Nghiên cứu cơ chế giảm rối loạn chuyển hóa LIPID của cao chiết EtOH từ tảo lục CODIUM FRAGILE trong tế bào gan HEPG2

p Bỏ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC Mơ HÀ NỊI KHOA CƠNG NGHẸ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài NGHIÊN CỨU Cơ CHÉ giam rói loạn chuyến hóa lipid CỦA CAO CHIÉT EtOH TỪ TẢO LỤC CODỈUM FRAGILE TRONG TÉ BÀO GAN HEPG2 Giáo viên hướng dẫn : TS Hoàng Thị Minh Hiền Sinh viên thực : Lê Thị Thanh Nhàn Lớp : 11-02 Khóa : K18 Khóa Luận Tốt Nghiệp LỜI CÁM ON Lời xin gứi lời càm ơn sâu sắc đến PGS.TS Đặng Diễm Hồng, Trướng phịng cơng nghệ Táo, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho thực tập phịng thí nghiệm Tơi vơ cám ơn TS Hồng Thị Minh Hiền, Phó trưởng phịng cơng nghệ Tào, Viện Công nghệ Sinh học Cô người trực tiếp hướng dần, chi bảo giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Được thực tập bạn bè anh, chị phòng công nghệ Tào thực rat vui Tôi cám ơn họ rat nhiều đă giúp đỡ tơi nhiệt tình suốt q trình tơi thực tập phịng Một lần nữa,tôi xin gửi lời cám ơn đen tất thay, cô Viện Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội giúp đỡ dạy bảo thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin gứi lời cảm ơn tài trợ cùa Viện Công nghệ Sinh học đề tài mã số CSK13-01 Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 106-YS.06-2013.23 TS Hoàng Thị Minh Hiền làm nhiệm Cuối cùng, tơi xin bày tó lịng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, gia đình bạn bè tạo điều kiện tốt an ùi động viên tơi suốt q trình tơi học tập Xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2015 Sinh viên Lê Thị Thanh Nhàn Lê Thị Thanh Nhàn Khóa Luận Tốt Nghiệp MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIÉT TÁT DẠNH MỤC BANG VÀ HÌNH LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 RỐI LOẠN CHUYẾN HÓA LIPID 1.1.1 Lipid 1.1.2 Thành phần, cấu trúc chức cùa lipoprotein 1.1.3 Rối loạn chuyến hóa lipid 1.1.3.1 Phân loại rối loạn chuyền hóa lipid máu 1.3.2 Những nguyên nhân dẫn đen rối loạn chuyến hóa lipid 1.1.3.3 Tác hại rối loạn chuyển hóa lipid 1.2 CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU TRONG PHÒNG NGỪA VÀ DIỀU TRỊ RÓI LOẠN CHUYÊN HÓA LIPID 1.2.1 Điều chỉnh chế độ ăn uống khéo mạnh, hợp lý 1.2.2 Bỏ thói quen có hại hút thuốc lá, uống bia rượu 1.2.3 Che độ luyện tập đặn 1.2.4 Điều trị hội chứng tăng lipid máu thuốc 1.3 PEROXISOME PROLIFERATOR-ACTIVATED RECEPTORS (PPARs) VÀ VAI TRÒ CỦA CHÚNG TRONG PHỊNG NGỪA VÀ DIỀU TRỊ RĨI LỌẠNiICHỮỶỂN HĨĂ }ạ.l J.1QC Mơ.I.la N.Ộ.Ị 1.3.1 Khái niệm PPARs 1.3.2 Cấu tạo phân tử PPAR 1.3.3 Các gcn mã hóa cho PPAR 1.3.4 Vùng chức điều hoà ADN 1.3.5 Tương tác cũa PPAR với protein điều hồ khác 1.3.6 Vai trị cùa PPAR phòng ngừa điều trị rối loạn chuyển hóa lipid 1.3.6.1 Vai trị PPARa chuyển hóa lipid 1.3.6.2 Vai trị PPARv chuyên hóa lipid 1.4 Tào lục Codium fragile tác dụng sinh học cùa Cơdium fragile 1.4.1 VỊ trí phân loại 1.4.2 Đặc điểm hình thái cấu trúc cùa c fragile 1.4.3 Phân bố 1.4.4 Thành phàn hóa học 1.4.5 Tác dụng sinh học c fragile CHƯƠNG 2: VẬT LIẸU VÀ PHƯỚNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Mầu táo biển 2.1.2 Te bào nuôi cấy 2.1.3 Hóa chất 2.1.4 Thiết bị 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỬU Lê Thị