CHƯƠNG IV CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN 3/24/2011 1 CHƯƠNG IV CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN • “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành“ hay “Tế bào là đơn vị sống că[.]
3/24/2011 CHƯƠNG IV CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN • “Mọi thể sinh vật phức tạp gồm nhiều đơn vị nhỏ tế bào hợp thành“ hay “Tế bào đơn vị sống cấu trúc thực vật” (Schleiden Schwann, 1838) • Đến năm 1960, Melcher Bergman tác giả tách nuôi cấy thành công tế bào đơn thực vật bình lên men với mơi trường nhân tạo Ví dụ hợp chất thứ cấp Sản phẩm biến dưỡng thực vật • Sản phẩm sơ cấp: carbohydrate, acid béo, acid amine,… • Sản phẩm thứ cấp: alkaloid, nicotine, berberin, ginsenosid, palitaxel,… Sản phẩm thứ cấp giúp đáp ứng stress, phòng vệ chống vi sinh vật, trùng,… Ví dụ hợp chất thứ cấp Hợp chất ginsenosid từ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grutzv.) • • • • Hợp chất ginsenosid từ Nhân sâm (Panax ginseng): Tác dụng đến hệ thần kinh trung ương; Gia tăng sức đề kháng; Tăng cường co bóp tim Hạ đường huyết Ví dụ hợp chất thứ cấp • Đan sâm, Đảng sâm, Giác sâm, Hải quy sâm, Hồng sâm, Khổ sâm, Sa sâm, Sâm bịng bong, Sâm bố chính, Sâm chèo mèo, Sâm chiếu, Sâm đại hành, Sâm đất, Sâm lơng, Sâm nam, Sâm ớt,… • Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam (Ngũ gia bì), Sâm Vũ Diệp (Trúc tiết Nhân sâm) 3/24/2011 Ví dụ hợp chất thứ cấp • • • • • • Giới Ngành Lớp Bộ Họ Chi : : : : : : Ví dụ hợp chất thứ cấp Saponin: • Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều lắc với nước, có tác dụng nhũ hóa tẩy • Làm vỡ hồng cầu nồng độ lỗng • Độc với cá động vật máu lạnh; có tác dụng diệt lồi thân mềm giun, sán, ốc sên • Kích ứng niêm mạc, gây hắt hơi, đỏ mắt • Có thể tạo phức với cholesterol với chất 3-ß-hydroxysteroid khác Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Apiales Araliaceae Panax Ví dụ hợp chất thứ cấp Ví dụ hợp chất thứ cấp • Saponin steroid phân bố hẹp, tìm thấy lồi mầm hai mầm: Araliaceae, Agavaceae, Smilacaceae, • Trong cây, saponin thường tích lũy phận khác nhau: tích lũy bồ kết, bồ hịn; tích lũy rễ cam thảo, viễn chí, cát cánh; tích lũy dứa Mỹ,… Hàm lượng thường cao có số trường hợp lên đến 10 % Vật liệu thực vật Hàm lượng Tốc độ sinh tổng paclitaxel TB hợp đặc biệt (% trọng lượng khô) Vỏ trưởng thành (100 năm tuổi) 4.70 x 10-6 mg/g/day 0.017 Cây (4 năm tuổi) 0.34 x 10-6 mg/g/day 0.005 Nuôi cấy mô 0.64 mg/l/day 0.200 Taxomyces andreanae 10-6 400 x mg/l/day Hợp chất taxol từ Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.): Tế bào thực vật ni cấy hệ thống thích hợp để sản xuất hợp chất thứ cấp với sản lượng cao nguyên vẹn - 3/24/2011 Quá trình ni cấy Những hợp chất tạo công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật để sử dụng làm thuốc bao gồm: diosgenin, codeine, morphine, atropine, hyoscyamine, scopolamine, digoxin, digitoxin, quinine, reserpine, artemisinin Điểm khác biệt nuôi cấy tế bào đơn thực vật VSV • • • • • Mức độ vơ trùng Tồn dạng huyền phù Tốc độ phân chia sinh khối Phương thức sinh dưỡng Các chất tạo trình trao đổi chất Ưu điểm • Điều kiện ni cấy kiểm sốt tối ưu cho việc sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp • Tế bào chọn lọc cải thiện cách nhân dịng, gây đột biến biệt hóa dùng phương pháp hóa học phương pháp sinh học • Có thể dễ dàng nghiên cứu chuyển hóa chất tế bào chế sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Đặc điểm sinh lý tế bào đơn ni cấy • Ngun liệu để ni cấy tế bào đơn môi trường lỏng tế bào mơ sẹo • Trong q trình phát triển môi trường lỏng, tế bào đơn thực vật thường phát triển qua bốn giai đoạn: thích nghi, tăng trưởng, cân suy tàn Đặc điểm sinh lý tế bào đơn ni cấy • • • • • • • Tế bào đơn phát triển thành dịng tế bào có đặc tính sau: Tách riêng tế bào dễ dàng; Các tế bào có độ đồng cao; Tế bào có nhân to, nguyên sinh chất đậm đặc Có chứa nhiều hạt tinh bột; Có khả phân chia khoảng 24-72h; Bị tính tồn thế; Bị tăng