Nghiên cứu phương pháp định lượng một số phtalat trong thực phẩm

Nghiên cứu phƣơng pháp định lƣợng một số Phtalat trong thực phẩm Nguyễn Thị Cúc Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS. ngành: Hóa phân tích; Mã số: 60 44 29 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. Tạ Thị Thảo Năm bảo vệ: 2013 Abstract. Nghiên cứu phtalat, các phƣơng pháp xác định phtalat. Nghiên cứu phƣơng pháp định lƣợng một số Phtalat trong thực phẩm. Xây dựng đƣợc phƣơng pháp phân tích định lƣợng đồng thời các phtalat trong một số mẫu thực phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột tách pha ngƣợc (RP-HPLC), detector PDA và ứng dụng phân tích một số mẫu đại diện. Keywords. Hóa học; Hóa phân tích; Phƣơng pháp định lƣợng; Thực phẩm Content MỞ ĐẦU Cuộc sống ngày càng trở nên hiện đại hơn, mọi thứ đều đƣợc thiết kế sao cho tiện dụng hơn, dễ sử dụng hơn, hiệu quả hơn và giá thành rẻ. Thực phẩm hầu hết đƣợc đóng hộp, bảo quản trong những chất liệu nhƣ nhựa PVC hoặc hộp inox. Những loại bao bì đó lại chƣa đƣợc quản lý chất lƣợng một cách chặt chẽ nên rất dễ dẫn đến việc nhiễm một số chất ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời. Hơn nữa, tình trạng sản xuất thực phẩm theo phƣơng thức công nghiệp công với việc các nhà sản xuất không tuân thủ các tiêu chuẩn chất lƣợng đã có, nên nhiều chất phụ gia đƣợc thêm vào. Chúng đƣợc thêm vào để tạo sự hấp dẫn hơn của thực phẩm đó hoặc để thay thế một số chất trong tự nhiên vì hóa chất công nghiệp rẻ tiền và sẵn có hơn. Vì vậy nếu không đƣợc quản lý một cách chặt chẽ, những thực phẩm mà chúng ta sử dụng rất dễ nhiễm các chất độc hại vào thực phẩm và đi vào cơ thể con ngƣời… Các chất đó không những ảnh hƣởng tới sức khỏe mà còn ảnh hƣởng lâu dài tới cuộc sống. Các phtalat hiện nay đƣợc sử dụng rất phổ biến trên hầu hết các lĩnh vực của cuộc sống. Từ trong những sản phẩm hàng ngày làm bằng nhựa PVC nhƣ thau, chậu, hộp đựng thức ăn, bàn ghế, chai lọ Hầu hết các sản phẩm từ nhựa PVC đều có các phtalat vì nhóm các chất này đƣợc thêm vào nhựa để làm tăng độ dẻo, đàn hồi của nhựa, thậm chí nhóm này còn đƣợc gọi là “plasticizers” nghĩa là các chất dẻo giống nhựa. Thành phần nhựa có thể chiếm từ 0,1-40% những chất này, thậm chí có thể lên tới 60% hay 80%[25]. Hơn nữa, những chất này không tạo liên kết trong mạng lƣới của nhựa mà chỉ đƣợc thêm vào nhựa nhƣ một chất phụ gia vì vậy rất dễ thôi nhiễm ra ngoài môi trƣờng (nhất là môi trƣờng nhiều chất béo nhƣ dầu, mỡ ). Chúng còn đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp xây dựng nhƣ trong một số mặt hàng sơn tƣởng, sơn gỗ lát nền nhà và thậm chí trong cả đồ chơi trẻ em và sản phẩm chăm sóc cho trẻ[21]. Các phtalat còn đƣợc sử dụng trong mỹ phẩm nhƣ các loại sơn móng tay, gel vuốt tóc, kem dƣỡng da, nƣớc hoa Thêm chúng vào mỹ phẩm sẽ làm cho sơn móng tay có độ bóng và bám bề mặt tốt hơn, trong gel vuốt tóc và kem dƣỡng da làm cho bề mặt kem trông tƣơi mịn và hấp dẫn hơn, trong nƣớc hoa chúng đƣợc dùng nhƣ chất định hƣơng để giữ cho mùi thơm nƣớc hoa lâu phai hơn [13]. Tất cả các phtalat ở trong các sản phẩm kể trên đều có khả năng thôi nhiễm ra ngoài môi trƣờng không khí hay thức ăn một cách dễ dàng. Chúng có thể hấp thụ qua da do tiếp xúc, qua đƣờng hô hấp do hít phải và qua đƣờng tiêu hóa nhƣ ăn uống. Về lâu về dài chúng gây ra những tác hại to lớn đối với cơ thể con ngƣời và môi trƣờng. Chúng gây ung thƣ ở chuột (chƣa có thử nghiệm nào trên cơ thể ngƣời)[24], các phtalat này có thể làm xáo trộn nội tiết trong cơ thể con ngƣời, ở bé gái có thể gây dậy thì sớm, ở bé trai thì làm teo tinh hoàn Nếu bị tích lũy lâu trong cơ thể, chúng sẽ lắng đọng lại ở phổi, gan và lá lách và dần dần sẽ làm suy giảm chức năng của các bộ phận đó[26]. Trong thực phẩm, nguyên nhân sự xuất hiện các phtalat có