Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên cây Cam Hàm Yên Tuyên Quang và tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chúng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http //www ltc tnu edu vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐÀO ÁNH VÂN NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY CAM HÀM YÊN - TUYÊN QUANG VÀ TIỀM NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG NẤM CỦA CHÚNG LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã ngành :60 42 01 03 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS PHAN THỊ HỒNG THẢO Hà Nội - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan là công trình nghiên cứu của riêng Các số liệu, kế t nêu Luận văn là trung thực và chưa từng công bố bất kỳ công trình nào khác Tôi xin cam đoan rằ ng mo ̣i sự giúp đỡ cho việc thực Luận văn này đã đươ ̣c cảm ơn và các thông tin trić h dẫn Luận văn đã đươ ̣c chỉ rõ nguồ n gố c Hà Nội, Ngày 25 tháng 11 năm 2015 Học viên Đào Ánh Vân Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Phan Thị Hồng Thảo – Trưởng phịng Vi sinh vật Đất, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam người truyền thụ cho kiến thức chuyên ngành, hướng dẫn, định hướng nghiên cứu và tận tình giúp đỡ tơitrong śt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giúp đỡ và bảo tơi quá trình học tập Xin chân thành cảm ơn các cán Phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi śt quá trình thực đề tài này Tơi xin cám ơn sự hỗ trợ kính phí thực từ đề tài “Nghiên cứu sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh có múi đặc sản miền Bắc Việt Nam và tiềm sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn và kích thích tăng trưởng thực vật chúng” Mã số đề tài: VAST.ĐLT.12/15-16 thuộc cấp quản lý Viện Hàn lâm KHCNVN vàPhịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện và cung cấp các thiết bị để tơi tham gia thực đề tài Ći cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn tới gia đình và bạn bè, người ln quan tâm giúp đỡ và động viên tơi để có thành ngày hôm Hà Nội, Ngày 25 tháng 11 năm 2015 Học viên Đào Ánh Vân Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Tên viết tắt Tên đủ CFU Đơn vị hình thành khuẩn lạc DNA Deoxyribosenucleoic Acid EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid HTKS Hoạt tính kháng sinh ISP Internationl Streptomyces Project KTCC Khuẩn ty chất KTKK Khuẩn ty khí sinh PCR Polymerase Chain Reaction: Phản ứng khuếch đại gen rDNA Ribosomal Deoxyribosenucleoic Acid 10 RNA Ribonucleic acid 11 rRNA Ribosomal Ribonucleic acid 12 SDS Sodium dodecyl sulfate 13 TAE Tris-acetat EDTA 14 VSV Vi sinh vật Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Tên bảng Tổng hợp số nghiên cứu giới các loài xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật Kết phân lập xạ khuẩn nội sinh từ mẫu rễ Cam Hàm Yên Tuyên Quang số môi trường khác Tỷ lệ các xạ khuẩn phân lập chia theo đa dạng nhóm màu Khả kháng vi sinh vật kiểm định các chủng xạ khuẩn Số lượng các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập có khả đới kháng với các chủng nấm và vi khuẩn kiểm tra Kết kiểm tra hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn lựa chọn nuôi cấy môi trường dịch thể ISP2 sau ngày Đặc điểm nuôi cấy xạ khuẩn nội sinh C12 và R12-4 các môi trường ISP Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn tuyển chọn sau 14 Trang 13 27 30 30 31 32 33 36 ngày nuôi cấy nhiệt độ 30C Ảnh hưởng nồng độ NaCl môi trường ban đầu đến khả sinh trưởng và phát triển chủng xạ khuẩn tuyển chọn Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn tuyển chọn 37 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ ban đầu đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn tuyển chọn 3.11 khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào các chủng xạ khuẩn 3.12 So sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA chủng R12-4 với gen tương ứng các chủng xạ khuẩn đăng ký GenBank 3.13 Mơi trường thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm hai chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 