TÁCH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH ENZYME

CHƯƠNG 1 TÁCH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH ENZYME CHƯƠNG 1 TÁCH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH ENZYME 1 Các phương pháp phá vỡ tế bào 1 1 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học Mục đích của phá vỡ tế bào là giải phóng các chấ[.]

CHƯƠNG 1: TÁCH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH ENZYME Các phương pháp phá vỡ tế bào 1.1 Phá vỡ tế bào phương pháp học Mục đích phá vỡ tế bào giải phóng chất có tế bào đảm bảo hoạt tính enzyme nội bào Việc phá vỡ tế bào sinh vật bao gồm phá vỡ tế bào động vật, thực vật VSV Đối với tế bào động vật, người ta thường sử dụng tồn quan (hay mơ bào) động vật có chứa enzyme cần phải loại bỏ mỡ thành phần khác bám theo mô bào đó, mẫu cần xử lý nhanh phải thu nhận enzyme thời gian không kể từ giết mỗ Đối với tế bào mô bào thực vật, cần phải làm phải trữ lạnh chưa tiến hành thu nhận enzyme Tế bào động vật thực vật thường dễ phá vỡ phương pháp học Riêng tế bào vi sinh vật, việc phá vỡ tế bào có khó khăn định - Tế bào vi sinh vật có kích thước q nhỏ, việc phá vỡ tế bào phương pháp nghiền chất trợ nghiền khơng có hiệu - Vi sinh vật thể đơn bào, phát triển môi trường, đặc biệt môi trường lỏng có nhiều chất thủy phân, chúng tạo nhiều enzyme ngoại bào tương ứng Các enzyme ngoại bào hịa tan mơi trường dễ dàng tách chúng khỏi dung dịch ni cấy, cơng nghiệp người ta tiến hành nghiền tế bào (trừ trường hợp phải thu nhận enzyme nội bào) Tuy nhiên, thời gian gần đây, việc nghiên cứu enzyme nội bào VSV ngày nhiều, phương pháp học ứng dụng để phá vỡ tế bào VSV ngày nhiều * Phương pháp đồng hóa áp lực cao: Đây phương pháp ứng dụng rộng rãi để phá vỡ tế bào quy mô công nghiệp Theo phương pháp này, huyền phù tế bào nén với áp suất cao, chúng va chạm mạnh vào vành ống (máy đồng hóa maton-gaulin) Tế bào bị phá vỡ lực cắt sức nén Tùy thuộc vào loại máy, công suất từ 50 – 5000 lít/giờ mà áp lực cần có khác Mặt khác, tính chất, cấu tạo tế bào khác địi hỏi áp lực khác Ví dụ tế bào vi khuẩn người ta cần áp lực khoảng 550 bar Phương pháp đồng hóa áp lực cao thường áp dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khuẩn Tế bào động vật tế bào thực vật phải dùng phương pháp * Phương pháp nghiền ẩm: Đây phương pháp sử dụng rộng rãi công nghiệp sản xuất enzyme Trong trình nghiền, người ta thường sử dụng viên bi thủy tinh có kích thước 0.2 – 1mm để tăng trình phá vỡ tế bào Trong nhiều trường hợp, người ta không dùng viên bi thủy tinh mà người ta dùng hạt thủy tinh, hạt thủy tinh có độ ma sát cao viên bi thủy tinh nên hiệu suất nghiền tốt 1.2 Phá vỡ tế bào phương pháp học Ngồi hai phương pháp học trên, người ta cịn phá vỡ tế bào phương pháp phương pháp học Các phương pháp bao gồm phương pháp hóa học, phương pháp nhiệt phương pháp enzyme (ở số tài liệu người ta gọi phương pháp hóa học, phương pháp vật lý phương pháp sinh học) Phương pháp hóa học: Là phương pháp dựa khả tạo áp suất thẩm thấu mạnh, khả oxy hóa mạnh chất hóa học để phá vỡ thành tế bào Phương pháp khơng địi hỏi áp suất cao, phí dễ thực Tuy nhiên q trình thực hiện, người ta sử dụng hóa chất nên hóa chất thường lẫn vào hỗn hợp, địi hỏi q trình