thể là do bị thôi nhiễm từ bao bì sản phẩm bằng nhựa dẻo hoặc túi nilon nếu thực phẩm chứa trong đó là các loại thực phẩm giàu chất béo. Hoặc một số loại đồ uống có cồn cũng có thể nhiễm các phtalat do nguyên nhân này. Còn một nguyên nhân khác đáng chú ý hơn vì mức nồng độ các phtalat này cao hơn hẳn mức nồng độ do bị thôi nhiễm. Đó là do các nhà sản xuất sử dụng trực tiếp các phtalat, chủ yếu là DEHP, DINP để làm chất tạo đục trong các sản phẩm chứa nƣớc, bởi vì phtalat rất kém tan trong môi trƣờng này[7] hoặc trong các sản phẩm bơ, dầu ăn làm cho thực phẩm nhìn có vẻ tự nhiên hơn[20]. Vì vây, để giúp ngƣời tiêu dùng có những lựa chọn đúng đắn về các loại thực phẩm, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phương pháp định lượng một số phtalat trong thực phẩm” để biết đƣợc những thực phẩm có hại và có biện pháp tránh sự nhiễm các phtalat vào cơ thể qua đƣờng ăn uống. Chương I: TỔNG QUAN 1.1Tên gọi, cấu trúc của một số phtalat 1.1.1 Công thức và tên gọi các phtalat. Công thức cấu tạo của các phtalat nhƣ sau: Đây là công thức cấu tạo chung của các este o-phtalats hay còn đƣợc gọi là đi-este của axit benzenedicarboxylic. R và R' là 2 gốc của 2 rƣợu đã tác dụng với axit phtalic để thu đƣợc este phtalat. Hai nhóm này có thể giống nhau hoặc khác nhau tùy thuộc rƣợu tham gia phản ứng. Cấu trúc khác nhau của 2 nhánh này sẽ tạo ra những tính chất hóa học và vật lý rất riêng của phân tử và làm thay đổi hoạt tính sinh học của chúng[22,25]. Bảng 1.1 chỉ ra một số phalat thông dụng, tên gọi vả cấu tạo của một số phtalat thông dụng. Bảng 1.1: Tên gọi, cấu tạo, KLPT của một số phtalat điển hình [6] STT Tên gọi Kí hiệu CTCT M (g/mol ) 1 Dimethyl phtalat DMP C 6 H 4 (COOCH 3 ) 2 194 2 Diethyl phtalat DEP C 6 H 4 (COOC 2 H 5 ) 2 222 3 Diallyl phtalat DAP C 6 H 4 (COOCH 2 CH=CH 2 ) 2 246 4 Di-n-propyl phtalat DPP C 6 H 4 [COO(CH 2 ) 2 CH 3 ] 2 250 5 Di-n-butyl phtalat DBP C 6 H 4 [COO(CH 2 ) 3 CH 3 ] 2 278 6 Diisobutyl phtalat DIBP C 6 H 4 [COOCH 2 CH(CH 3 ) 2 ] 2 278 7 Butyl cyclohexyl phtalat BCP CH 3 (CH 2 ) 3 OOCC 6 H 4 COOC 6 H 11 304 8 Di-n-pentyl phtalat DNPP C 6 H 4 [COO(CH 2 ) 4 CH 3 ] 2 306 9 Dicyclohexyl phtalat DCHP C 6 H 4 [COOC 6 H 11 ] 2 330 10 Butyl benzyl phtalat BBP CH 3 (CH 2 ) 3 OOCC 6 H 4 COOCH 2 C 6 H 5 312 11 Di-n-hexyl phtalat DNHP C 6 H 4 [COO(CH 2 ) 5 CH 3 ] 2 334 12 Diisohexyl phtalat DIHxP C 6 H 4 [COO(CH 2 ) 3 CH(CH 3 ) 2 ] 2 334 13 Diisoheptyl phtalat DIHpP C 6 H 4 [COO(CH 2 ) 4 CH(CH 3 ) 2 ] 2 362 14 Butyl decyl phtalat BDP CH 3 (CH 2 ) 3 OOCC 6 H 4 COO(CH 2 ) 9 C H 3 362 15 Di(2-ethylhexyl) phtalat DEHP C 6 H 4 [COOCH 2 CH(C 2 H 5 )(CH 2 ) 3 CH 3 ] 2 390 16 Di(n-octyl) phtalat DNOP C 6 H 4 [COO(CH 2 ) 7 CH 3 ] 2 390 17 Diisooctyl phtalat DIOP C 6 H 4 [COO(CH 2 ) 5 CH(CH 3 ) 2 ] 2 390 18 n-Octyl n-decyl phtalat ODP CH 3 (CH 2 ) 7 OOCC 6 H 4 COO(CH 2 ) 9 C H 3 418 19 Diisononyl phtalat DINP C 6 H 4 [COO(CH 2 ) 6 CH(CH 3 ) 2 ] 2 418 20 Diisodecyl phtalat DIDP C 6 H 4 [COO(CH 2 ) 7 CH(CH 3 ) 2 ] 2 446 21 Diundecyl phtalat DUP C 6 H 4 [COO(CH 2 ) 10 CH 3 ] 2 474 22 Diisoundecyl phtalat DIUP C 6 H 4 [COO(CH 2 ) 8 CH(CH 3 ) 2 ] 2 474 23 Ditridecyl phtalat DTDP C 6 H 4 [COO(CH 2 ) 12 CH 3 ] 2 530 24 Diisotridecyl phtalat DIUP C 6 H 4 [COO(CH 2 ) 10 CH(CH 3 ) 2 ] 2 530 1.1.2 Tính chất lý hóa của các este phtalat. - Nhóm các este phtalat là những chất lỏng dạng dầu, dễ bay hơi, có mùi nhẹ, không tan trong nƣớc và cacbon tetraclorua, nhƣng lại tan tốt trong các dung môi hữu cơ nhƣ metanol, acetonitril, hexan, các dung dịch dầu ăn, chất béo. Chúng có thể tan đƣợc trong máu và những chất dịch cơ thể có chứa lipoprotein. - Khi bị phân hủy bởi nhiệt các phtalat này cho khí mùi hơi chát - Phtalat không có tƣơng tác với những muối nitrat, kiềm, axit hay những chất oxy hóa mạnh. 1.1.3 Ứng dụng của các este phtalat và nguồn gốc phát tán vào thực phẩm. 1.1.3.1.