3.14 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi đến sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm 3.15 Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm hai chủng xạ khuẩn lựa chọn 37 3.16 Lựa chọn dung môi để chiết hoạt chất kháng nấm từ dịch lên men và sinh khối 3.17 Ảnh hưởng các pH chiết khác đến khả chiết chất kháng nấm 3.18 Xác định độ bền nhiệt đến hoạt tính kháng nấm chủng R12-4 42 3.8 3.9 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn 37 38 39 40 41 41 43 44 Hình 3.1 3.2 3.3 3.4 Tên hình Hình ảnh minh họa kết phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh số môi trường sau tuần nuôi cấy Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân lập theo phận Cam Hàm Yên – Tuyên Quang Khả đối kháng số chủng xạ khuẩn phân lập với nấm Xạ khuẩn C12 và R12-4 đối kháng với nấm 3.9 Khuẩn lạc xạ khuẩn C12 các môi trường ISP Khuẩn lạc xạ khuẩn R12-4 các môi trường ISP Cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử và hình da ̣ng bào tử xạ khuẩn nội sinh C12 Cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử và hình da ̣ng bào tử xạ khuẩn nội sinh R12-4 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn R12-4 và C12 3.10 sau 14 ngày nuôi cấy nhiệt độ 28C Điện di đồ DNA tổng số hai chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 gel 3.5 3.6 3.7 3.8 3.11 3.12 agarose 1,0 % Điện di đồ sản phẩm PCR chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 với cặp mồi sử dụng 27F và 1492R gel agarose 1,0% Mức độ tương đồng di truyền chủng Streptomyces angustmyceticus C12 với các loài xạ khuẩn có họ hàng gần dựa vào 16S rRNA Trang 29 29 31 32 34 34 35 35 36 38 38 39 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 Độ bền chất kháng nấm với nhiệt Độ bền chất kháng nấm với pH Khả bền với pH chất kháng nấm Hoạt chất kháng nấm kháng sinh tinh Hình ảnh quang phổ hấp thu điện tử UV VIS kháng sinh tinh 44 45 45 46 46 3.18 Hình ảnh phổ hồng ngoại kháng sinh tinh 47 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn nội sinh thực vật 1.1.1 Giới thiệu chung xạ khuẩn 1.1.2 Xạ khuẩn nội sinh thực vật 1.1.3 Mối quan hệ thực vật xạ khuẩn nội sinh 1.1.4 Con đường xâm nhập vi sinh vật vào chủ 1.1.5 Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh 1.1.6 Phân loại xạ khuẩn nội sinh 10 1.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh tiềm ứng dụng xạ khuẩn nội sinh 12 1.2.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh 12 1.2.2 Tiềm ứng dụng xạ khuẩn nội sinh 15 1.3 Cây có múi khả thu nhận thể nội sinh 17 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1 Vật liệu 20 2.1.1 Mẫu 20 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định: 20 2.1.3 Hóa chất thiết bị 20 2.1.4 Môi trường nghiên cứu 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phân lập chủng xạ khuẩn nội sinh từ mô sống mẫu thực vật 22 2.2.2 Đánh giá khả đối kháng xạ khuẩn 22 2.2.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học xạ khuẩn 23 2.2.4 Phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA 24 2.2.5.Phương pháp tách chiết tinh kháng sinh 24 2.2.6 Phương pháp xác định số tính chất chất kháng nấm kháng khuẩn 26 Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Phân lập sàng lọc chủng xạ khuẩn nội sinh có khả sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm Cam Hàm Yên – Tuyên Quang 27 3.1.1 Kết phân lập chủng xạ khuẩn nội sinh cam Hàm Yên – Tuyên Quang 27 3.1.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn nội sinh có khả sinh chất kháng nấm, kháng khuẩn 30 3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học hai chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn 32 3.