tách phức tạp Một hóa chất sử dụng nhiều acetone Phương pháp vật lý: Là phương pháp sử dụng siêu âm, phương pháp thường sử dụng phòng thí nghiệm, chưa thấy sử dụng quy mơ cơng nghiệp Một phương pháp vật lý khác ứng dụng nhiều nghiên cứu sản xuất dạng thử nghiệm tạo shock nhiệt hay shock thẩm thấu Nguyên tắc phương pháp là, đưa nhiệt độ tế bào huyền phù xuống nhiệt độ thấp, nâng nhiệt đến 400C (thao tác nâng nhiệt nhanh), thành tế bào bị phá vỡ người ta thu huyền phù tế bào vỡ Phương pháp thường dễ thực hiện, đảm bảo hoạt tính enzyme hiệu suất phá vỡ tế bào không cao Phương pháp sinh học (phương pháp enzyme) Có hai phương pháp sử dụng rộng rãi phương pháp tự phân phương pháp thủy phân enzyme đưa từ bên vào Phương pháp tự phân phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho số enzyme có khả phân giải cho số thành phần thành tế bào, enzyme phải enzyme có tế bào tế bào Bình thường enzyme khơng hoạt động mạnh, điều kiện nhiệt độ, pH, nước bên tế bào mà trùng với mức hoạt động tối ưu chúng, chúng hoạt động mạnh thủy phân thành tế bào, làm chết tế bào Tự phân trình áp dụng nhiều trình phá vỡ thành tế bào loại nấm men Người ta thường tiến hành trình tự phân huyền phù tế bào nấm men nhiệt độ 48 – 520C, khoảng thời gian – 24 Phương pháp có nhiều nhược điểm q trình thủy phân, enzyme có tế bào khơng thủy phân chất thành tế bào mà chất có tế bào, chí enzyme bị phá hủy Phương pháp không sử dụng nhiều công nghiệp Một phương pháp khác nghiên cứu nhiều phương pháp sử dụng enzyme từ tế bào Các enzyme đưa vào huyền phù tế bào để tiến hành trình thủy phân có định hướng chất định thành tế bào Người ta thường sử dụng hệ enzyme cellulase để phá vỡ thành tế bào nấm men thành tế bào thực vật Phương pháp không gây hư hỏng chất có tế bào thực dễ dàng điều kiện (phịng thí nghiệm, sản xuất thử nghiệm, sản xuất công nghiệp) Ngồi ra, người ta cịn sử dụng lysozym loại tế bào khác 2.2 Các Phương pháp học tách enzyme Các phương pháp học ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào thành phần khác gồm hai phương pháp: - Phương pháp ly tâm - Phương pháp lọc 2.2.1 Phương pháp ly tâm Ly tâm trình tách vật chất rắn khỏi dung dịch Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường ứng dụng rộng rãi để thu nhận dung dịch enzyme, dung dịch chứa enzyme ngoại bào Enzyme nội bào nằm tế bào sinh vật, muốn thu nhân enzyme nội bào ta phải tiến hành giai đoạn phá vỡ tế bào Phần lớn enzyme ngoại bào (exoenzyme) enzyme hòa tan Như tiến hành ly tâm, dung dịch tách khỏi thành phần rắn dung dịch enzyme thơ, dung dịch enzyme thơ cịn chứa thành phần sau: - Protein có hoạt tính sinh học - Các chất hòa tan khác - Nước Phương pháp ly tâm tách thành phần rắn có tỷ trọng lớn dung dịch Dịch thu chưa phải chế phẩm enzyme tinh khiết mà chế phẩm enzyme thơ, cịn chứa protein khơng hoạt động, nước chất hòa tan khác Đối với sinh khối động vật thực vật, sau nghiền ta thu hỗn hợp nhiều thành phần Ly tâm hỗn hợp ta thu dung dịch enzyme thô tương tự VSV Để tránh tượng biến tính enzyme, mẫu nghiên cứu, người ta thường tiến hành ly tâm lạnh, cịn sản xuất theo quy mơ công nghiệp, người ta thường tiến hành điều kiện nhiệt độ thấp Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịch enzyme