Nghiên cứu áp dụng công nghệ nuôi cây tế bào 3d in vitro tạo mô hình tuyển chọn các chất ức chế tăng sinh mạch máu và kháng u từ dược liệu việt nam

Đ Ạ I H Ọ C Q U Ó C G IA H À N Ộ I T R Ư Ờ N G Đ Ạ• I H Ọ• C K H O A H Ọ• C T Ụ• N H I Ê N B Á O C Á O T Ỏ N G K É T Đ Đ )c tà i: N g h iê n c ứ u p d ụ n g c ô n g n g h ệ n u ô i c ấ y tế b o D in v itr o tạ o m h ìn h tu y ể n c h ọ n c c c h ấ t ứ c c h ế s ự tă n g s in h m c h m u v k h n g u t d ợm c l i ệm u V i ệm t N a m Mã số: Q G T Đ 10.28 c c :h ủ t r ì : T S H o n g T h ị M ỹ N h u n g P G S T S N g u y ễ n T h ị Q u ỳ CCCảc thành viên tham gia đề tài: - - T S N g u yễn L T h n h P G S T S P h a n V ă n K iệ m T S T r ị n h T h ị Đ iệ p T h S Bùi T hị V ân K h án h C N N g u yễn Đ ắ c T ú Hà N ộ i - 2 TÓM TẢT Đ È T À I N G H IÊ N c u K H O A H Ọ C A T ên đề tài Nghiên cứu áp (lụng công nghệ ni cấy tế bào 3D in vitro tạo mơ hình tuyến chọn chất ức chế sụ tăng sinh mạch máu kluíng u tù dược liệu Việt Nam M ã số: Q G T Đ 10.28 B C h ủ trì đề tài: T S 1iồng T h ị M ỹ Nhung PG S.TS.N g uyễn Thị Quỳ c C n tham gia: T S Nguyễn L a i Thành; P G S T S Phan Văn K iệ m ; T S Trịnh T h ị Điệp; Th S Bùi I hị Ván Khánh; CN Nguyễn Đấc Tú D M ục tiêu nội d u n g nghiên cứu: • M ục tiêu: • Mục tiêu chung: Tạo mơ hình ung thư in vitro dạng khối cầu 3D thử tác dụne kháng u chống tăng sinh mạch máu chất từ nguồn dược liệu Việt nam • Mục tiêu cụ thể: X ây dựng quy trình k ĩ thuật ni cay in vitro tạo mơ hình (3D 3D đồng ni cấy) Phân tích, tách chiết, tuyển chọn chế phẩm định hướng có tác dụng kháng u ức chế tăng sinh mạch máu Nghiên cứu đánh giá tác dụng kháng u ức chế tăng sinh mạch máu số chất chiết từ nguồn dược liệu Việt Nam mơ hình 3D 3D đồng ni cấy ♦> Nội dung nghiên cứu: Nội dung nghiên cứu / : X â y dựng mơ hình 3D sổ dỏnti tế hào ung thư phôi ung thư vú Phần nội dung nghiên cửu nham xây dựng mơ hình ni cấy tế bào dạng khối cầu (3 D ) Đây dạng nuôi cấy mô phong lại cấu trúc tự nhiên mô, cư quan thể dỏ việc thử nghiệm, đánh giá loại thuốc xác, gần với thực tể so với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp (2 D ) K ỳ thuật nuôi cấy dã dược số phịng thí nghiệm tiên tiến giới thử nghiệm thuốc áp dụng hoạt động T u y nhiên, V iệt Nam, vấn đề mẻ Chúng tơi Iĩin đưa mơ hình vào hoạt dộng đánh giá, sàng lọc thuốc chống ung thư vói hy vụng sản phầin có hoạt tính thu nhanh chóna dược đưa vào áp dụng Nội dung nghiên cứu 2: X ây dựng mơ hình 3D đồng ni cấy Sau tạo dược khối cầu da bào ung thư từ dịng ung thư phổi ung thư VÍ1 tiến hành đône nuôi cấy với tế bào nội mơ mạch máu dây rốn người làm mơ hình 3D đồng nuôi cấy đè thử tác dụng ức chế tăng sinh mạch máu chế phẩm Nội (lung nghiên cứu 3: Tách chiết chế phẩm định lurớnu có tác dụng kháng u ức chế tăng sinh mạch máu từ thảo dược Việt Nam Các chế phấm dịnli hướng nhĩrne chế phàm tách chiết từ thực vật sinh vật biên Viện Dược liệu Viện I lóa học Ilựp chât thiên nhiên cung câp Chúng dã tiến hàng thư sàng lọc mơ hình 