Thanh Nhàn i ii iv V 1 2 5 8 9 10 10 11 12 14 15 17 17 18 19 19 19 20 20 21 23 23 23 23 23 24 24 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2.2.1 Tạo dịch chiết từ sinh khối tào lục Codiurn fragile 24 2.2.2 Nuôi cấy tế bào HcpG2 25 2.2.2.1 Phương pháp hoạt hóa tế bào 25 2.2.2.2 Phương pháp cấy chuyến 26 2.2.2.3 Phương pháp giữ tế bào Nitơ lõng 26 2.2.2.4 Phương pháp đếm tế bào 27 2.2.2.5 Thí nghiệm điều trị bàng dịch chiết EtOH loài táo lục c fragile dòng tế bào HepG2 27 2.2.3 Phương pháp phân tích hoạt tính gây độc tế bào cùa dịch chiết tống 28 số 2.2.3.1 Chuẩn bị dung dịch MTT gốc 28 2.2.3.2 Nuôi cấy đánh dấu tế bào 28 2.2.4 Nhuộm lipid thuốc nhuộm Oil Red o 29 2.2.4.1 Chuẩn bị dung dịch ORO hóa chất cần thiết 29 2.2.4.2 Quy trình nhuộm ORO 29 2.2.5 Xác định hàm lượng lipid tế bào 29 2.2.6 Phương pháp tách chiết ARN tổng số 30 2.2.6.1 Chuẩn bị dụng cụ 30 2.2.6.2 Tách chiết ARN tồng số 30 2.2.6.3 Định lượng xác định độ tinh cúa ARN tồng số phương pháp đo quang 31 2.2.7 Tong hợp cDNA 31 2.2.8 Phân tích phương pháp Real-time PCR 32 2.2.9 Thống kê phlỉlỉíEIVácIìệỉựiộ.l.l Đ.Ọ.I .học .M Là -N.ộ.i 33 CHƯƠNG 3: KET QUẢ VÀ THẢO LUẠN 34 3.1 CHIÉT DỊCH CHIẾT ETOH CÙA LOÀI TÀO LỤC c FRAGILE 34 3.2 NGHIÊN CỬU ÁNH HƯỚNG GÂY ĐỘC TÉ BÀO CŨA DỊCH CHIẾT ETOH TỪ LOÀI CODIUM FRAGILE 34 3.3 ẢNH HƯỜNG CỦA DỊCH CHIÉT ETOH CỦA LOÀI c FRAGILE LÊN HÀM LƯỢNG TRIGLYCERID VÀ CHOLESTEROL TRONG TẾ 35 BÀO HEPG2 3.4 NGHIÊN CỨU CHẾ PHÂN TỪ TÁC DỤNG GIẢM LIPID NỘI 36 BÀO CỦA DỊCH CHIẾT ETOH TỪ LOÀI TÁO LỤC c FRAGILE 3.4.1 Kết tách chiết ARN tồng số từ tế bào HepG2 ủ với dịch chiết c fragile 36 3.4.2 Ánh hường cùa dịch chiết EtOH cùa lồi c fragile lên mức độ điều hịa gen mã hóa cho thụ thề PPARs 37 3.4.3 Dịch chiết c fragile tham gia vào điều hòa biểu gen 39 đích cùa PPARa PPARơ/p q trình trao đổi lipid CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIEN NGHỊ 42 KẾT LUẬN 42 4.2 KIÊN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHAO 43 Lê Thị Thanh Nhàn iii Khóa Luận Tốt Nghiệp DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHŨ VIÉT TẨT ADN: Axit Deoxyribo Nucleic AF: activation function DBD: DNA-binding domain HDL: High Density Lipoprotein LP: Lipoprotein 1DL: Density Lipoprotein 1-FABP: Intestinal fatty acid binding protein LBD: ligand binding domain LDL: Low Density Lipoprotein LDL-C: Low Density Lipoprotein cholesterol Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội L-FABP: Renal liver-type fatty acid binding protein N-COR: nuclear receptor corepressor PDK 4: pyruvate dehydrogenase kinase PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase PPAR: Peroxisome Proliferator-Activated Receptor PPRE: Peroxisome Prolicrator Responsive Element RAR: receptor thyroid acid Retinoic SMRT: silencing mediator of retinoic acid and thyroid hormone receptor VLDL: Very Low Density Lipoprotein WHO: World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) Lê Thị Thanh Nhàn iv Khóa Luận Tốt Nghiệp DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH Bảng Bàng I I Phân loại tuýp rối loạn lipoprotein máu Số trang Bàng 1.2 Các nhóm thuốc điều trị rối loạn chuyến hóa lipid Bàng 1.3 Trình tự cùa PPRE so gen chịu tác động PPAR 14 Bâng 2.1 Báng trình tự mồi 24 Bàng 3.1 Hiệu suất chiết dịch