TÁCH CHIẾT RNAVIRUS SARS-CoV-2ThS.BSNT.Lê Vũ Huyền Trang

TRUNG TÂM KIỂM CHUẨN CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM Y HỌC - TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TÁCH CHIẾT RNA VIRUS SARS-CoV-2 ThS.BSNT.Lê Vũ Huyền Trang www.qcc.edu.vn www.qcc.edu.vn MỤC TIÊU Trình bày nguyên lý chung tách chiết RNA Trình bày số phương pháp tách chiết RNA virus SARS-CoV-2 sử dụng phổ biến BỆNH COVID 19  COVID 19 bệnh truyền nhiễm virus SARS-CoV-2 (Betacoronavirus) gây https://covid19.who.int/ https://ncov.moh.gov.vn/ www.qcc.edu.vn TỔNG QUAN VỀ VIRUS SARS-COV-2 Cấu trúc coronaviruses SARS - beginning to understand a new virus, Nature Reviews Microbiology (2003) Các gen đích cho phản ứng RTPCR Understanding cycle threshold (Ct) in SARSCoV-2 RT-PCR, Public Health England (2020) www.qcc.edu.vn ĐƯỜNG LÂY NHIỄM Đường kính ≤5um, di chuyển >1m Đường kính >5um, di chuyển ≤1m CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM SARS-COV-2 Nuôi cấy virus: •- Phát virus sống - Nghiên cứu - Phịng ATSH cấp III Giải trình tự gen: - Xác định trình tự gen virus - Nghiên cứu, giám sát mặt virus học, phát biến thể virus Các PP XN SARS-CoV-2 CV 5288/BYT-TB-CT 2/7/21 XN khuếch đại acid nucleic (Real time RT-PCR, PCR-LAMP) - Phát RNA virus SARS-CoV-2 QĐ 4042/QĐ-BYT: 21/9/2020 - TH bệnh xác định: (+) với SARS-CoV-2 kỹ thuật Realtime RT-PCR QĐ 2008/QĐ-BYT 26/4/2021 XN miễn dịch - Phát kháng nguyên virus QĐ 2022/QĐ-BYT: 28/4/2021 - Phát kháng thể kháng virus (Hiện KAD cho sàng lọc chẩn đoán) www.qcc.edu.vn XÉT NGHIỆM Realtime RT-PCR MẪU BỆNH PHẨM Yêu cầu mẫu bệnh phẩm: ❖ Tối thiểu 01 mẫu BP đường hô hấp ❖ BP đường hô hấp trên: ▪ ▪ Mẫu dịch tỵ hầu Mẫu dịch ngoáy họng, dịch rửa mũi… ❖ BP đường hô hấp dưới: đờm, dịch rửa phế quản, dịch màng phổi, tổ chức phổi… Nguồn: Quyết định 3468/QĐ-BYT ban hành ngày 07/8/2020 BẢO QUẢN VÀ VẬN CHUYỂN MẪU ❖ Bảo quản: ▪ ▪ ▪ Bảo quản 2-8oC vòng 48h Bảo quản -70oC lưu mẫu >48h Không bảo quản ngăn đá tủ lạnh -20oC ❖ Vận chuyển: ▪ ▪ Đóng gói mẫu theo nguyên tắc lớp (chất lây nhiễm loại B theo thông tư 40/2018/TT BYT) Đảm bảo điều kiện nhiệt độ vận chuyển điều kiện bảo quản mẫu Nguồn: Quyết định 3468/QĐ-BYT ban hành ngày 07/8/2020 www.qcc.edu.vn XÉT NGHIỆM Realtime RT-PCR Mục đích: thu sản phẩm RNA - Nguyên vẹn - Tinh www.qcc.edu.vn BƯỚC LY GIẢI TẾ BÀO SDS: Sodium dodecyl sulfat DTT: dithiothreitol Proteinase K Các mảnh ly giải Bào tương Màng tế bào Màng tế bào bị ly giải www.qcc.edu.vn BƯỚC LOẠI BỎ CÁC TẠP CHẤT ❖ Tạp chất: protein, lipid, carbohydrat, RNase, hố chất tách… ❖ Có nhiều phương pháp sử dụng để loại bỏ tạp chất ❖ phương pháp sử dụng phổ biến: ▪ ▪ ▪ PP sử dụng hoá chất hữu (Organic extraction) PP sử dụng cột Silica (Column) PP sử dụng hạt từ (Magnetic beads) www.qcc.edu.vn BƯỚC HOÀ TAN RNA ❖ Hoà tan RNA nước free nuclease ❖ Không trộn máy votex ❖ Nên chạy Realtime RT-PCR sau tách chiết ❖ Bảo quản RNA: ▪ ▪ ▪ Bảo quản 2-8oC thời gian ngắn Bảo quản từ -70oC thấp Tránh đông lạnh rã đơng mẫu nhiều lần PP SỬ DỤNG HỐ CHẤT HỮU CƠ ❖ Nguyên tắc: sử dụng hoá chất hữu lực ly tâm để tạo hỗn dịch có pha ❖ Hố chất: ▪ ▪ ▪ Guanidine thiocyanate Phenol Chloroform Pha nước (RNA) Pha hữu (protein, màng) PP SỬ DỤNG HOÁ CHẤT HỮU CƠ Chuyển sang ống 1.5 mL Mẫu Chất ly giải TB: Ủ PK, SDS, guanidine… Vortex mẫu A simple RNA preparation method for SARS-CoV-2 detection by RTqPCR, Scientific Reports (2020) PP SỬ DỤNG HOÁ CHẤT HỮU CƠ + Phenol + Chloroform Thu dịch Ly tâm Ethanol/ Isopropanol (tuyệt đối) Ủ A simple RNA preparation method for SARS-CoV-2 detection by RTqPCR, Scientific Reports (2020) PP SỬ DỤNG HOÁ CHẤT HỮU CƠ Ly tâm Ly tâm A simple RNA preparation method for SARS-CoV-2 detection by RTqPCR, Scientific Reports (2020) PP SỬ DỤNG CỘT SILICA ❖ Nguyên tắc hoạt động: ▪ ▪ Cột silica Các muối chaotropic (guanidine thiocyanate) RNA Cột Silica Sự gắn RNA lên màng Silica Prakash S Bisen (2014), Laboratory Protocols in Applied Life Sciences PP SỬ DỤNG CỘT SILICA https://eng.bioneer.com/20-k-3033m.html PP SỬ DỤNG CỘT SILICA https://eng.bioneer.com/20-k-3033m.html PP SỬ DỤNG HẠT TỪ https://us.bioneer.com/page/w/covid-19/extraction_cust_option PP SỬ DỤNG HẠT TỪ https://www.youtube.com/watch?v=deVufNDJ4GI www.qcc.edu.vn SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP PP sử dụng hoá chất hữu Nguyên lý Sử dụng hoá chất hữu tạo hỗn dịch pha để loại bỏ tạp chất Trung bình Độ tinh Nồng độ Cao RNA - Tách chiết hiệu quả, áp dụng cho mẫu khó Ưu điểm - Chi phí thấp Nhược điểm - Độc hại - Thời gian lâu - Cần máy ly tâm, khó tự động hố - Quy trình thủ cơng PP sử dụng cột PP sử dụng hạt từ Sử dụng cột Silica thuốc thử tối ưu để phân lập RNA thông qua ly tâm Cao Sử dụng hạt từ thuốc thử tối ưu để phân lập RNA Cao Trung bình Trung bình - Có thể xử lý nhiều loại mẫu thể tích - Nhanh, dễ sử dụng - Khơng cần máy ly tâm - Có thể tự động hố, suất cao - Nhanh - Có nguy tắc cột - Cần máy ly tâm, khó tự động hố - Quy trình thủ cơng - Chi phí cao RNA reference guide Sample preparation and purification solutions, Thermo Fisher Scientific www.qcc.edu.vn XÉT NGHIỆM Realtime RT-PCR TRUNG TÂM KIỂM CHUẨN CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM Y HỌC - TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI www.qcc.edu.vn ...www.qcc.edu.vn MỤC TIÊU Trình bày nguyên lý chung tách chiết RNA Trình bày số phương pháp tách chiết RNA virus SARS-CoV-2 sử dụng phổ biến BỆNH COVID 19  COVID 19 bệnh... Tinh TRANG THIẾT BỊ THIẾT YẾU CHO XÉT NGHIỆM Realtime RT-PCR TRANG THIẾT BỊ THIẾT YẾU CHO XÉT NGHIỆM Realtime RT-PCR Bộ pipet Đồng hồ bấm Máy ly tâm Máy trộn lắc Máy Realtime PCR Máy tách chiết. .. Máy ly tâm Máy trộn lắc Máy Realtime PCR Máy tách chiết tự động Tủ lạnh NGUYÊN LÝ TÁCH CHIẾT RNA ❖ Nguyên lý: Tách chiết RNA trình sử dụng biện pháp vật lý, hoá học hay sinh học để xử lý mẫu bệnh