21 ) sỏ chê phàm bước dâu cho kết khả quan Dây kết tiền đề đe chúng tơi tiếp tục thứ nghiệm mị hình 3D Chúng tỏi tiếp tục thử nghiệm chế phàm khác hai Viện nghiên cứu cung cấp Nội (lung nghiên cừu 4: Nghiên cứu sử dụng mơ hình 3D dê đánh giá sàng lọc tuyển chọn chất chiết tự nhiên có khả kháng u tháo dược Việt Nam Nội (lung nghiên cứu 5: Nghiên cứu sử dụng mơ hình 3D đồng ni cấv khối càu da bào ung thư với tế bào nội mô tĩnh mạch cuống rốn để đánh giá sàng lọc tuyển chọn chất có tác dụng ức chế tăng sinh mạch máu từ chất chiết tự nhiên thảo dược V iệt Nam E K ết đạt đưọc: ❖ K ết q u ả k h o a học: - Dã gây tạo thành côim khối cầu đa bào unu thư từ dòna tế bào M C F7 , H460 R D H C T 16, H T29 H358 - Đã xây dựng quy trình ni cấy khối cầu da bào dịng tế bào ung thư vú M C F7 - Đã xây dựng dược quy trình đồng ni cấy tế bào ung thư dạng khối cầu đa bào dòng tế bào ung thư vú M C F7 với tế bào nội mô mạch máu dây rốn h U V E C - Danh mục 10 chất chiết tự nhiên định hướng có khả năna kháng u ức chế tăng sinh mạch máu - Đã xác định dirợc 02 chất tự nhiên có khả kháng ung thư mơ hình ni cấy 3D Đó meso-dihydroguaiaretic acid chiết từ hạt nhục dậu khấu Myristica fragrans thuộc họ nhục đậu khấu (M yristicaceae) Honokioltừ vỏ Hậu phác Magnolia officinalis Rehd Et w ils (Magnoliaceae) - Đã thử xác dinh dược hoạt tính ức chế tăng sinh mạch máu Curcumin cureumin bọc P L A -P E G kích cỡ nanomettrên mơ hình dồng ni cấy khối cầu da bào ung thir dòng M C F7 với tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn •> Kef q u ả c ô n g bố: Tiếng A n h : bài: hài dăng tạp chí trone nước, hài báo cáo (poster) Hội nghị Quốc tế hài gửi đăng tạp chí nước ngồi Dac Tu N G U Y E N Phuong Thu H A , Phan Anh T R A N , Hoai Nam N G U Y E N , Thi Quy N G U Y E N , Xuan Phuc N G Ư Y E R Nhung Th i My H O A N G 2012 Paclitaxel - combined curcumin - loaded P L A - T P G S - based nanoparticles inhibite m ulticellular tumor spheroid growth o f breast cancer cells Acta Biom aterials (gửi đăng) I ran Nhat A nil Neuyen I hi Quy, Hoang 1hi My Nhung 2011 Establishment o f ex vivo anaiogenesis model from rat (Rattus norvegicus) aortic rings V N IJ Journal o f Science Natural Sciences and technology 27 No 2S (2011) 1281 37 Nguyen L a i Thanh Dang Van Due, Bui V iet A nil Le Dai, Hoang Ngoc M Iran Due IMuic, Hoang Thi M y Nhung 2011 Simultaneous isolation o f mesenchymal stem cells and endothelial cells from the human umbilical cord vein V N U Journal o f Science, Natural Sciences and techonology 27, No.2S (2011) 262-271 Tran Phan A nh L e Th i [ buy Duong, Nguyen Hoai Nam, Ha Phuong Thu, Nguyen Đac Ỉ U Nguyen T h i Quy Quven Đinh Th i Hoàne Thị Mv Nhung 2012 Effect o f paclitaxel and curcumin - loaded P L A - T P G S - based nanoparticles on cancer cells Consrès Mekong Santé - 10-12 mai 2012, (Poster presentation) Tiến g V iệ t: bài dăim tạp chí báo cáo toàn văn Hội nghị nước Nguyễn Đắc T ú , Nguyễn T h ị Chinh Nguyễn T h ị Q uỳ, Hoàng Th ị Mỹ Nhung 