máy ly tâm liên tục Phương pháp ly tâm liên tục có ưu điểm thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục, không gây ảnh lớn đến hoạt tính enzyme Hiện nay, cơng nghệ enzyme, người ta sử dụng rông rãi ba kiểu ly tâm: ly tâm hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa Ngồi ba kiểu ly tâm điển hình trên, số nhà máy sản xuất enzyme có sử dụng số kiểu ly tâm khác Việc chọn kiểu ly tâm hay ly tâm khác phải xem xét đến hai yếu tố quan trọng: nồng độ chất rắn (%), kích thước vật lắng 2.2.2 Phương pháp lọc Trong công nghệ enzyme, sau phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau lên men, người ta thường sử dụng trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme ngoại bào hòa tan Lọc phương pháp tách thành phần rắn khỏi dung dịch Lọc phương pháp thực thường gặp nhiều khó khăn kích thước vật chất tế bào thường nhỏ, độ nhớt dung dịch thường cao Cả hai yếu tố làm cản trở trình lọc Tốc độ lọc phụ thuộc lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc; độ nhớt dịch lọc; sức đề kháng Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng kiểu sau: - Lọc ép: Lọc ép (lọc đĩa, buồng lọc) thường sử dụng trường hợp dung dịch cần lọc có khối lượng nhỏ Phương pháp sử dụng để lọc enzyme có hiệu - Lọc chân không: Là phương pháp ứng dụng nhiều nghiên cứu sản xuất sản phẩm sinh học có hoạt tính Trong đó, lọc chân không quay sử dụng nhiều - Lọc theo dòng chảy cắt ngang Trong năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dịng chảy cắt ngang Theo đó, dịng dung dịch lọc chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc Phần lọc thoát qua vật liệu lọc xuống phía Phương pháp có ưu điểm giảm sức đề kháng trình lọc vật liệu chất rắn - Lọc thông thường Phương pháp lọc thơng thường có từ lâu, số nhà máy sử dụng Phương pháp lọc thay dần phương pháp khác nhanh hơn, có hiệu 2.3 Phương pháp cô đặc Dung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều Để xử lý khối lớn dung dịch enzyme phải tốn nhiều công sức chi phí cho xử lý cao Mặt khác lượng enzyme có dịch enzyme thơ q ít, hoạt tính enzyme khơng cao Chính thế, người ta phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm số mục đích sau: - Làm tăng hoạt tính enzyme khối lượng dung dịch enzyme - Làm giảm chi phí cơng sức cho việc xử lý sau - Tăng khả bảo quản enzyme - Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản - Tăng hiệu suất tác động enzyme chất Để đạt mục đích đó, người ta tiến hành đặc enzyme phương pháp sau: 2.3.1 Phương pháp nhiệt Chúng ta tiến hành đặc enzyme phương pháp nhiệt, sử dụng nhiệt để cô đặc enzyme thường gặp nhiều khó khăn enzyme protein nhạy cảm với nhiệt độ, nguyên nhân hầu hết enzyme tổng hợp tế bào (trừ enzyme nhân tạo) Trong thể, enzyme thường hoạt động điều kiện nhiệt hoạt động tế bào sống Trường hợp nhiệt độ vượt nhiệt độ hoạt động tế bào sống, tế bào chết Enzyme hoạt tính nguyên nhân làm tế bào chết, phản ứng trao đổi chất tế bào không xảy nữa, trao đổi chất tế bào bị ngưng trệ, tế bào tồn Khi enzyme tách khỏi tế bào thường hoạt động nhiệt tối ưu cao nhiệt độ sinh lý tế bào, tượng thấy hầu hết loại enzyme Tùy theo nguồn thu nhận enzyme tính chất loại enzyme mà định chế độ gia nhiệt q trình đặc Q trình đặc q trình làm