chiết EtOH tồng số từ loài tảo lục c.fragile với 34 dung môi 80% EtOH Bàng 3.2 Ket đo hàm lượng độ tinh cùa mầu ARN tông so từ 37 tế bào HepG2 sau ũ với nồng độ dịch chiết (4, 20 100 pg/mL) cúa tào Codium fragile, 1O|1L chất chuẩn fenofibrate (PPARa) GW0742 (PPARổ/p) Trioglitazonc (PPARy), đối chứng (1% DMSO) ,HT^ư viện Viên Đại học Mớ Hà Nội Sô trang Sơ đồ cấu tạo chung cùa PPAR 11 Hình 1.2 Sơ dồ cấu tạo isoform PPAR cùa người 13 Hình 1.1 Hình 1.3 Tương tác cùa PPAR 17 Hình 1.4 Táo Codium fragile 20 Hình 2.1 Hình thái dịng te bào HepG2 sừ dụng trongnghiên cứu Hình 3.1 Tỷ lệ sống sót tế bào HepG2 ủ với dịch chiếtc fragile 25 35 nồng độ khác sau 24 Hình 3.2 Ánh hưởng dịch chiết EtOH cùa loài Codinni fragile lèn hàm 36 lượng triglycerid cholesterol tế bào HepG2 Hình 3.3 Ánh hường cùa dịch chiết EtOH lồi c fragile lên mức độ 38 diều hịa gen mã hóa cho thụ thê PPARs Hình 3.4 Anh hường cùa dịch chiết c fragile lên mức độ biểu mARN cùa gen tham gia vào q trình trao dơi lipid tế bào HepG2.Số liệu trình bày bàng mean ± SEM *p < 0.05, so với nhóm đối chứng (ú với 0.01% DMSO) Lê Thị Thanh Nhàn 40 Khóa Luận Tốt Nghiệp LỜI MĨ ĐÀU Rối loạn chuyển hóa lipid, tăng mỡ máu, tình trạng lâm sàng đặc trưng bới nồng độ triglycerid (TG) axit béo đồng thời với hàm lượng lipoprotein - cholesterol tỷ trọng thấp (LDL) huyết tương cao Tăng mỡ máu nguyên nhân gây xơ vữa động mạch, bệnh liên quan đen tim mạch, gan nhiễm mỡ đề kháng insulin rối loạn chuyến hóa khác Ớ Việt Nam số người mắc bệnh rối loạn chuyến hóa lipid có chiều hướng gia tăng nhanh chóng thời gian gan Theo kết nghiên cứu năm 2011 Viện Dinh dưỡng, rối loạn chuyến hóa lipid có tỷ lệ 26% người tuổi từ 25 đến 74 Riêng lại thành phổ lớn Hà Nội, TP.HCM, tỳ lệ nêu có the lên đến 40% Do vậy, điều trị bệnh liên quan đến rối loạn chuyền hóa lipid thách thức khơng nhó so với tình trạng gia tăng mạnh Ngày nay, nhiều chất có hoạt tính sinh học phát tách chiết từ nguồn co tự nhiên Tao biên nhóm thực vật sống biên Chúng chứa nhiều chất dinh dưỡng chất có hoạt tính dược học có lợi cho sức khóe cùa người chất chong oxi hóa, chống viêm ung thư Bên cạnh đó, táo biển cịn chứa nhiều khống chất đa vi lượng, vitamin axit béo khơng bão hịa Ở Việt Nam khơng có nhiều nghiên cứu chiết xuất cũa loài táo biến Việt Nam tác dụng che tác dụng cùa chúng rối loạn chuyển hóa lipid Vì chúng em tiến hành: “Nghiên cứu CO' chế giảm rối loạn chuyển hóa lipid cao chiết EtOH từ tảo lục Codium fragile tế bào gan HepG2” Đồ tài nghiên cứu cùa em bao gồm nội dung sau: - Chiết dịch chiết lồi Codium fragile bang dung mơi EtOH 80% - Nghiên cứu ành hưởng gây độc tác dụng sinh học cùa dịch chiết EtOH từ loài Codium fragile - Nghiên cứu chế phân tử giám rối loạn chuyển hóa lipid cùa dịch chiết EtOH từ lồi Codium fragile Lê Thị Thanh Nhàn Khóa Luận Tốt Nghiệp CHƯƠNG TỊNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 RĨI LOẠN CHUYÊN HÓA LIPID 1.1.1 Lipid Lipid nguồn dự trữ lượng lớn cùa the (ờ người bình thường, lipid chiếm tới 40% thê trọng) Lipid tham gia vào cấu trúc tế bào (màng bào tương), đặc biệt tổ chức thần kinh nội tiết Thành phần lipid bao gồm cholesterol toàn phần,trong đó, có cholesterol tự do, cholesterol este, triglycerid (TG), phospholipid axit béo tự Các lipid không