2012 Tạo mơ hình khối cầu đa bào ung thư dòng M CF-7 để sàng lọc thuốc chống ung thư Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 50 (3 C ) 407-413 Nguyễn Đắc T ú , Hà Phương Thư, Trần Phan Anh, Nguyền Hoài Nam, Lê T h ị Tliù y Dương, Nguyễn Xuân Phúc, Nguyễn T h ị Quỳ, Hoàng T h ị Mỹ Nhung 2012 Hệ thuốc nano Paclitaxel -Curcum in bọc P L A - T P G S kích thích trình apoptosis kìm hãm phát triển khối ung thư vú ni cấy 3D Báo cáo trình bày Hội nghị Khoa học Trường Đại học Khoa học T ự nhiên Ngành Sinh học 2012 *> Kết đào tạo: • 02 ỉ hạc sỹ: STT Họ tên Khóa Tên luận văn Tình trạng Nghiên cứu khả chông uniz, thư hoạt chất phân lập từ vông nem Nguyễn T h ị Ngọc Ánh K 19 Đã bảo vệ (Ervthrina orientalìs ( L ) tháng 12 M urr., Fabaceae) năm 2012 hậu phác (Magnolia officinalis Rehd et W ils„ Magnoliaceae) Tạo mơ hình khơi câu đa Nguyễn l)ẩ c Tú K 20 bào uns thư mơ hình Dự kiến bảo tăng sinh v ệ tháng mạch máu để sàng lọc thuốc chống ung thư 10 năm 2013 STT Khóa I ỉ ọ tên KI Trần Nhật Anh Tên khóa luận Tình trạng Gây tạo mơ hình tăng sinh mạch máu từ vòng động mạch chuốt cống trang Đã bảo vệ tháng 6/2011 (Rattus norvegicus) Dương Th ị Huyền Nguyễn Th ị Hường K 55 S P K 55 S P Nghiên cứu độna học tăng trưởng khả ức chế hệ thuốc P L A -T P G S P TX -C U R khối cầu đa bào ung thư dịng H CT116 Tơi ưu điêu kiện ni trì tế bào nội mơ phân lập từ dây rốn trẻ sư sinh nuôi cay in vitro Đã bảo vệ năm tháng 6/2012 Đã bảo vệ năm tháng 6/2012 " F T ì n h h ìn h tài c h ín h : 0 0 0 0 đ Đ e tài đ u ọ c c ấ p - Chi phí cho X ây dựng đề cương chi tiết 0 0 0 đ Thu thập viết tổng quan tài liệu 0 0 0 đ Điều tra, khảo sát, thí nghiệm, thu thập số liệu, 0 0 0 đ nghiên cứu - Chi phí cho đào tạo 0 0 0 0 d Thuê, mua sắm trang thiết bị, nguycn liệu 5 0 0 0 đ Viết báo cáo khoa học, nghiệm thu 0 0 0 d Chi khác 0 0 0 d Đ ã q u y ế t to n tài c h ín h K H O A SIN H H Ọ C P&S T s PKcX/w'TuCcvv TS H oàng Thị Mỹ N h u n g t r n í; đ ại học k h o a học PCS TS Nguyễn Thị Quỳ tụ n h iê n SUM M ARY S C IE N T IF IC R E SEA R C H PR O JECT A P ro jec t Title: Application o f in vitro 3D Cell Culture Engineering for selection o f anti-angiogenesis and anti-tumor compounds derived front Vietnamese pharmacological materials Code number: Q G T D 10.28 B C o o rd in ato r Dr Hoang T h i M y Nhung and Assoc Prof Dr Nguyen I hi Quy c P a rticip an ts: Dr Nguyen Lai Thanh; Assoc Prof.D r Phan Van K iem ; Dr Trinh I hi Diep; M Sc B u i Th i Van Khanh; B S c Nguyen Dac Tu D O bjectives: Establishment in vitro m ulticcllular tumor spheroids (M T C S s ) model (3D culture system) for screening the anti-angiogenesis and anti-tumor activity o f compounds derived from Vietnamese pharmacological materials E M ain contents: • • Establishment a process o f making 3D culture system and the coculture model between m ulticellular tumor spheroids and umbilical vein endothelial cells (h U V E C s ) • isolation and selection compounds derived from Vietnamese pharmacological