Đang tải... (xem toàn văn)
Sự lai hóa phân tử có thể hiểu theo một nghĩa khái quát là một chiến lược thiết kế các phối tử một cách hợp lý để làm xuất hiện các cấu trúc của chất mẫu hoặc dựa trên sự nhận biết các[r]
(1)gfd
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-o0o -
NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM, KHÁNG UNG THƢ CÁC HỢP CHẤT LAI COXIB –
COMBRETASTATIN
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
(2)BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌCVÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-
NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM, KHÁNG UNG THƢ CÁC HỢP CHẤT LAI COXIB –
COMBRETASTATIN Chuyên ngành: Hóa hữu
Mã số : 9.44.01.14
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1 PGS TS Ngô Quốc Anh PGS.TS Vũ Đình Hồng
(3)LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi cộng Các kết nghiên cứu không trùng lặp chưa công bố tài liệu khác
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Tác giả
(4)LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngơ Quốc Anh PGS.TS Vũ Đình Hồng người thầy tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, bảo truyền động lực, niềm đam mê nhiệt huyết khoa học cho suốt thời gian thực luận án
Tôi xin trân thành cảm ơn thầy cô giảng dạy hướng dẫn suốt thời gian học tập làm việc
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học, Học viện Khoa học Cơng nghệ, phịng chun mơn, cán nghiên cứu phòng Nghiên cứu phát triển dược phẩm – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ủng hộ, giúp đỡ thời gian thực luận án
Cuối xin gửi lời tri ân tới gia đình, người thân, bạn bè ln bên, động viên tơi hồn thành luận án
Nghiên cứu sinh
(5)MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Khái niệm hợp chất lai
1.2 Tổng quan chất lai chống ung thƣ
1.2.1 Các hợp chất lai chống ung thư dựa chất ức chế tubulin 3
1.2.2 Các chất lai chống ung thư dựa hợp chất isatin 4
1.2.3 Các chất lai chống ung thư dựa nhóm chất coumarin 5
1.2.4 Các chất lai chống ung thư dựa nhóm chất steroid 5
1.2.5 Các chất lai chống ung thư dựa pyrrolo benzodiazepin 6
1.2.6 Một số chất lai theo chế khác 7
1.3 Khái niệm vai trò tubulin
1.4 Các chất lai chống ung thƣ dựa chất ức chế tubulin
1.4.1 Hợp chất lai dựa cấu trúc combretastatin (1) 9
1.4.2 Thuốc lai dựa cấu trúc colchicin (2) 10
1.4.3 Thuốc lai dựa cấu trúc podophyllotoxin 11
1.4.4 Hợp chất lai dựa cấu trúc chalcon 12
1.4.5 Thuốc lai dựa cấu trúc taxol 13
1.4.6 Thuốc lai dựa cấu trúc vinca alkaloid 14
1.5 Các hợp chất lai combretastatin 15
1.5.1 Tổng quan hợp chất combretastatin 15
1.5.2 Các chất lai combretastatin 21
1.6 Tổng quan chế COX2 pyrazol 25
1.6.1 Tổng quan chế COX2 25
1.6.2 Các hợp chất pyrazol 26
(6)1.7 Mục tiêu luận án 29
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 31
2.1 Hóa chất thiết bị 31
2.1.1 Hóa chất dung mơi 31
2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 31
2.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu 31
2.2.1 Phương pháp tổng hợp hữu 31
2.2.2 Tinh chế xác định cấu trúc 32
2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 32
2.3 Tổng hợp hợp chất lai coxib - combrestatin 32