Ứng dụng của các este phtalat. - Hơn 87% đƣợc sử dụng trong nhựa, làm cho nhựa dẻo, linh hoạt hơn, đàn hồi tốt hơn. - Trong mỹ phẩm các phtalat cũng đƣợc thêm vào để làm tăng độ mịn, hấp dẫn cho các loại kem dƣỡng da, làm chất định hƣơng cho nƣớc hoa, dầu gội, sữa tắm, sử dụng trong sơn móng tay để làm cho sơn bền màu và bám móng hơn - Trong ngành công nghiệp xây dựng, các phtalat đƣợc sử dụng trong sơn tƣờng, sơn sàn gỗ - Trong ngành công nghiệp thực phẩm các phtalat có thể bị thôi nhiễm từ vỏ hộp vào thực phẩm hoặc đƣợc thêm trực tiếp vào thực phẩm làm tăng vẻ tự nhiên hấp dẫn của loại thực phẩm đó 1.1.3.2 Nguồn gốc phát tán các phtalat vào thực phẩm. Phtalat trong thực phẩm chủ yếu là do bị nhiễm trong quá trình sản xuất và do thôi nhiễm[14]. Trên thực tế các phtalat này có trong thực phẩm không chỉ do nguyên nhân thôi nhiễm từ các vật chứa hoặc tiếp xúc mà đôi lúc còn có mặt trong thực phẩm do đƣợc cố tình thêm vào. Những sản phẩm giàu chất béo nhƣ bơ, phomai, mayonaise đều đƣợc thêm một lƣợng nhỏ các phtalat vào để làm chúng trông tƣơi ngon và mịn hơn. Các phtalat thƣờng đƣợc thêm vào nƣớc hoa quả hoặc đồ uống có cồn để làm tăng độ đục và tạo cảm giác tự nhiên hơn cho các loại thực phẩm đó. 1.1.4 Độc tính của các phtalat. 1.1.4.1 Con đường lây nhiễm phtalat. - Nhựa PVC chứa rất nhiều phtalat, khi nhựa cũ, bị vỡ, các phtalat sẽ bị thôi ra ngoài môi trƣờng không khí, nƣớc uống, và thực phẩm chứa trong đồ nhựa - Đối với nhựa chứa đồ ăn, nhất là đồ nhiều dầu mỡ, các phtalat sẽ thôi nhiễm và tan vào môi trƣờng thực phẩm - Phtalat trong mỹ phẩm cũng sẽ thôi nhiễm vào con ngƣời khi bôi kem dƣỡng da, gel xịt tóc, nƣớc hoa, sơn móng - Các đồ xây dựng chứa phtalat cũng dễ gây nhiễm phtalat trong không khí. 1.1.4.2 Độc tính. - Gây ung thƣ - Xáo trộn nội tiết, có tác dụng nhƣ hormon nữ hóa - Tác động chủ yếu đến hệ sinh sản chƣa phát triển hoàn toàn của cả nam và nữ. 1.2 Các phương pháp xác định phtalat trong mẫu thực phẩm. 1.2.1 Các phương pháp HPLC xác định phtalat. Các phtalat là những este của axit phtalic với hai hoặc một rƣợu nào đó, do đó tính chất cũng nhƣ cấu tạo của chúng có tính tƣơng đồng cao. Phƣơng pháp phân tích các hợp chất này phải đủ mạnh để không bị ảnh hƣởng lẫn nhau của các phtalat khi xác định đồng thời. Và sắc ký đáp ứng tốt đƣợc điều đó. Vì là các este nên có thể sử dụng cả sắc ký khí và sắc ký lỏng để phân tích. Tuy nhiên khi dùng sắc ký khí phải đƣợc ghép nối với detector khối phổ mới cho hiệu quả cao, còn các detector khác đều kém nhậy (nhƣ FID, ECD). Sắc ký lỏng thì có thuận lợi hơn là có thể sử dụng detector UV cũng có thể định lƣợng cũng nhƣ định tính đƣợc các phtalat. Tuy cũng có nhiều ƣu nhƣợc điểm khác nhau, khi dùng HPLC-UV thì khi phân tích mẫu thực, kết quả phải đƣợc kiểm chứng lại bằng một phƣơng pháp mạnh hơn nhƣ ghép nối với MS. Bởi vì dạng phổ hấp thụ của các phtalat rất giống với nhiều chất khác có một vòng benzen, bƣớc sóng hấp thụ cũng không đặc trƣng nên khả năng định tính thấp. Tuy nhiên trên một số đối tƣợng nhất định, nền mẫu kém phức tạp hơn thì HPLC-UV lại ƣu việt hơn nhờ giá thành rẻ hơn và khá chính xác, phƣơng pháp xử lý mẫu đơn giản. Thêm một nghiên cứu nữa về phƣơng pháp tách và định lƣợng các phtalat, theo tài liệu [13], tác giả Hyun Jung Koo và cộng sự đã nghiên cứu và ứng dụng phƣơng pháp HPLC- UV để xác định 04 phtalat (DEP, DBP, BBP, DEHP) trong các mẫu mỹ phẩm. Sử dụng hệ máy HPLC của Hitachi (model L-700, Tokyo), bộ phận bơm mẫu tự động, cột Supecol LC- 18 5µm (250mm×4,6mm), nhiệt độ cột 20 0 C±2 0 C. Pha động tỷ lệ 88:12 (88% ACN và 12% dung dịch đệm trietylamine 0,08% pH 2,8 đƣợc điều chỉnh pH bằng axit photphoric 1mol/L). Tốc độ dòng 0,7 mL/phút, tổng thời gian chạy là 