materials toward anti-angiogenesis and anti-tumor activity • Study the anti-angiogenesis and anti-tumor activity o f some compounds on 3D model and spheroid cocultures 3D model F Results: • S c ie n t if ic r e su lts : Establishment in v/Vromulticellular tumor spheroids (M T C S s ) from cancer cell lines: M C F7 , H 460 R D , H C T 16, H T29 H358 • A process o f making 3D culture system o f M C F7 (breast cancer cell line) • A process o f co-culture M C F7 spheroids with umbilical vein endothelial cells (h U V E C s ) • A list o f 10 natural compounds w hich have anti-cancer c e ll’ s proliferation and angiogenesis inhibitor activities • Determination o f compounds: meso-dihydroguaiaretic acid (extracted from the seed o f Myrisiica fragrans) and IIonokiol(extracted WomMagnolia officinalis Rehd Et vvils) which have anti-proliferation activity on M CF7 stable 3D culture system • Determination the angiogenesis inhibition activity o f curcumin and curcumin coated by P L A - T P G S on the co-culture M C F7 spheroid with h U V E C s model • Publications and C o n feren ces: Dac 111 Nguyen Phuong Thu H A Phan Anh T R A N , Hoai Nam N G U Y E N , Thi Quy N G U Y E N , Xuan Phuc N G U Y E N , Nhung 111! My H O A N G 2012 Paclitaxel - combined curcumin - loaded P L A - T P G S - based nanoparticles inhibit m ulticellular tumor spheroid growth o f breast cancer cells Acta Biomaterials (R e vie w 1) Iran Nhat A nh, Nguven i hi Q uy, Hoang r hi My Nhung 2011 Establishment o f ex vivo angiogenesis model from rat (Rattus norvegicus) • aortic rings V N IJ Journal o f Science Natural Sciences and technology 27, No 2S (2 1) 128-137 Nguyen I.ai Thanh, Dang Van Due, Bui Viet A nil Le Dai, Hoang Ngoc Mai ran Due Phuc Hoang T ill M y Nhung 2011 Simultaneous isolation o f mesenchymal stem cells and endothelial cells from the human umbilical cord vein V N U Journal o f Science, Natural Sciences and technology 27 No.2S (2011)262-271 ran Phan A nh, L e Th i Th uy Duong, Nguyen Hoai Nam Fla Phuong Thu, Nguyen Đac T u , Nguyen T h i Q uy, Quyen Đinh I hi Hoàng Th ị My Nhung 2012 Effect o f paclitaxel and curcumin - loaded P L A - T P G S - based ranoparticles on cancer cells Congrès Mekong Santé - 10-12 mai 2012 (Poster presentation) Nguyen Dac Tu, Ha Phuong Thu, Tran Phan Anh, Nguyen Hoai Nam, Le Thi Thuy Duong, Nguyen Xuan Phuc, Nguyen Thi Quy, Hoang Thi My Nhung 2012 P aclitaxel - com bined curcum in - loaded P LA -T P G S - based ranoparticles induce apoptosis and inhibit multicellular tumor spheroid growth c f breast cancer cells Oral presentation in HUS conference - Biology 2012 Nguyen Dac Tu , Nguyen T h i Chinh, Nguyen T h i Q uy, Hoang Thi My Nhung 2012 Establishment o f M CF7 spheroid for screening anti-tumor compounds V A S T Journal o f Sciences and Technology 50 (3 C ) 407-413 T in in g results: 02 Master students: Nguyen Th i Ngoe Anh (K ) Subject: Study on the anti-tumor activity o f some compounds extracted from Erythrina