2.3.1 Tổng hợp dẫn chất este chất lai este coxib - combretastatin 32
2.3.1.1 Con đường tổng hợp dẫn chất este hợp chất lai hóa coxib - combrestatin 32
2.3.1.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất este chất lai coxib- combrestatin33 Phản ứng tổng hợp theo sơ đồ sau: 33
2.3.1.3 Quy trình tổng hợp dẫn chất este chất lai coxib - combrestatin 33
2.3.1.4 Kết quy trình tổng hợp 34
2.3.2 Tổng hợp hợp chất lai coxib - combrestastatin chứa nhóm CF3 35
2.3.2.1 Con đường tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 35
2.3.2.2 Phản ứng tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 36
2.3.2.3 Quy trình tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 36
2.3.2.4 Kết quy trình tổng hợp 36
2.3.3 Tổng hợp dẫn chất axit hợp chất lai coxib - combretastatin 37
2.3.3.1 Con đường tổng hợp dẫn chất axit chất lai coxib - combrestatin 37
2.3.3.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất axit chất lai coxib - combrestatin 38
(7)2.3.3.4 Kết quy trình tổng hợp 40
2.4 Nghiên cứu hoạt tính sinh học 40
2.4.1 Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào (HT-29, Hep-G2, MCF7 ) khả ức chế sản sinh NO 40
2.4.1.1 Nghiên cứu hoạt tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) 40
2.4.1.2 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế nitric oxide 40
2.4.2 Nghiên cứu hoạt tính ức chế PGE2 42
2.4.3 Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis 43
2.5.3.1 Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342 43
2.5.3.2 Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis qua Flow cytometry 43
2.5.3.3 Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis caspase 44
2.4 Nghiên cứu docking phân tử 44
CHƢƠNG 3: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 47
3.1 Thiết kế cấu trúc hoạt tính sinh học phân tử lai 47
3.1.1 Thiết kế cấu trúc phân tử lai 47
3.1.2 Thiết kế hoạt tính sinh học phân tử lai 48
3.2 Tổng hợp hợp chất lai coxib - combretastatin 49
3.3 Hoạt tính sinh học hợp chất lai coxib - combretastatin 72
3.3.1 Sàng lọc hoạt tính sinh học hợp chất lai coxib - combretastatin 73
3.3.2 Nghiên cứu chế kháng viêm kháng ung thư 78
3.3.2.1 Nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2 78
3.3.2.2 Phân tích chu kỳ tế bào 79
3.3.2.3 Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis hai chất 82 và 102 81
3.4 Nghiên cứu docking phân tử 88
3.5 Thảo luận 95
KẾT LUẬN 96
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 98
(8)DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ
viết tắt
Tiếng Anh Tiếng Việt
TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng
CC Column Chromatography Sắc ký cột
HRMS High resolution Mass
Spectroscopy Phổ khối lượng phân giải cao
ESI-MS Electrospray Ionization Mass
Spectroscopy Phổ khối ion hóa phun điện
IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại
1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
13
C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13
s Singlet Tín hiệu đơn
d Doublet Tín hiệu đơi
dt Triplet Tín hiệu ba
m Multiplet Cụm tín hiệu
dd Doublet doublet Tín hiệu đơi
dt Doublet triplet Tín hiệu đơi ba
MW Microwave Vi sóng
