3.14, 3.15, 3,16 ta nhận thấy: Chỉ có digoxin thuốc, không phát thấy digitoxin Nhƣ kết phân tích tƣơng đối phù hợp với thực tế Mẫu dƣợc liệu: Chúng tiến hành làm mẫu (theo quy trình mục 2.3.1), mẫu đo lần hệ HPLC Qua kết thực nghiệm thấy: khơng phát thấy digoxin digitoxin có mẫu trúc đào Dƣới sắc đồ mẫu thuốc thật Mẫu 1: mAU(x10) 3.0 2.5 mAu 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 mAU(x10) 7024 225nm,4nm (1.00) 3.0 2.5 Digoxin 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 2.515 6132 mAu -0.5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Thời gian, phút 50 Luận văn thạc sĩ Mẫu 3: 225nm,4nm (1.00) Hình 3.9: Sắc đồ mẫu thực – mẫu thuốc 6.0 51 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm KẾT LUẬN Qua trình làm nghiên cứu phƣơng pháp định lƣợng glycoside tim dƣợc phẩm, thu đƣợc kết nhƣ sau: Đã tối ƣu hóa đƣợc điều kiện xác định 02 glycoside tim, điều kiện tách 02 glycoside tim phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao, sử dụng detector PDA Các điều kiện tối ƣu bao gồm:  Hệ dung môi pha động ACN/H2O với tỉ lệ ACN/H2O = 55/45  Tốc độ dòng u = 0,7ml/phút  Đánh giá đƣợc độ lặp lại thiết bị phân tích kết luận hệ máy chọn có độ lặp lại tốt, dƣới 5% Chúng đánh giá đƣợc độ phƣơng pháp phân tích:  Độ lặp lại phƣơng pháp xử lý mẫu 1,07 %< 5%  Đánh giá đƣợc độ thu hồi phƣơng pháp từ 96,1% đến 105,5%  Ứng dụng phƣơng pháp để phân tích số mẫu thuốc thị trƣờng Dựa điều kiện tối ƣu khảo sát, áp dụng điều điều kiện để xây dựng đƣờng chuẩn glycoside tim Và ứng dụng đƣờng chuẩn để phân tích glycoside tim có số mẫu thuốc, mẫu dƣợc liệu Phân tích đƣợc số mẫu thuốc điều trị tim lƣu hành thị trƣờng, cụ thể mẫu Digoxin- richter, Digoxine nativelle DigoxineQualy 0,25mg Kết cho thấy mẫu thuốc có chứa digoxin với hàm lƣợng tƣơng ứng 0,2463mg/viên, 0,2480mg/viên 0,2433mg/viên Nhƣ kết phân tích tƣơng đối phù hợp với thực tế Phân tích mẫu dƣợc liệu trúc anh đào không phát thấy digoxin digitoxin 52 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ y tế (2010), Dược điển Việt Nam, NXB y học, Hà Nội Bộ y tế (2012), Dược thư quốc gia Việt Nam, NXB y học, Hà Nội Phạm Luận (2000), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội Lê Đức Ngọc (2011), Bài giảng nhập môn xử lý số liệu kế hoạch hoá thực nghiệm, Hà Nội Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở phƣơng pháp phổ ứng dụng hóa học, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Văn Ri (2006), Chuyên đề phương pháp tách chất, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Văn Ri (2013), Các phương pháp tách, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, Hà Nội Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng thống kê hoá phân tích, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Hà Nội Ngô Văn Thu (2004), Bài giảng dược liệu tập 1, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội Tiếng Anh: 10 A Jedlicka, T Grafnetterova´, V Miller (2003), “HPLC method with UV detection for evaluation of digoxin tablet dissolution in acidic medium after solid-phase extraction”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,33, pp 109 – 115 11 Belachew Desta, E Kwong and K M Mcerlane (1981), “ Sepration of digoxin, digitoxin and their potential metabolites, impurities or 53 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm degradation products by High – performance liquid choramatography”, Journal of Chromatography, 240, pp 137-143 12 Federica Pellati, Renato Bruni, Maria Grazia Bellardi, Assunta Bertaccini, Stefania Benvenuti (2009), “Optimization and validation of a high- performance liquid chromatography method for the analysis of cardiac glycosides in