orientalis ( L ) M err., Fabaceaeand Magnolia officinalis Rehd et W ils Magnoliaceae Nguyen Dac Tu (K ) Subject: Establishment o f m utlicellular tumor spheroid and angiogenesis model for screening anti-tumor compounds )3 Bachelor student: Iran Nhat Anh ( K 1) Subject: Establishment o f ex vivo angiogenesis model from rat aortic rings (Rattus norvegicus) Duong T h i Huyen (K 5 S P ) Subject: Study on the spheroid formation activity o f ỈỈC T lócancer cell line and screen the anti-tumor spheroid growth ability o f P T X - C U R - P L A - T P G S Nguyen T h ị Hường (K 5 S P ) Subject: Optimizing condition for culturing ■ind maintaining human um bilical vein endothelial cells F in a n c e T o ta l p r o j e c t ’s f in a n c e - Building a detail project References collection and overview Experim ents and data treatment Training fee Materials Report writing and presentation I'Xtra fee 500.000.000 đ 000.000 d 3.000.000 d 150.000.000 d 100 000.000 đ 155.000.000 d 30.000.000 d 60.000.000 d B ả o c o H ỉih iệ m th u d ê t i Ọ ( Ỉ T Ỉ ) 10 - M Ụ C L Ụ C DANH M ỤC HÌNH DANH M ỤC B A N G tìẢ N G C Á C K Ý H IỆ U V A T Ừ V IÉ T T Ắ T M Ỡ D À U CHƯƠNG T ổ n g qu an v ề c ô n g n g h ệ nuôi c ấ y tế bào 3D vai trò q u a n tr ọ n g c ủ a tr o n g n gh iên u sin h h ọc u n g th s n g lục d ợ c p h ẩ m 1.1 Lược sứ nghiên cứu phát triên kĩ thuật nuôi cay tế bào D 1.2 Một số kĩ thuật dùng tạo khối cầu đa bào ung t h 1.3 Mơ hình ni D 1.4 Sơ lưực te bào nội mơ, vai trị tế bào nội mơ hình thành tăng sinh mạch mạch máu Tế bào nội mô tách từ tĩnh mạch dây rố n 10 1.6 Những ứng dụng mơ hình 3D nghicn cứu sinh học ung thư sàng lọc dược phâm .13 1.7 Mục tiêu nội dung đề t i 14 C H Ư Ơ N G 16 P h n g p h p n g h iê n u Đối tượng, hóa chất, dụng cụ, thiết bị vật tư tiêu hao sử dụng trình thực đề t i .16 2.1.1 Đối tượng nghiên c ứ u 16 2.1.2 Hóa chất cho ni tê bào tạo mơ hình khối cầu đa bào ung thư 16 2.1.3 Hóa chất cho phân lập, nhân ni, bào quàn h Ư E V C thí nghiệm đồng nuôi cấy 16 2.1.4 Hóa chất cho phân lập, tách chiết tinh 17 2.1.5 D ụng cụ, vật tir tiêu hao 17 2.2 Các phương pháp nghiên cứu sử dụng thực nội dung cùa đề t i 18 2.1 Phưưng pháp thừ độc tính SRB tế bào nuôi cấy đơn lớ p IX 2.2 Phương pháp nuôi cấy giọt treo (hanging drop) 19 2.3 Thiết kế thí nghiệm thử tác dụng chế phẩm mơ hình spheroid 20 2.4 X ứ lý số liệu 21 2.5 Phưưng pháp phân lập, trì cấy chuyền tế bào nội mô mạch máu .21 2.6 Phương pháp nuôi cấy tế bào nội mô cuống rố n 22 2.7 Phương pháp đồng nuôi cấy M C TS tế bào h u V H C 23 2.8 Plnrơng pháp xác định phân bố tế bào nội mơ tĩnh mạch dây rốn mơ hình khối cầu đa bào ung thư .24 H ú (I c o n g h iệ m th u d ề t i Ọ C ỈT l) 10 - 28 2.2.9 Phương pháp tách chiết tuyên chọn sổ hợp chất tự nhiên đế thử tác dụng kháng 11 tăng sinh mạch m áu 24 2 Phương pháp nhận biết nghiên cứu tế bào tăng sinh mạch máu 25 C H Ư Ơ N G 27 Ket nghiên cứu thảo luận 3.1 Kct nuôi cấy tao khối cầu đa bào số dòng tế bào ung thư 27 3.1.1 