tan nước, đe lưu hành máu chúng phải kết hợp với protein đặc hiệu tạo thành phức họp gọi lipoprotein (LP) [21], 1.1.2 Thành phần, cấu trúc chức lipoprotein Tnư viện Viện Đại nọc Mơ Hà Nội Lipoprotein phân tứ cấu hình gồm phần nhân Chúng có số dạng sau [ ]: - Chylomicron: tồng hợp từ ruột non, sau vận chuyển máu tới mao mạch mô mỡ, triglycerid phân thành glycerol vàaxit béo Chylomicron có mặt thời gian ngắn huyết tương Chylomicron mat dan tryglycerid gọi chylomicron tàn dư thái rat nhanh gan - Lipoprotein tỳ trọng thấp (very low density lipoprotein-VLDL): tông hợp gan Triglyccrid VLDL phân giãi tô chức ngoại vi làm cho VLDL nhó dần Khoảng nừa VLDL chuyển hóa thành LDL, phần lại thái trực tiếp gan - Lipoprotein tỷ trọng trung gian (intermediate density lipoprotein-IDL): (hay VLDL tàn dư) sản phẩm chuyến hóa VLDL chất tiền thân cùa LDL, có hàm lượng thấp huyết lương Lê Thị Thanh Nhàn Khóa Luận Tốt Nghiệp - Lipoprotein tỷ trọng thâp (low density lipoprotein-LDL): chât chuyên chở 70% cholesterol huyết tương tới tế bào ngoại biên, xấp xi 75% LDL hấp thu theo đường thụ the LDL tế bào gan tế bào gan Phần lại cúa LDL thãi đại thực bào số tế bào khác Khi LDL bị thay đối thành phần hóa học cấu trúc tạo thành LDL dạng nhó đặc; lúc đại thực bào nơi thu nạp chúng không giới hạn, tạo thành tế bào bọt yếu tổ thúc đẩy trình xơ vữa động mạch - Lipoprotein tý trọng cao (high density lipoprotein-HDL): HDL vận chuyến cholesterol dư thừa từ tế bào tới gan tới tế bào can cholesterol Khoảng 50% HDL thài gan theo đường VLDL tàn dư Chức chủ yếu lipoprotein vận chuyền loại lipid khắp Giúp cho lipid khơng bị vón tụ lại làm gián nguy tắc mạch Triglycerid sau sán xuất gan từ glucid khói gan dạng VLDL đe tới mô mờ sau trao đối phần lớn TG cho mơ mỡ tỷ trọng tăng lên biến thành IDL LDL gom đa số cholesterol phospholipid Sau trao cholesterol cho tế bào Tnir,vien vien Dại học iviaTla Nộ (theo nhu cầu), LDL biến thành HDL dạng vận chuyến cholesterol khói mô ngoại vi để lại gan (nếu mô thừa chất này).Do vậy, HDL đóng vai trị quan trọng giảm nguy vừa xơ động mạch 1.1.3 Rối loạn chuyển hóa lipid Rối loạn chuyến hóa lipid, tình trạng lâm sàng đặc trưng nồng độ triglycerid (TG) axit béo huyết tương cao đồng thời với việc tích lũy huyết tương giàu TG-lipoprotein [7], Đánh giá rối loạn chuyền hóa lipid theo WHO (2000): - Cholesterol tồng số >5,2 mmol/l (200mg/dl) - HDL < 0,9 mmmol/1 (35ing/dl) - LDL >3,38 mmol/1 (130mg/dl) - Triglycerid huyết >2,26mmol/l (90mg/dl) Lê Thị Thanh Nhàn Khóa Luận Tốt Nghiệp / 1.3.1 Phân loại rối loạn chuyến hóa lipid máu ❖ Phân loại cùa De Gennes theo thành phần lipid máu [4]: - Tăng cholesterol đơn thuần: Cholesterol huyết tăng > 5,2 mmol/1, TG bình thường tăng nhẹ Tỷ lệ cholesterol /TG > 2,5 Cholesterol tăng > 6,7 nmol/I thường tăng LDL, HDL tăng làm tăng nhẹ cholesterol - Tăng TG: Cholesterol tăng nhẹ TG tăng cao Khi TG máu > 11,5 nmol/I chylomicron ln có mặt huyết tương Các rối loạn tiên phát tâng LP giàu TG VLDL chylomicron cá hai dạng (hai loại chứa cholesterol tự vỏ cholesterol este lõi), cholesterol tồn phần tăng (chiếm 8-25% hàm lượng TG) Tỷ lệ TG/cholesterol >2,5 Trên lâm sàng hội chứng gặp - Tăng lipid máu hỗn hợp: Cholesterol tăng vừa phái, TG tăng nhiều Tỷ lệ cholesterol/TG