(9)Rt Room temperature Nhiệt độ phòng THF Tetra hydro furan
TMS-N3 Trimetylsilyl azid MeCN Acetonitril
Et3N Trietylamin
EtOH Ethanol
AcOH Acetic acid Axit Acetic
L-Pro L-Propine
DMF Dimetyl focmamit
t-BuOH tert-Butanol i-PrOH Iso Propanol
BnNH2 Benzylamin
PPh3 Triphenyl phosphin
MeOH Methanol
EtOAc Etyl acetate
(DHQ)2PH ALHydroquinin
1,4-phthalazinediyl diete Et3SiH Trietyl silan
BF3.OEt2 Bo triflo etyl ete Et2O Dietyl ete
(10)NaH Natri hydrua Kiềm NaH
LiAlH4 Liti aluminium hydride Liti nhôm hydrua CBr4 Carbon tetrabromide
Pd(PPh3)4 triphenylphosphine)palladium
NaCO3 Natri cacbonat Kiềm cacbonat
DME Dimethyl Ether
TBDMSCl tert-Buty (chloro)
dimethylsilane Ac2O Acetic anhydrit SRB Sulforhodamine B DMSO Dimethylsulfoxide DMSO-d6 Dimethylsulfoxide-d6
UV Ultraviolet Tia cực tím
OD Optical Density Mật độ quang học
SRB Sulforhodamine B
CA4 Combretastatin A4
AND Deoxiribonucleic acid Axit deoxiribonucleic
ARN Ribonucleic acid Axít ribonucleic
IC50 The half maximal inhibitory concentration
(11)HepG2 Human Hepatocellular
carcinoma Dòng tế bào ung thư gan người
Lu Lung cancer Dòng tế bào ung thư phổi
MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 Dòng tế bào ung thư vú HT -29 Human breast carcinoma Ung thư đại tràng người DNA deoxyribonucleic acid đơn vị nucleotide
NO Nitric oxid oxit nitric
ROS Reactive oxygen species
COX Cyclooxygenase enzyme
PGE2 Prostaglandin E2 PGI2 prostaglandin I2 PS Phosphatidylserine
(12)DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1 Vị trí nhóm chất lai dạng este coxib - combretastatin 34
Bảng 2.2 Thống kê chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 37
Bảng 2.3 Vị trí nhóm chất lai dạng axit coxib - combretastatin 38
Bảng 3.1 Kết tổng hợp chất este từ chất 79 đến chất 98 50
Bảng 3.2 Kết tổng hợp chất 65, 102 62
Bảng 3.3 Kết tổng hợp dẫn chất axit từ chất 103 đến chất 122 62
Bảng 3.4 Tác dụng gây độc tế bào hợp chất lai hóa dạng este ba dịng tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF-7 ức chế sản xuất NO 73
Bảng 3.5 So sánh tác dụng gây độc tế bào hợp chất lai hóa dạng axit dạng este tế bào ung thư MCF-7 ức chế sản xuất NO 76
Bảng 3.6 Các chất lai có hoạt tính sinh học trội gây độc tế bào MCF7 78
Bảng 3.7 Ảnh hưởng hợp chất thử nghiệm đến việc sản xuất PEG2 đại thực bào RAW 264.7 kích thích LPS 79
Bảng 3.8 Phần trăm tế bào theo pha hợp chất thử nghiệm với MCF7 80
Bảng Phần trăm ngưng tụ phân mảnh nhân tế bào hợp chất 102 82 gây 82
Bảng 3.10 Hoạt tính caspase - 102 82 84
Bảng 3.11 Tỉ lệ tế bào apoptosis 85
Bảng 3.12 Lựa chọn mơ hình cấu trúc COX-2 tubulin tương ứng sử dụng cho chương trình docking 88
Bảng 3.13 Tập hợp hợp chất thiết kế với điểm kết nối tương ứng hai mơ hình protein (kcal/mol) 90
(13)DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Các chất ức chế tubulin sử dụng thuốc lai chống ung thư
Hình 1.2 Isatin số hợp chất lai
Hình 1.4 estradiol (13) số hợp chất lai
Hình 1.5 PBD số hợp chất lai
Hình 1.6 Một số hợp chất lai theo chế khác
Hình 1.7 a) Các vị trí liên kết với tubulin
b) Cấu trúc trình trùng hợp, phân rã microtubule [30]
Hình 1.8 Cấu trúc số chất phân lập từ C caffrum
Hình 1.9 Cấu trúc số chất lai combretastatin 10