Kct quà khả tạo spheroid cùa dòng tế bào ung thư sử dụng đề t i 27 1.2 Xác định biến đổi thê tích theo thời gian khối spheroid từ dòng tế bào ung th 29 3.1.3 Lựa chọn dịng tế bào có khả tạo khói spheroid tốt 33 3.2 Kết phân lập, cấy chuyển trì h U V E C 38 3.2.1 Kct phân lập h U V E C .38 3.2.2 Tối ưu hóa điều kiện mơi trường ni cấy h U V E C 42 3.2.3 Duy trì bảo quản tế bào nội mơ mạch máu dây rốn n gườ i 45 3.3 K-ết đồng nuôi cấy tế bào ung thư dạng khối cầu h U V E C 47 3.3.1 Sự thay đơi vị trí cùa tế bào nội mô sau đồng nuôi cấy với khối spheroid 47 3.3.2 Sự phát triển cùa tế bào nội mô khối spheroid sau đồng nuôi cấy dạng 3D 50 3.3.3 Ket theo dõi phát triển tể bào nội mô khối spheroid sau đồng nuôi cấy dạng 3D đơn lớp .52 3.4 Danh mục, đặc tính chế phẩm tuyển chọn thử tác dụng kháng u tăng sinh mạch máu từ nguồn dược liệu Việt N am .54 3.4.1 Sàng lọc nhanh thuốc có tác dụng, lựa chọn mẫu có hoạt tính cao 54 3.4.2 Phân lập hoạt chất từ thuốc chọn lọc xác địnhcấu trúc 59 3.5 Ảnh hướng số chế phâm lên phát triển khối u tăng sinh mạch máu 62 3.5.1 Tác dụng kháng u số chất chiết tự nhiên mơ hình D 62 3.5.2 Tác dụng ức chế trình tạo mạch máu sổ chất chiếttự nhiên mơ hình 3D đồng ni c ấ y 75 CH ƯƠNG 83 Kết luận đề nghị 4.1 4.2 Kết lu ậ n 83 K iến n g h ị .83 T À I L IỆ U T H A M K H Ả O PH Ụ L Ụ C 84 Báo>cáo nghiêm thu đề tài QGTĐ 10 - 28 DANH MỤC HÌNH Ngn gốc tế bào nội mô Quá trình sinh mạch tạo mạch Đặc điêm ứng dụng cùa tể bào nộimô tĩnh mạch cuống rốn .11 Đặc điểm bề mặt đĩa nuôi cấy tế bào 19 Các spheroid tạo nên từ 06 dòng tế bào uim thư: M CF7, H C T 16, 11460, R I) HT29 H 358 Hình Đường cong tăng trưởng thể tích spheroid dịng tế bào ung thư: M CF7, H460, H C T 16, H358, RD H T2 31 Mình Các hình ảnh tăng trương spheroid dòng HT29 theo thời gian 32 Hình Các hình ảnh tăng trường spheroid dòng H358 theo thời g ia n 32 Hình Khối spheroid dịng tế bào ung thư vú M C F 34 Hình 10 Sự thay đơi hình dạng kích thước spheroid lõi hoại từ theo thời gian 34 Hình 11 Biêu đỏ biên đơi thê tích khơi spheroid lõi hoại tử theo thời gian 36 Hình 12 Sự thay đổi hình dạng trình tăng trường spheroid 37 Hình 13 T ỷ lệ đường kính nhỏ /đường kính lớn spheroid (a/b) theo thời g ia n 37 Mình 14 Sự đào thải lõi hoại tử qua chỗ vỡ lớp vò khốispheroid M CF7 .38 Hình 15 h U V E C nuôi cấy ngày thứ hai sau phân lập .39 Hình lo h U V E C nuôi cấy 24h sau phân lậ p 40 Hình 1 h U V E C nuôi cấy ngày thứ ba sau phân lậ p 41 Hình 18 Te bào phân lập từ lớp lót tĩnh mạch dây rốn nhuộm miễn dịch huỳnh quang với C D quan sát ánh sáng tử ngoại 42 Hình 19 Te bào nội mơ từ tĩnh mạch dây rốn nuôi cấy nguyên phát sau ngày 43 Hình 20 Các tế bào hUVEC sau cấy chuyển lần thứ n g y .44 Hình 21 Các tế bào hUVEC sau cấy chuyển lần thứ hai n g y .44 Hình 22 h Ư V EC sau cấy chuyển lần thứ b a .44 Hình 23 h U V E C sau cấy chuyền lần thứ năm 45 Hình 24 hUVEC hệ F1 sau phục hồi 46 Hình 25 Tơ bào nội mơ khơng qua bao quản tế bào nội mô bảo quản phục h i 47 Hình 2