50 phút. Đƣờng chuẩn dựng từ 10-400ppm, sử dụng chất nội chuẩn DnHP. Kết quả thu đƣợc, phát hiện 19/21 mẫu sơn móng tay và 11/42 mẫu nƣớc hoa chứa DBP, 24/42 mẫu nƣớc hoa chứa DEP với hàm lƣợng khá cao. Trong nghiên cứu này còn chỉ ra mức con ngƣời nhiễm phải các phtalat khi sử dụng mỹ phẩm hàng ngày. Ƣớc tính dựa trên lƣợng các phtalat phát hiện đƣợc trên các đối tƣợng mẫu. Ngoài sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector UV còn có một số phƣơng pháp khác để định lƣợng cũng nhƣ định tính các phtalat. Các phƣơng pháp này đƣợc trình bày ở phần 1.2.2. 1.2.2 Các phương pháp khác xác định các phtalat. Ngoài phƣơng pháp HPLC, một phƣơng pháp phổ biến để xác định các phtalat là GC- MS. Có thể sử dụng sắc kí khí ghép nối với các detector khác để xác định các phtalat nhƣ detector bắt điện tử (ECD), hay ion hóa ngọn lửa (FID). Theo tiêu chuẩn CPSC-CH-C1001-09.3[21] của tổ chức CPSC Mỹ (United States Consumer Product Safety Commissions), các phtalat đƣợc xác định trên đối tƣợng là đồ chơi trẻ em, sử dụng hệ thiết bị GC-MS. Các phtalat đƣợc chiết ra khỏi đối tƣợng bằng dung môi THF và n-hexan. Khoảng 50 mg mẫu đƣợc cân chính xác, sau đó thêm 5ml THF, tiếp đó thêm 10ml n-hexan (tổng thể tích dung môi là 15 ml). Phần dung dịch lọc, lấy 0,1 ml sau đó thêm vào 80µl dung dịch chất nội chuẩn benzyl benzoat 250µg/ml, sau đó cho đến thể tích 20ml bằng n-hexan. Đƣờng chuẩn 06 phtalat (DBP, BBP, DEHP, DNOP, DIDP, DINP) đƣợc dựng từ 0,5 – 10 µg/ml với mẫu trắng là cyclohexan. Với điều kiện chạy GC-MS trên cột DB-5MS 30m×0,25mm ID×0,25µm, tốc độ dòng ban đầu 1ml/phút, dòng chảy liên tục, khí mang He, van tiêm mẫu 1µl ở nhiệt độ 290 0 C, áp suất 35 psi, từ 2-5 phút giữ ở 50 0 C, sau đó tăng 30 0 C/phút tới 280 0 C, sau đó tăng 15 0 C/phút tới 310 0 C, giữ trong 4 phút. Thu đƣợc thời gian lƣu của các chất BB (m/z=105), DBP (m/z=223) từ 5-9,5 phút, BBP (m/z=206) và DEHP (m/z=279) từ 9,5-10,8 phút và của DNOP (m/z=279), DINP (m/z=293) và DIDP (m/z=307) ra sau phút 10,8. Có phân tích mẫu chuẩn CRM để xác nhận giá trị của phƣơng pháp. Ngoài GC ghép nối với detector MS ra thì ngƣời ta còn sử dụng các loại detector khác nhau để phân tích các phtalat nhƣ FID, ECD. Tiến sĩ Sapna Johnson và các cộng sự [20] đã nghiên cứu xác định 08 phtalat (DMP, DEP, DBP, BBP, DEHP, DINP, DNOP, DiDP) trong đối tƣợng đồ chơi trẻ em sử dụng detector ECD. Mẫu đƣợc cân với khối lƣợng 5g đƣợc chiết Soxhlet trong 100ml dung dịch diclometan 16 giờ và ở 60 0 C. 90ml dịch chiết đƣợc làm giàu ở 30 0 C, và 1µl đƣợc bơm vào cột tách. Tất cả các mẫu phân tích đều đƣợc làm lặp lại 3 lần. Cột đƣợc sử dụng là DB-5MS 30 m x .25 mm ID x 0.25 µm, tốc độ ban đầu 1ml/phút, khí mang He, van bơm 1µl ở nhiệt độ 290 0 C, áp suất 35 psi, 0,5 phút, 2-5 phút giữ ở 50 0 C, tăng 30 0 C/phút tới 280 0 C, sau tăng 15 0 C/phút tới 310 0 C giữ trong 4 phút. Tổng thời gian 50 phút. Detector ECD, nhiệt độ bổ trợ 300 0 C, khí Nitơ 20ml/phút. Kết quả thu đƣợc cho thấy 4 loại phtalat phổ biến là DEHP, BBP, DBP và DINP có mặt trong tất cả 24 mẫu thí nghiệm với hàm lƣợng từ <0,1%-16,22%. Sau khi mẫu đƣợc xác định bằng GC-ECD thì đƣợc kiểm tra để khẳng định lại bằng GC-MS. 1.2.3 Phương pháp chiết tách các phtalat ra khỏi nền mẫu thực phẩm. Trƣớc khi mẫu đƣợc đƣa vào hệ HPLC để phân tích cho ra hàm lƣợng phtalat có trong mẫu thì nó phải đƣợc đồng nhất, chuyển từ các trạng thái khác nhau về dạng lỏng, các phtalat đƣợc tan trong dung môi acetonitril hoặc metanol. Khi đƣa vào đầu cột tách có khả năng hấp thu và rửa giải qua cột. Theo tài liệu [22], mẫu phải đƣợc đồng nhất trƣớc khi đem xử lý hoặc chiết. Với mẫu lỏng có thể dùng biện pháp lắc, trộn lẫn, hay khuấy. Đối với mẫu rắn thƣờng sử dụng máy trộn để làm đều hoặc có thể cho thêm dung môi hữu cơ phân cực hoặc nƣớc cất