Hình 1.10 Cấu trúc số chất lai 11
Hình 1.11 Cấu trúc số chất lai 12
Hình 1.12 Cấu trúc số chất lai 13
Hình 1.13 Cấu trúc số chất lai taxol 13
Hình 1.14 Cấu trúc số chất lai vinca alkaloid 15
Hình 1.15 Cấu trúc stilben 15
Hình 1.16 Cấu trúc combretastatin A-4 phosphate (42), combretastatin A-1 phosphate (43) 16
Hình 1.17 Tổng hợp hợp chất mô combretastatin 17
Hình 1.18 Các thành viên đại diện nhóm combretastatin 18
Hình 1.19 Cấu trúc khung combretastatin (55) cấu trúc isocombretastatin (56) 18
Hình 20 Combretastatin độc tế bào theo chế tubulin 20
Hình 1.21 Mơ hình liên kết CA4 (đỏ) COL (xanh dương) với tubulin 20
Hình 1.22 Lai Combretstatin A-4 – Steroid (21, 22) 22
Hình 1.23 Lamellarrin T combretstatin A-4 23
Hình 1.24 Lamellarrin D (62) combretstatin A-4 (1) 24
Hình 1.25 Lai Combretastatin-isocombretastatin (30) 24
Hình 1.27 hợp chất lai pyrazole - imidazopyrazole 28
(14)Hình 1.29 Chất lai quinoline–pyrazole (73) 29
Hình 1.30 Chất lai pyrazole–thiadiazole (74) 29
Hình 2.1 Con đường tổng hợp hợp chất lai ghép dạng este 33
Hình 2.2 Tổng hợp dẫn chất este hợp chất lai hóa coxib - combrestastatin 33
Hình 2.3 Cơng thức cấu tạo hợp chất 79-98 35
Hình 2.4 Con đường tổng hợp hợp chất lai 36
Hình 2.5 Tổng hợp hợp lai hóa coxib - combretastatin dang triflo 36
Hình 2.6 Cơng thức cấu tạo hợp chất 43, 102 37
Hình 2.7 Con đường tổng hợp hợp chất lai ghép dạng axit 37
Hình 2.8 Tổng hợp khung lai ghép coxib - combretastatin dạng axit 38
Hình 2.9 Cơng thức cấu tạo hợp chất 103-122 40
Hình 3.1 Cấu trúc celecoxib, Combretastatin A4 hợp chất lai coxib - combretastatin 47
Hình 3.2 Đánh giá mức độ biểu PGE-2 hợp chất 102, 96, 81, 82, 94, Celecoxib nồng độ 20 µM đại thực bào RAW-264,7 sau 48 xử lý 79
Hình 3.3 Phân tích chu kỳ tế bào hợp chất thử nghiệm bao gồm 102, 96, 81, 82, 94 nồng độ 10 µM Celecoxib (65) nồng độ 30 µM MCF-7 81
Hình 3.4 Hình ảnh tế bào MCF7 nhuộm Hoechst 33342 tác động mẫu nghiên cứu nồng độ khác 83
Hình 3.5 Tác động mẫu nghiên cứu đến q trình apoptosis tế bào thơng qua Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit Các mẫu thử phân tích hệ thống flowcytometry Trục x thể mức độ nhuộm mầu FITC-Anexin V, trục y thể mức độ nhuộm mầu PI theo đơn vị Log 86
Hình 3.6 Các dạng liên kết hydro hợp chất với protein COX-2 (PDB ID: 3LN1) tubulin (PDB ID: 1Z2B) (A) chất 102 với COX-2; (B) Chất lượng 102 với tubulin; (C) chất 82 với COX-2; (D) Hợp chất 82 với tubulin 91
Hình 3.7 Vị trí gắn kết 2D hợp chất thiết kế với protein COX-2 PDB ID: 3LN1) tubulin (PDB ID: 1Z2B) (A) hợp chất 102 với COX-2; (B) hợp chất 102 với tubulin; (C) hợp chất 82 với COX-2; (D) hợp chất 82 với tubulin 93
(15)(16)1
MỞ ĐẦU
Ung thư nhóm bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào cách vô tổ chức tế bào có khả xâm lấn mô khác cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận di chuyển đến nhiều vị trí khác (di căn) Theo thống kê tổ chức Ung thư tồn cầu GLOBOCAN năm 2018 nước có 300.000 người sống chung với ung thư, có 164.671 ca mới, 114.871 người tử vong bệnh Toàn cầu có khoảng 23 triệu người mắc, năm có 14 triệu người mắc triệu trăm nghìn người tử vong Tổ chức Y tế giới (WHO) xếp Việt Nam nằm 50 nước thuộc top đồ ung thư