bốc nước, làm cho lượng nước dung dịch giảm đi, hàm lượng enzyme dung dịch tăng lên, hoạt tính enzyme tăng cao Tuy nhiên khơng ý đến điều kiện nhiệt độ để khống chế khoảng cho phép hoạt tính enzyme bị nhiều, chí dẫn đến triệt tiêu hoạt tính Do đó, việc khống chế nhiệt độ với thời gian cần thiết q trình đặc điều cần thiết Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng phương pháp sau: - Bốc lớp mỏng - Bốc ly tâm lớp mỏng - Bốc ống dài 2.3.2 Phương pháp kết tủa Kết tủa phương pháp sử dụng rộng rãi nghiên cứu enzyme phịng thí nghiệm sản xuất enzyme quy mơ sản xuất công nghiệp Phương pháp kết tủa dựa nguyên tắc, enzyme phức hợp protein có khả tạo kết tủa với số dung môi Trong trình kết tủa, người ta phân biệt hai thuật ngữ: kết tủa âm kết tủa dương - Kết tủa âm: kết tủa protein tạp Phần protein cần thiết nằm dung dịch không nằm phần tủa - Kết tủa dương hồn tồn ngược lại, protein cần thiết lại nằm phần kết tủa protein tạp nằm phần dung dịch * Phương pháp kết tủa muối: Muối nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hịa tan enzyme Trong cơng nghiệp enzyme người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate Các thiết bị dùng trình kết tủa muối ammonium sulfate thường chế tạo thép không rỉ Tuy nhiên, thép khơng rỉ có nhiều loại, nhiều trường hợp thiết bị chế tạo từ thép không rỉ bị ăn mòn ammonium sulfate Sau người ta thay ammonium sulfate sodium sulfate, muối không gây hư hỏng thiết bị, song chúng lại tính hịa tan tốt Nhiệt độ tiến hành kết tủa 35 – 400C, để tránh khả làm hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối dung dịch enzyme trước trộn hai loại dung dịch với Khoảng tối ưu nồng độ muối dùng kết tủa enzyme rộng, khoảng 20 – 80% * Phương pháp kết tủa enzyme dung môi hữu cơ: Dung mơi hữu có ảnh hưỡng lớn đến khả hịa tan enzyme, ảnh hưởng solvate hóa phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác phân tử enzyme bị tăng lên Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng ethanol acetone để kết tủa enzyme Khi tiến hành kết tủa enzyme dung môi hữu cần lưu ý đến nhiệt độ Do enzyme nhạy cảm với nhiệt độ có mặt chất ethanol acetone, nên bắt buộc ta tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh dung môi hữu dung dịch enzyme Mức độ nhạy cảm nhiệt độ enzyme có mặt dung môi hữu thường mạnh mức độ nhạy cảm enzyme với nhiệt độ có mặt muối vô Người ta thường kết tủa enzyme dung môi hữu nhiệt độ từ – 100C Tỷ lệ nồng độ dung môi hữu dùng để kết tủa enzyme xác định thực nghiệm cho loại enzyme nồng độ enzyme có dung dịch enzyme * Kết tủa enzyme polymer: Polyethylene glycol polymer cao phân tử ứng dụng rộng rãi kết tủa protein, enzyme Nhiều tác giả cho chế lắng chúng gần giống dung môi hữu Phương pháp có ưu điểm ta thực trình kết tủa enzyme nhiệt độ bình thường (nhiệt độ phịng thí nghiệm) lượng polyethylene glycol cần sử dụng để kết tủa không nhiều (khoảng – 15 %) Nếu sử dụng nồng độ cao làm độ nhớt dung dịch cao tạo nhiều khó khăn cho kỹ thuật làm sau Polymer sử dụng rộng rãi để kết tủa enzyme nghiên cứu sản xuất theo quy mô công nghiệp Các polymer sử dụng nhiều polyethylenamin polyethylene glycol với khối lượng phân tử khác Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng nồng độ polymer