để làm đều. Các phtalat đƣợc chiết ra từ mẫu không chất béo dạng lỏng với dung môi hữu cơ không phân cực và có thể đo mà không cần bất kỳ sự làm sạch nào. Áp dụng với trƣờng hợp đối với nƣớc, các loại nƣớc giải khát và đồ uống có cồn. Hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng chiết Lỏng-Lỏng để phân tách các phtalat ra khỏi nền mẫu. Dung môi có thể dùng clorofom, n-hexan, n-heptan, hoặc isooctan. Cũng có thể sử dụng chiết pha rắn để tách lấy các phtalat phân tích. Đối với các loại thực phẩm không béo dạng rắn thƣờng đƣợc chiết với ACN hoặc hỗn hợp ACN-Nƣớc. Trƣờng hợp thực phẩm giàu chất béo dạng rắn thì các phtalat đƣợc chiết ra khỏi nền cùng với chất béo có thể sử dụng diclometan, hỗn hợp diclometan với cyclohexan, n-hexan, và hỗn hợp n-hexan với aceton, hoặc có thể dùng ACN để tăng độ chọn lọc của các phtalat từ thực phẩm, dựa trên khả năng tan kém của các chất béo vào trong ACN. Kỹ thuật chiết phổ biến nhất chỉ bằng cách lắc mẫu với hỗn hợp chiết. Tuy nhiên dùng biện pháp rung siêu âm và lò vi sóng là 2 biện pháp đã cho hiệu quả tốt nhất. Dựa trên điều kiện phòng thí nghiệm và các tài liệu tham khảo đã có, chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao pha đảo của Shimadzu, ghép nối với detector PDA, cột Cadenza CD-C18 250mm × 4,6mm × 3µm, hệ điều khiển SCL 10A, lò cột CTO- 10AS, bộ trộn dung môi, bơm cao áp LC-10Advp, đèn SPD-M10A (đèn D 2 và W). Vòng nạp mẫu 50µl. Các điều kiện chạy máy và xử lý mẫu đều đƣợc khảo sát và tối ƣu hóa trƣớc khi phân tích mẫu. CHƢƠNG II: THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu. 2.2 Các loại phtalat thường có trong thực phẩm. Bảng 2.1: Thông tin về mẫu phân tích được chọn. STT Loại mẫu Nhà sản xuất Thông tin 1 Mẫu bơ thực vật (hộp 80g) Công ty Cổ phần Dầu Thực vật Tƣờng An. NSX:16/11/12 HSD:16/5/13 2 Mẫu phomai Con bò cƣời (hộp 250g) Công ty TNHH Bel Việt Nam NSX: 17/9/12 HSD: 17/5/13 2.3 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị. 2.3.1 Chất chuẩn. Các chất chuẩn phtalat đƣợc mua của hãng Dr.Ehrenstorfer dạng lỏng, với độ tinh khiết >99%. Các dung dịch chuẩn gốc đƣợc cân khối lƣợng và pha với các nồng độ trong bảng 2.2. Bảng 2.2: Nồng độ các dung dịch chuẩn este phtalat. STT Tên viết tắt Khối lƣợng cân (g) Nồng độ (ppm) Cách pha Ph1 DMGP 0,0080 8000 Định mức đến 1ml bằng Metanol Ph2 DPP 0,0120 12000 Ph3 DHP 0,0040 4000 Ph4 DCHP 0,0040 4000 Ph5 DNOP 0,0185 18500 Ph6 DEHP 0,0115 11500 Ph7 DBP 0,0115 11500 Ph8 BBP 0,0084 8400 Các dung dịch chuẩn gốc đƣợc bảo quản trong tủ lạnh, nhiệt độ dƣới 4 0 C. Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha từ dung dịch gốc hàng ngày, tùy theo mức nồng độ sử dụng. 2.3.2 Hóa chất sử dụng  Các dung môi cho sắc ký lỏng hiệu năng cao: MeOH, ACN (Merck – Đức)  N-hexan  Trietylamin Merck – Đức.  Axit photphoric Merck – Đức  Nƣớc cất đƣợc sử dụng là nƣớc cất 2 lần đã đƣợc deion hóa. 2.3.3 Thiết bị, dụng cụ  Thiết bị: - Hệ thống HPLC Shimadzu 10Avp với detector PDA Shimadzu SPD – M10Avp. - Cột pha đảo Cadenza CD-C18 250mm × 4,6mm × 3µm. - Cân phân tích Scientech SA 210, độ chính xác 0,0001 g. - Máy ly tâm, tốc độ 4000 vòng/phút. - Máy đo pH Metrohm 961 với điện cực thủy tinh và điện cực calomen bão hòa và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH (Merck) - Máy lắc. - Máy rung siêu âm, có gia nhiệt.  