Hiện nay, thuốc sử dụng thường theo chế tác dụng đơn lẻ, nhiều tác dụng phụ bắt đầu có biểu kháng thuốc, dẫn đến cần thiết tiếp tục nghiên cứu phát triển loại thuốc ung thư Gần việc phát triển thuốc chống ung thư có nhiều đích tác dụng vấn đề thời nhờ hiệu vượt trội so với mục tiêu [1-2] Hơn nữa, nghiên cứu lâm sàng ra, kết hợp nhiều loại thuốc với nhiều chế tác dụng khác thu hiệu cao cho bệnh nhân kháng thuốc [3] Do đó, thiết kế hợp chất lai kháng ung thư với nhiều đích tác dụng xu hướng Các hợp chất lai có khả tác động đồng thời lên nhiều đích tác dụng nhờ cấu trúc chúng có kết hợp nhiều phân tử thuốc riêng lẻ đặc điểm cấu trúc hóa học phân tử thuốc
(17)2
mới có tích hợp hoạt tính trội hai chất gốc ban đầu Luận án với tiêu
đề “Nghiên cứu tổng hợp hoạt tính kháng viêm, kháng ung thƣ hợp chất lai
coxib – combretastatin” góp phần tìm loại thuốc chống ung thư đa đích
(18)3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm hợp chất lai
Những đặc điểm trội kết hợp đa đích tác dụng điều trị lâm sàng bệnh nhân không đáp ứng thuốc dẫn đến hợp chất lai quan tâm nghiên cứu [3] Sự lai hóa phân tử hiểu theo nghĩa khái quát chiến lược thiết kế phối tử cách hợp lý để làm xuất cấu trúc chất mẫu dựa nhận biết đơn vị dược lý chất mẫu phát huy bảo tồn nguyên dẫn đến hợp chất lai thu giữ đặc tính tiêu biểu phiên gốc theo mục tiêu thiết kế ban đầu [6] Đây khái niệm thiết kế phát triển thuốc nhằm tạo hợp chất lai lực hiệu so với thuốc gốc đơn lẻ Sự lựa chọn đối tác lai ghép dựa đặc tính cấu trúc hoạt tính sinh học chất gốc Phân tử lai thu kết hợp hai dược chất phân tử với mục đích khuếch đại tác dụng thông qua tác dụng đồng thời lên mục tiêu đơn lẻ đối vận tác dụng phụ chất gốc dẫn đến làm giảm tác dụng phụ phân tử lai [7-8]
1.2 Tổng quan chất lai chống ung thƣ
Sự không đồng khối u khả kháng thuốc dẫn đến hạn chế điều trị hóa xạ trị, đòi hỏi phương pháp tiếp cận nhằm kích hoạt nhiều mục tiêu để tăng tính hiệu thuốc điều trị Chiến lược hợp chất lai bước đầu đáp ứng hạn chế mơ hình in vitro thể qua nhiều cơng trình nghiên cứu Nhiều chế tác dụng cấu trúc mẫu sử dụng làm chất gốc Tuy nhiên phân loại chất lai dựa số nhóm chất tiêu biểu liệt kê sau đây:
1.2.1 Các hợp chất lai chống ung thư dựa chất ức chế tubulin
(19)4
nghiên cứu ứng dụng lâm sàng Tuy nhiên hoạt động độc lập chúng thể nhiều tác dụng phụ Do vậy, xoay quanh cấu trúc chất ức chế tubulin này, có nhiều chất lai thiết kế phát triển hướng tới nhiều đích tác dụng sinh học vốn có chất gốc
Hình 1.1 Các chất ức chế tubulin sử dụng thuốc lai chống ung thư
1.2.2 Các chất lai chống ung thư dựa hợp chất isatin
(20)5
Hình 1.2 Isatin số hợp chất lai
1.2.3 Các chất lai chống ung thư dựa nhóm chất coumarin
Coumarin (10) lần phân lập từ đậu tonka cỏ ba vào năm 1820 [13] Coumarin biết đến với khả chống ung thư, kháng viêm, kháng virus [14] Một số sản phẩm lai coumarin coumarin - pyrazolin (11) [15], coumarin-stilben (12) [16] thể mạnh khả chống ung thư hoạt chất coumarin đồng thời thu nhận thêm hoạt tính đối tác lai
Hình 1.3 Coumarin số hợp chất lai
1.2.4 Các chất lai chống ung thư dựa nhóm chất steroid