khoảng 15 – 20% để kết tủa enzyme * Kết tủa enzyme điểm đẳng điện protein-enzyme: Protein chất lưỡng cực, chúng có nhóm acid nhóm base Mức độ hòa tan enzyme phụ thuộc vào pH, mức độ tối thiểu chúng điểm đẳng điện, phần lớn protein có điểm đẳng điện khoảng acid, trình gọi kết tủa acid Kết tủa enzyme điểm đẳng điện thường thực quy mô nhỏ, không thực quy mô công nghiệp Thời gian tạo điểm đẳng điện thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme Như thiết bị phản ứng lớn Khi đó, thời gian khuấy trộn thời gian lắng kết tủa dài, enzyme dễ bị biến tính 2.3.3 Phương pháp siêu lọc Phương pháp siêu lọc phương pháp sử dụng màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ Phương pháp ứng dụng nhiều nhiều lĩnh vực khác Phương pháp tách vật chất màng siêu lọc có ba loại là: lọc dịng chảy cắt ngang, siêu lọc, thẩm thấu ngược Trong phương pháp trên, phương pháp lọc dòng chảy cắt ngang để thu nhận sinh khối vi khuẩn, tách vi khuẩn khỏi dung dịch enzyme Phương pháp thẩm thấu ngược dùng để thu nhận chất có khối lượng phân tử thấp có khả hịa tan Trong đó, siêu lọc lại sử dụng rộng rãi để thu nhận enzyme, siêu lọc giúp ta thu nhận chất có khối lượng phân tử khoảng1.000 – 300.000 dalton Người ta sử dụng cellulose acetate loại polymer hữu poly sulfone, poly-vinylidene poly propylene làm nguyên liệu màng lọc Trừ cellulose acetate ra, loại nguyên liệu màng lọc khác kể rửa kiềm, acid nóng Ngồi ra, người ta tách muối dung dịch enzyme lọc thẩm tích 2.4 Phương pháp tinh enzyme 2.4.1 Phương pháp kết tinh Trong nghiên cứu sản xuất, người ta dùng dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme, dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme đòi hỏi độ tinh phải cao khó, phương pháp phổ biến 2.4.2 Phương pháp điện di Phương pháp điện di ứng dụng nhiều phịng thí nghiệm Người ta tiến hành áp dụng thử phương pháp theo quy mô công nghiệp chưa phát triển rộng rãi 2.4.3 Phương pháp sắc ký * Phương pháp sắc ký lọc gel Theo phương pháp này, loại gel nạp vào cột dùng để tách enzyme Các loại gel sử dụng rộng rãi phương pháp sắc ký cột là: polycryamide, ararose, vinyl polymer, dextran …Trong lọc gel, phân tử tách dựa theo kích thước hình dáng chúng * Sắc ký trao đổi ion Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa tích điện phân tử protein Phương pháp trao đỏi ion sử dụng rộng rãi sản xuất enzyme theo quy mơ cơng nghiệp Tính chất tích điện protein chịu ảnh hưởng nhiều giá trị pH Từ đó, người ta chọn chất trao đổi anion hay cation * Sắc ký kỵ nước Phương pháp dựa tương tác vùng kỵ nước phân tử protein với nhóm kỵ nước chất nền, hấp thụ xảy nồng độ muối cao ... giai đoạn phá vỡ tế bào Phần lớn enzyme ngoại bào (exoenzyme) enzyme hòa tan Như tiến hành ly tâm, dung dịch tách khỏi thành phần rắn dung dịch enzyme thô, dung dịch enzyme thơ cịn chứa thành phần... dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều Để xử lý khối lớn dung dịch enzyme phải tốn nhiều cơng sức chi phí cho xử lý cao Mặt khác lượng enzyme có dịch enzyme thơ q ít, hoạt tính enzyme. .. phải đặc dung dịch enzyme nhằm số mục đích sau: - Làm tăng hoạt tính enzyme khối lượng dung dịch enzyme - Làm giảm chi phí cơng sức cho việc xử lý sau - Tăng khả bảo quản enzyme - Giảm chi phí