Dụng cụ: - Ống ly tâm 10 ml. - Bình định mức: 5,10, 25, 50 mL, cùng hãng. - Pipetman các loại từ 0 – 1000µL. - Bình nón 100ml, cốc 100, 50, 25 mL, cốc cân Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải đƣợc rửa sạch, tráng bằng nƣớc cất, sau đó tráng bằng metanol và để khô, tráng n-hexan 3 lần sau đó sấy ở 105 0 C trong vòng 1 giờ, lấy ra để nguội trƣớc khi sử dụng. 2.4 Mục tiêu nghiên cứu. Xây dựng đƣợc phƣơng pháp phân tích định lƣợng đồng thời các phtalat trong một số mẫu thực phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột tách pha ngƣợc (RP-HPLC), detector PDA và ứng dụng phân tích một số mẫu đại diện. 2.5 Phương pháp phân tích. 2.5.1 Phương pháp xử lý mẫu. Với 2 dạng mẫu rắn này chúng tôi đƣa ra phƣơng pháp xử lý mẫu: Mẫu đƣợc cân khối lƣợng khoảng 0,2 g chính xác tới 0,0001g trên cân phân tích, chuyển mẫu vào ống thủy tinh 10ml. Thêm 5 ml dung môi acetonitril, lắc trên máy lắc 30 phút, sau đó rung siêu âm 30 phút ở nhiệt độ 40 0 C để giúp cho chất béo trong đó bị chảy ra, các phtalat tan dễ dàng hơn. Cuối cùng quay ly tâm 30 phút để lắng cạn và thu dịch trong sang 1 ống khác. Dung dịch này sau khi lọc qua màng lọc 0,45µm đƣợc bơm vào cột để định lƣợng các phtalat có trong mẫu. Mẫu thêm chuẩn cũng đƣợc thực hiện với một quá trình trên để xác định hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu. 2.5.2 Phương pháp phân tích. Phép phân tích các phtalat đƣợc thực hiện trên hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu, kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn dung môi và detector photo-diode-array (PDA) đặt ở bƣớc sóng 225 nm. Các điều kiện chạy máy đƣợc tóm tắt nhƣ sau: - Nhiệt độ cột 25 0 C - Van bơm mẫu 50 µL - Hệ dung môi gồm 2 kênh. Kênh A: pha nƣớc chứa 0,04% trietylamin đƣợc chỉnh pH tới 2,8 bằng dung dịch axit photphoric. Kênh B là ACN. - Chế độ gradient tốc độ dòng: thời điểm ban đầu tốc độ là 0,8 ml/phút, giữ ở tốc độ này trong vòng 12,5 phút sau đó tăng dần lên 1,0 ml/phút ở phút thứ 14. Giữ 2 phút, sau đó tăng lên 1,2 ml/phút trong vòng 2,5 phút. Giữ tốc độ này đến khi các chất đƣợc rửa giải hết ra khỏi cột. Tổng thời gian chạy là 25 phút. Tỷ lệ giữa 2 kênh A:B là 5:95 (% về thể tích) đƣợc giữ suốt quá trình chạy mẫu. 2.6 Nghiên cứu điều kiện tối ưu và đánh giá phương pháp phân tích. 2.6.1 Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu. Các điều kiện tối ƣu trên hệ máy sử dụng cũng nhƣ quá trình xử lý mẫu đã đƣợc khảo sát. Thứ nhất là khảo sát để chọn hệ dung môi pha động. Chúng tôi đã khảo sát 3 hệ dung môi MeOH-Nƣớc, ACN-nƣớc và ACN-pha nƣớc chứa trietylamin 0,04%, pH 2,8 chỉnh pH bằng axit photphoric 1 mol/L. Sau khi chọn đƣợc hệ dung môi phù hợp chúng tôi đi khảo sát thành phần của pha động. Tỷ lệ giữa 2 pha ACN và pha nƣớc cũng đƣợc khảo sát ở 2 tỷ lệ 88% ACN : 12 % pha nƣớc và 95% ACN:5% pha nƣớc (% về thể tích). Khảo sát thành phần % của trietylamin trong pha nƣớc. Nồng độ của trietylamin cũng đƣợc khảo sát ở 3 mức: 0,01%; 0,04%; và 0,08%. Giá trị pH pha động cũng đƣợc khảo sát, ở 3 giá trị pH: 3,31; 2,82 và 2,20. Chế độ chạy đẳng dòng và gradient đã đƣợc khảo sát. Chế độ đẳng dòng khảo sát ở 2 tỷ lệ pha động 88:12 (% thể tích của ACN : pha nƣớc) và 95:5 (% thể tích của ACN:pha nƣớc). 6 chƣơng trình gradient cũng đƣợc khảo sát để chọn đƣợc một chế độ chạy phù hợp nhất, hiệu quả tách tốt nhất. Với tốc độ dòng thay đổi theo thời gian từ 0,6 ml/phút tới 1,2 ml/phút từ thời điểm ban đầu đến khi kết thúc quá trình chạy khoảng 60 phút. 2.6.2 Đánh giá phương pháp phân tích. - Độ lặp lại: độ lặp máy và độ lặp xử lý mẫu dựa trên %RSD - Đánh giá sai số hệ thống của đƣờng chuẩn - Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu - Đối chiếu kết quả phân tích với kết quả phân tích trên hệ GC-MS. - So sánh sự khác nhau giữa 2 kết quả. 2.6.3 Phương pháp đối chiếu. Mẫu thực sau khi đƣợc phân tích trên hệ HPLC, detector PDA thu đƣợc các giá trị hàm lƣợng của các phtalat, sau đó các kết quả này đƣợc so sánh với kết quả thu đƣợc khi phân tích trên hệ GC-MS theo tiêu chuẩn CPSC-CH-C1001-09.3. Bảng 2.3: Điều kiện chạy GC – MS phân tích phtalat. Điều kiện cho GC Cột: DB-5MS; 30m x 0.25mm x 1,0 µm Nhiệt độ cổng bơm mẫu: 250 0 C Khí mang: khí He 1,0 ml/phút Dạng bơm mẫu: splitless Thể tích bơm mẫu: 