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý đặc điểm nuôi cấy chủng xạ khuẩn lựa chọn 32 3.2.2 Đặc điểm sinh học hai chủng xạ khuẩn lựa chọn 35 3.3 Nghiên cứu môi trƣờng điều kiện sinh tổng hợp chất kháng nấm hai chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn 40 3.3.1 Lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm 40 3.4 Nghiên cứu số tính chất hoá lý hoạt chất kháng nấm thu nhận từ chủng R12-4 42 3.4.1 Tách chiết chất kháng nấm 42 3.4.2 Khả bền nhiệt chất kháng sinh 43 3.4.3 Khả bền với pH chất kháng nấm 45 3.4.4 Tinh thu nhận chất kháng sinh 46 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 KẾT LUẬN 48 KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 53 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân MỞ ĐẦU Cây có múi là tên gọi chung nhóm cam, chanh, quýt, bưởi họ Rutaceae Cây ăn trái có múi trồng 100 q́c gia Đây là loại có tầm quan trọng hàng đầu giới, với sản lượng năm 2009 đạt 120 triệu tấn, cam chiếm 54% [15, 42, 46], bao gồm Việt Nam, vùng cam tiếng Hàm Yên - Tuyên Quang hiệu kinh tế thu khá cao Tuy nhiên, việc trồng có múi phải đối mặt với số vấn đề là tăng trưởng chậm, côn trùng, sâu bệnh [41].Bên cạnh đó, sự phát triển nhanh chóng các vùng trồng và sử dụng lượng hóa chất nơng nghiệp thiếu kiểm soát nước dẫn đến tác động tiêu cực sản xuất, môi trường, chất lượng đất, sức khỏe người, vật nuôi và ngày càng nhiều vi sinh vật gây bệnh có khả kháng các loại th́c bảo vệ thực vật thơng dụng Vì vậy, việc tìm kiếm và ứng dụng các vi sinh vật để kiểm soát sinh học, kích thích tăng trưởng thực vật là phương pháp thay để giảm sử dụng hoá chất nông nghiệp Trong số các loài vi sinh vật, xạ khuẩn có vị trí quan trọng sự đa dạng cao, khả sinh tổng hợp nhiều chất có hoạt tính sinh học enzym, chất kích thích sinh trưởng thực vật, thuốc kháng sinh dùng nông nghiệp và y học Đặc biệt là các loài xạ khuẩn nội sinh mô thực vật sống (lá, cành, rễ) Các loài xạ khuẩn sống nội sinh thực vật có khả tích hợp với chủ và sinh tổng hợp sớ chất chuyển hóa thứ cấp có lợi cho chủ Đó là hệ sinh thái đặc biệt và khó tiếp cận, nơi mà xạ khuẩn nội sinh có vai trị quan trọng sự phát triển chủ, chúng ảnh hưởng đến sinh trưởng đường đồng hóa các chất dinh dưỡng, kích hoạt hệ thống miễn dịch và sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp, giúp chủ hạn chế bệnh và kích thích sinh trưởng cho cây[22, 23] Trong mới quan hệ tương hỗ với chủ, vi sinh vật nội sinh nhận từ chủ các chất dinh dưỡng để sinh trưởng Đến nay, có nhiều nghiên cứu công bố khả sản sinh các chất thứ cấp tiêu diệt nhiều loài nấm bệnh và sinh tổng hợp các kháng sinh munumbicin, kakadumycin và coronamycin các loài xạ khuẩn nội sinh Như vậy, xạ khuẩn nội sinh thực sự là ứng cử viên tiềm kiểm soát sinh học cho tương lai Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh cam và có múi nói chung Việt Nam cịn hạn chế Xuất phát từ lí trên, chúng tơi thực nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh Cam Hàm Yên- Tuyên Quang tiềm sinh tổng hợp chất kháng nấm chúng” Mục tiêu đề tài: Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh Cam Hàm Yên Tuyên Quang có tiềm sinh tổng hợp chất kháng nấm cao Nội dung nghiên cứu đề tài: Phân lậpcác chủng xạ khuẩn nội sinh rễ và cành các mẫu rễ và cành cam Hàm Yên- Tuyên Quang Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh cam Hàm Yên –Tuyên Quang có khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn và kháng nấm cao Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn Nghiên cứu môi trường và điều kiện sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm các chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn Nghiên cứu sớ tính chất hoá lý hoạt chất kháng nấm thu nhận từ xạ khuẩn R12-4 Đề tài thực phịng Vi sinh vật đất, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật ... nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh cam và có múi nói chung Việt Nam cịn hạn chế Xuất phát từ lí trên, thực nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh Cam Hàm Yên- Tuyên Quang tiềm sinh tổng. .. xạ khuẩn nội sinh cam Hàm Yên ? ?Tuyên Quang có khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn và kháng nấm cao Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn Nghiên cứu. .. tổng hợp hoạt chất kháng nấm Cam Hàm Yên – Tuyên Quang 27 3.1.1 Kết phân lập chủng xạ khuẩn nội sinh cam Hàm Yên – Tuyên Quang 27 3.1.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn nội sinh có