Digitalis lanata”, Journal of Chromatography A, 1216, pp 3260–3269 13 Ferenc Orosz, Mimi Nuridsa’ny and Judid Ova’di (1986), “Isolation and Quantitative Determination of Some Cardioactive Glycosides from Digitalis lanata by High-Performance Liquid Chromatography”, Analytical biochemistry, 156, pp 171 – 175 14 F Erni and R W Frei (1976), “A Comoarision of reversed – phase and partiion High performance liquid chromatography of some digitalis glycoside”, Journal of Chromarography, 130 , pp 169-180 15 Kevin L Kelly, Bruce A Kimball, John J Johnston (1995), Quantitation of digitoxin, digoxin, and their metabolites by high-performance liquid chromatography using pulsed amperometric detection”, Journal of Chromatography A, 711, pp 289-295 16 L.K Hearn, P.P Subedi (2009), “ Determining levels of steviol glycosides in the leaves of Stevia rebaudiana by near infrared reflectance spectroscopy”, Journal of Food Composition and Analysis, 22, pp 165–168 17 Ralf Dieter Josephs, Adeline Daireaux, Steven Westwood, Robert Ian Wielgosz (2010), “Simultaneous determination of various cardiac glycosides by liquid chromatography -hybrid mass spectrometry for the purity assessment of the therapeutic monitored drug digoxin”, Journal of Chromatography A, 1217, pp 4535–4543 18 Santosh J Vetticaden (1990), “ Review Chromatography of cardiac glycosides”, Journal of Chromatography,531, pp 215 - 234 54 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 19 Sarah Kohls, Barbara M Scholz-Bottcher, Jorg Teske, Patrick Zark, Jurgen Rullkotter (2012), “Cardiac glycosides from Yellow Oleander (Thevetia peruviana) seed”, Phytochemistry, 75, pp 114-127 20 V Ya Davydov, M Elizalde Gonzalez and A V Kiselev (1981), “ High performance liquid choramatography of cardiac glycosides”, Journal of Chromatography, 204, pp 293 – 301 21 V Ya Davydov, M Elizalde Gonzalez and A V Kiselev (1982), “Correlation between the retention of cardiac glicosides in reversed – phase High – performance liquid choramatography with a diphenylsil stationary phase, the strucure of their molecules and their biological activitty”, Journal of Chromatography,248, pp 49 -62 22 Youichi Fujii, Hitoml Fukuda, Yumko Saito and Mitsuru Yamazaki (1980), “Separation of digitalis glycosides by micro high-performance liquid chromatography”, Journal of Chromatography, 202 , pp 139- 143 23 Youichi Fujii, Hitoml Fukuda, Yumko Saito and Mitsuru Yamazaki (1989), “High – performance liquid choramatography determination of secondary cardiac glycosides in digitalis purpurea leaves”, Journal of Chromatography, 419, pp 319-325 24 Youichi Fujii, Yukari Mitsuru Yamazaki (1988), “Micro High – performance liquid choramatographic determination of cardiac glycosides in β-methydioxin and digoxin tablets”, Journal of Chromatography, 448, pp 157-l64 25 Zozan B Todorovic’, Miodrag L Lazic’, Vlada B Veljkovic’ (2009), “Validation of an HPLC–UV method for the determination of digoxin residues on the surface of manufacturing equipment”, Joural of Serbian Chemical Societyl, 74 (10), pp 1143–1153 55 ... tài ? ?Nghiên cứu phương pháp định lượng số glycoside tim dược phẩm dược liệu? ?? Trong đề tài sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detector PDA để định lƣợng số glycoside tim dƣợc... Tâm LỜI CẢM ƠN! Sau thời gian học tập nghiên cứu tơi hồn thành luận văn cao học với đề tài: ? ?Nghiên cứu phương pháp định lượng số glycoside tim dược phẩm dược liệu? ?? dƣới hƣớng dẫn, bảo PGS.TS Nguyễn... Phƣơng pháp sắc kí xác định glycoside tim 15 1.3.2 Phƣơng pháp khác xác định glycoside tim 17 1.3.3 Phƣơng pháp chiết tách glycoside tim khỏi mẫu thực 20 1.3.4 Phƣơng pháp định tính định