1µl Chƣơng trình nhiệt độ: Chế độ Scan Chế độ SIM Tốc độ ( o C/phút) Nhiệt độ Thời gian duy trì nhiệt (phút) Tốc độ ( o C/phút) Nhiệt độ Thời gian duy trì nhiệt (phút) 50 0.5 100 0.5 30 270 2 30 270 2 15 295 1 15 295 1 15 300 5 15 300 5 10 305 1 10 305 1 10 310 6 10 310 4 Điều kiện cho MS Trì hoãn dung môi: 6 phút Nhiệt độ MS: 220 O C Nhiệt độ Transfer line: 310 0 C MS: EI- SIM/Scan Dạng Scan: dải khối lƣợng (50-550 amu) Cài đặt SIM: Các Ion tương ứng (m/z) BB (nội chuẩn) 91.1, 105*, 194, 212 DBP 149, 167, 205, 223* BBP 91.1, 149, 206* DEHP 149, 167, 279* DNOP 149, 167, 261, 279* DPP 149*, 191, 209 *: Ion nhận diện Phƣơng pháp xử lý mẫu nhƣ sau: mẫu đƣợc cân với khối lƣợng chính xác khoảng 0,2gam mẫu vào ống thủy tinh, sau đó thêm 5mL n-hexan vào đó, lắc đều, rung siêu âm 30 phút. Ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút, thu dịch lọc sang một ống sạch khác. Trƣớc khi bơm vào cột dung dịch đƣợc chảy qua màng lọc 0,45 µm. Kết quả thu đƣợc, đƣợc so sánh với kết quả thu đƣợc khi phân tích trên hệ HPLC. Sử dụng chuẩn Student để đánh giá sự khác nhau có ý nghĩa giữa hai kết quả thu đƣợc. CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký. 3.1.1 Van bơm mẫu. Ngày nay, van bơm mẫu 6 chiều rất phổ biến, do đó, chúng tôi lựa chọn loại van này và thể tích mẫu bơm là 50L. 3.1.2 Cột tách. Lựa chọn cột tách Cadenza CD-C 18 (250 mm × 4,6 mm × 3 μm) để tách các phtalat và định lƣợng chúng. Nhiệt độ cột 25 0 C. 3.1.3 Detector. Dựa vào điều kiện phòng thí nghiệm và mục tiêu của nghiên cứu, chúng tôi quyết định chọn detector PDA để phát hiện các chất phân tích. 3.1.4 Chọn bước sóng hấp thụ cực đại của các este phtalat. 200.0 225.0 250.0 275.0 nm 0 250 500 mAU 3.91/ 1.00 216 262 225 275 Hình 3.1: Phổ UV của các phtalat. 3.1.5 Khảo sát và chọn thành phần pha động phù hợp. Chúng tôi đã nghiên cứu, thử nghiệm các hệ dung môi sau:  Hệ dung môi 1: MeOH-H 2 O  Hệ dung môi 2: ACN-H 2 O  Hệ dung môi 3: ACN-dung dịch đệm trietylamin 0,04% đƣợc chỉnh pH 2,8 bằng dung dịch H 3 PO 4 1M. 3.1.5.1 Dung môi pha động là MeOH-H 2 O. Đối với hệ dung môi này có rất nhiều chất bị trùng pic, gần nhƣ bị chập hoàn toàn và đƣờng nền xấu. Chúng tôi đã thử một số chế độ gradient thành phần pha động để thay đổi khả năng tách, tuy nhiên sự tách vẫn chƣa đƣợc cải thiện. Bảng 3.2: Thời gian lưu của các cấu tử: Các phtalat Thời gian lƣu (phút) Nhận xét DMGP 6,4 BBP 18,3 Trùng với DEHP DBP 13,3 DPP 14,5 Trùng chân, rõ đỉnh với DCHP DCHP 14,7 DHP 15,7 DEHP 18,3 DNOP 19,4 3.1.5.2 Dung môi pha động là ACN-H 2 O. Thứ tự ra khỏi cột của 08 phtalat khảo sát là: DMGP – BBP – DBP – DPP – DCHP – DHP – DEHP – DNOP. Bảng 3.4: Chế độ chạy với pha động ACN- nước. Gradient 1 PI (đ.vị) Gradient 2 PI (đ.vị) Gradient 3 PI (đ.vị) T (phút) % ACN T (phút) % ACN T (phút) % ACN 0,01 65 7,34 0,01 65 7,34 0,01 65 7,34 3 85 6,48 5 85 6,48 5 85 6,48 6,5 100 5,80 10 95 6,02 10 100 5,80 19,5 100 5,80 20 95 6,02 20 100 5,80 23 85 6,48 25 85 6,48 28 85 6,48 35 Stop 30 65 7,34 40 Stop [...]... cách khác kết quả đo hàm lƣợng các phtalat bằng phƣơng pháp HPLC là đồng nhất với lƣợng phtalat thu đƣợc khi phân tích trên thiết bị GC-MS 3.3.3.3 Hàm lượng cho phép của các phtalat trong thực phẩm Theo Quyết định số 2204/QÐ-BYT [1] của bộ Y tế quy định về mức tối đa của DEHP trong thực phẩm, thì mức tối đa cho phép DEHP có trong thực phẩm không bao gồm nƣớc đóng chai trong và ngoài nƣớc là 1,5 mg/kg... phù hợp nhất để tách các phtalat Sau đó áp dụng điều kiện đó để dựng đƣờng chuẩn 08 phtalat đã chọn Và ứng dụng đƣờng chuẩn này để phân tích các phtalat đó trong một số mẫu thực phẩm 3 Phân tích đƣợc một số mẫu thực phẩm nhƣ mẫu phomai, mẫu thạch rau câu và mẫu bơ thực vật Kết quả cho thấy mẫu mayonaise không phát hiện các phtalat, còn mẫu bơ phát hiện đƣợc 03 trên