mức bội thể 3/24/2011 Những yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy tế bào đơn Công nghệ nuôi cấy tế bào đơn thu nhận sản phẩm thứ cấp • Các chất điều hịa sinh trưởng: làm tăng q trình phân bào, kích thích q trình biệt hóa, tạo sản phẩm thứ cấp,… • Các nguồn dinh dưỡng: đạm, nguồn carbon, vi lượng, ánh sáng,… Điểm cần lưu ý • Khơng nên ni cấy tế bào đơn cách đại trà mà khơng tính toán đến khả tạo sản phẩm đặc biệt lồi thực vật • Khơng phải tất quan có khả tạo chất mà ta quan tâm • Trong q trình ni cấy, luôn phải tiến hành tuyển chọn để nâng cao suất tạo sản phẩm bậc • Bổ sung chất tương ứng • Tìm môi trường đặc hiệu cho loại tế bào Phương pháp làm tăng sản lượng • • • • • • • • Điều kiện mơi trường thích hợp Chọn lựa chủng có suất cao Biến đổi tiền chất Xử lý với chất cảm ứng Cố định tế bào Tiết sản phẩm môi trường Gây đột biến tế bào Phát sinh hình thái Điều kiện mơi trường thích hợp • Thành phần chất mơi trường ni cấy, chất điều hịa sinh trưởng thực vật, pH, nhiệt độ, độ thơng khí, độ lay chuyển, ánh sáng,… • Auxin thường bổ sung vào môi trường để cảm ứng tạo mơ sẹo, giữ lại với hàm lượng thấp loại bỏ hẳn để tế bào sản xuất chất biến dưỡng Mô sẹo của Oxalis reclinata ánh sáng có màu vàng, chuyển sang điều kiện tối thì có màu đỏ vì chúng bắt đầu sản xuất sắc tố anthocyanin có màu đỏ 3/24/2011 Lựa chọn chủng có khả sản xuất cao • Các đặc tính sinh lý tế bào riêng lẻ khơng ln thống với • Việc chọn dịng tế bào kỹ thuật hữu hiệu để tăng lượng sản phẩm thứ cấp nên áp dụng phương pháp rộng rãi Biến đổi tiền chất biến đổi sinh học • Việc bổ sung vào mơi trường ni cấy tiền chất thích hợp hợp chất có liên quan đơi kích thích sản xuất hợp chất thứ cấp • Thay bổ sung hợp chất đặc biệt tiền chất vào môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, người ta cịn sử dụng tế bào thực vật ni cấy để biến đổi chất thích hợp thành sản phẩm mong muốn Xử lý với chất cảm ứng (elicitor) Ví dụ về biến đổi sinh học nuôi cấy tế bào: Coniferin bổ sung vào huyền phù tế bào Podophyllum hexandrum và podophyllotoxin tạo Podophyllotoxin sử dụng để sản xuất thuốc trị ung thư • Khi vi sinh vật xâm nhiễm vào thực vật nguyên vẹn thường cảm ứng tạo hợp chất thứ cấp • Tác động kích thích chúng đáng kể chất cảm ứng thích hợp chọn lựa để kích thích tổng hợp hợp chất thứ cấp Elicitor -> Elicitor recognition -> Enzyme synthesis -> Phytoalexin synthesis 3/24/2011 Elicitor Loài TV Sản phẩm Phytophthora megasperma Glycine max Soybean Glycollin Fungal homogenate Ruta gravolens Acridone exposides Phytium aphanidermatum Catharanthus roseus Periwinkle Strictosidine lactam Ajmaciline Tabersonine Lochnericine Catharanthine Botrytis Colletotrichum Verticillium Altenaria Arachidonic acid Chitosan Nigram Papaver somniferum Opium poppy Sanguinarine Tiết sản phẩm mơi trường • Có thể làm tăng khả sản xuất hợp chất thứ cấp cách kích thích cho chúng tiết ngồi mơi trường • Để làm tăng tiết sản phẩm môi trường, người ta cố gắng làm tăng tính thấm màng tế bào kết đạt hạn chế Cố định tế bào • • • • • Một hệ thống cố định trì sống tế bào qua khoảng thời gian dài phóng thích phần lớn sản phẩm môi trường ngoại bào dạng ổn định: Sự cố định thường bị hạn chế Sinh khối ban đầu phải nuôi cấy dạng huyền phù tế bào Sản phẩm bắt buộc tiết môi trường Sản phẩm bị thoái biến Ngăn cản khuếch tán tế bào Gây đột biến tế bào • Các dạng đột biến điều hòa đột biến khuyết dưỡng sử dụng rộng rãi để sản xuất nhiều loại sản phẩm amino acid, nucleotide, kháng sinh,… • Sự gia tăng hoạt động biến dưỡng cách sử dụng đột biến điều hịa thực mặt lý thuyết việc chọn lọc kiểu tế bào đồng dạng cho mục đích yếu tố quan trọng để sản xuất loại sản phẩm khác Phát sinh hình thái • Có mối quan hệ phản phân hóa tế bào với khả sản xuất hợp chất thứ cấp chưa rõ sản xuất hợp chất thứ cấp có phụ thuộc vào phát triển cấu trúc chuyên biệt hay khơng hay q trình có liên quan với đặc tính di truyền đặc tính sinh lý? • Ni cấy lơng rễ (chuyển plasmid Ri vào vết thương mô)