tổng số 08 phtalat đã khảo sát Chúng... Quyết định đƣa ra là khác nhau Có thể dự đoán lƣợng phtalat này có trong mẫu thực phẩm phân tích là do thôi nhiễm từ hộp chứa bằng nhựa, vì mẫu phô mai không có bao bì nhựa thì không phát hiện phtalat, trong khi mẫu Bơ đƣợc chứa trong hộp nhựa thì lại phát hiện có phtalat Tuy nhiên nguyên nhân cụ thể chúng tôi xin đƣợc nghiên cứu và trình bày trong những công trình tiếp sau KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu. .. Bộ Y Tế, thấy rằng hàm lƣợng các phtalat đã vƣợt quá tiêu chuẩn cho phép Do đó, cần có những biện pháp đánh giá phát tán cụ thể, xác định nguyên nhân phát hiện các phtalat trong thực phẩm References Tiếng Việt 1 Bộ Y Tế (ngày 29 tháng 6 năm 2011), Quyết định: “Về việc ban hành quy định tạm thời mức giới hạn nhiễm chéo Bis-(2-ethylhexyl) phthalate trong thực phẩm , số 2204/QÐ-BYT 2 Phạm Luận(2000) Cơ... 7,16 1,075 DEHP 20,36 25,37 0,989 DNOP 22,71 6,09 0,991 3.1.5.5 Khảo sát nồng độ của trietylamin trong pha nước Theo một số nghiên cứu, nồng độ trietylamin trong pha nƣớc trong những trƣờng hợp tƣơng tự có thể lên tới cỡ hàng nghìn ppm, nhƣng tuy nhiên trong nghiên cứu này, lƣợng trietylamin là 0,04% khá ổn định nên chúng tôi chỉ khảo sát những nồng độ cách không xa mức nồng độ đã thử nghiệm Vì vậy, chúng... không mắc sai số hệ thống (cả sai số hệ thống biến đổi và không đổi) Tƣơng tự cũng so sánh đƣợc giá trị b và b’ của các đƣờng chuẩn các phtalat khác Kết quả cho thấy chúng đều khác nhau không tthucnghiem  có nghĩa, vì vậy có thể kết luận phƣơng pháp HPLC xác định các phtalat không mắc sai số hệ thống 3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 3.3.1 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp xử lý mẫu Bảng 3.24: Độ lặp... phƣơng pháp đƣợc thực hiện theo tiêu chuẩn của CPSC 09.3, phƣơng pháp đã đƣợc khảo sát và đánh giá lại cho phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm Vì vậy, coi kết quả phân tích mẫu thực phẩm bằng phƣơng pháp này là kết quả sát với giá trị thực, để kiểm tra kết quả phân tích trên hệ HPLC 3.3.3.2 So sánh hai kết quả thu được Bảng 3.30: Kết quả so sánh hàm lượng mẫu Bơ thực vật bằng chuẩn Student Các phtalat. .. nghiên cứu và khảo sát các điều kiện tối ƣu và quy trình phân tích một số phtalat trong thực phẩm chúng tôi thu đƣợc nhƣ sau: 1 Đã tối ƣu hóa đƣợc các điều kiện tách 08 phtalat bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, có sử dụng detector PDA Các điều kiện tối ƣu bao gồm: - Chọn đƣợc hệ dung môi phù hợp nhất và cho hiệu quả tách tốt nhất 08 phtalat đã lựa chọn trên hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector... 3,44 95,7 ± 3,85 Kết quả đô thu hồi của các phtalat khá cao, từ 93% - 105% Vì vậy có thể kết luận phƣơng pháp xử lý mẫu này đáng tin cậy 3.3 Phân tích mẫu thực tế Áp dụng các điều kiện tối ƣu đã đƣợc khảo sát, chúng tôi tiến hành phân tích một vài mẫu thực Mẫu phomai con bò cƣời không phát hiện thấy các phtalat Bảng 3.28: Kết quả phân tích mẫu Bơ thực vật Các phtalat Lần 1(ppm) Lần 2(ppm) Lần 3(ppm) m... quả phân tích hàm lượng phtalat trên hệ GC-MS Các mẫu thực đƣợc phân tích kiểm tra trên thiết bị GC-MS của hãng Thermo với mã hiệu DSQ, các thông số hệ thống và quá trình tách đƣợc áp dụng tiêu chuẩn CPSC-CH- C1001-09.3 [20] của tổ chức CPSC (Consumer Product Safety Commissions), mẫu đƣợc xử lý theo quy trình nêu ở chƣơng II Thu đƣợc kết quả hàm lƣợng các phtalat trong các mẫu thực phẩm nhƣ sau: Mẫu . phƣơng pháp định lƣợng một số Phtalat trong thực phẩm. Xây dựng đƣợc phƣơng pháp phân tích định lƣợng đồng thời các phtalat trong một số mẫu thực phẩm bằng. chúng tôi đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu phương pháp định lượng một số phtalat trong thực phẩm để biết đƣợc những thực phẩm có hại và có biện pháp tránh