Luận văn thạc sĩ VNUA thử nghiệm vắc xin nhược độc đông khô phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (infectious bronchitis IB) sản xuất tại công ty TNHH MTV AVAC việt nam

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM VŨ DIỆU HOA THỬ NGHIỆM VẮC-XIN NHƯỢC ĐỘC ĐƠNG KHƠ PHỊNG BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM (INFECTIOUS BRONCHITIS – IB) SẢN XUẤT TẠI CƠNG TY TNHH MTV AVAC VIỆT NAM Chun ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Vũ Diệu Hoa i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc thầy giáo PGS.TS Nguyễn Bá Hiên tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Thú Y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Vũ Diệu Hoa ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danhmụccácchữviếttắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract ix Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Hiểu biết chung bệnh IB 2.1.1 Giới thiệu chung 2.1.2 Virus viêm phế quản truyền nhiễm 2.1.3 Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm gà 2.2 Hiểu biết chung vắc-xin 14 2.2.1 Khái niệm 14 2.2.2 Nguyên lý 15 2.2.3 Những đặc tính vắc-xin 15 2.3 Hiểu biết chung miễn dịch 16 Phần Nội dung phương pháp nghiên cứu 20 3.1 Nội dung nghiên cứu 20 3.1.1 Thẩm định giống 20 3.1.2 Kiểm nghiệm vắc-xin 20 3.1.3 Thử nghiệm vắc-xin RTD IB H120 20 3.2 Đối tượng, nguyên liệu địa điểm nghiên cứu 20 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 3.2.2 Nguyên liệu 20 3.2.3 Địa điểm nghiên cứu 21 3.3 Phương pháp nghiên cứu 21 3.3.1 Sản xuất vắc-xin theo quy trình Công ty TNHH MTV AVAC Việt iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nam 21 3.3.2 Phương pháp tiêm truyền giống virus vào trứng có phơi sản xuất giống gốc 23 3.3.3 Phương pháp thu hoạch virus từ phôi trứng gây nhiễm 23 3.3.4 Phương pháp làm IHA 23 3.3.5 Phương pháp xác định EID50 25 3.3.6 Phương pháp gây miễn dịch động vật thí nghiệm 26 3.3.7 Phương pháp tách huyết 26 3.3.8 Phương pháp làm phản ứng ELISA để đánh giá lượng kháng thể gà sau thử nghiệm vắc-xin IB 26 3.3.9 Phương pháp làm RT PCR 27 3.3.10 Phương pháp thử nghiệm vắc-xin 27 3.3.11 Phương pháp thu thập số liệu, xử lý thống kê sinh học 30 Phần Kết thảo luận 31 4.1 Kết thẩm định giống 31 4.1.1 Kiểm tra tiêu giống gốc virus IB chủng RTD IB H120 31 4.1.2 Kết giải mã gen đặc trưng virus RTD IB H120 36 4.2 Kết kiểm nghiệm Vắc-XIN 37 4.2.1 Kết kiểm tra vô trùng vắc-xin RTD IB H120 37 4.2.2 Kết kiểm tra tiêu an toàn vắc-xin IB H120 38 4.2.3 Kết kiểm tra hiệu lực vắc-xin RTD IB H120 39 4.3 Kết thử nghiệm Vắc-XIN RTD IB H120 40 4.3.1 Kết kiểm tra tiêu an toàn vắc-xin IB H120 40 4.3.2 Kết kiểm tra hiệu lực vắc-xin RTD IB H120 42 4.3.3 Kết đánh giá độ dài miễn dịch gà sau tiêm vắc-xin phương pháp kiểm tra HGKT 43 4.3.4 Kết nghiên cứu độ ổn định vắc-xin RTD IB H120 đông khô 46 Phần Kết luận đề nghị 49 5.1 Kết luận 49 5.1.1 Giống virus RTD IB H120 có đặc điểm số sau 49 5.1.2 Vắc-xin RTD IB H120 đạt tiêu vơ trùng, an tồn, hiệu lực trình kiểm nghiệm 49 5.2 Đề nghị 49 Tài liệu tham khảo 50 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BPL β probiolacton ĐC Đối chứng EID50 Embryo Infective Dosage 50 (Liều gây nhiễm 50% phôi) ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay HGKT Hiệu giá kháng thể GMP Good Manufacturing Practices (Thực hành sản xuất tốt) IB Infectious Bronchitis IBV Infectious Bronchitis Virus IHA Indirect Haemagglutination Assay (Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp) MTV Một thành viên PBS Phosphate Buffered Saline RTD Rural Technology Development (Công nghệ phát triển nông thôn) RT PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược) SPF Specific Pathogen-Free TNHH Trách nhiệm hữu hạn VX Vắc-xin WHO World Health Organization (Tổ chức y tế giới) v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Cơng thức Reed & Muench tính EID50 25 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm nhà ni động vật 27 Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm trại gia cơng 29 Bảng 4.1 Kết kiểm tra vô trùng giống gốc virus RTD IB H120 32 Bảng 4.2 Kết xác định EID50 virus RTD IB H120 34 Bảng 4.3 Kết xác định EID50 giống gốc trung bình 35 Bảng 4.4 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể phương pháp ELISA 35 Bảng 4.5 Kết kiểm tra vô trùng văc-xin RTD IB H120 38 Bảng 4.6 Kết kiểm tra tiêu an toàn vắc-xin nhược độc đông khô H120 39 Bảng 4.7 Kết kiểm tra hiệu lực vắc-xin RTD IB H120 40 Bảng 4.8 Kết kiểm tra tiêu an toàn vắc-xin nhược độc đông khô H120 41 Bảng 4.9 Kết kiểm tra hiệu lực vắc-xin RTD IB H120 42 Bảng 4.10 Kết xác định hiệu giá kháng thể trung bình IB huyết gà sử dụng vắc-xin RTD IB H120 phản ứng ELISA 44 Bảng 4.11 Kết xác định độ ổn định vắc-xin RTD IB H120 đông khô bảo quản nhiệt độ 2-8oC 47 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Sơ đồ sản xuất văc-xin RTD IB H120 22 Hình 3.2 Cách làm phản ứng IHA 24 Hình 4.1 Phơi gà nhiễm virus RTD IB H120 33 Hình 4.2 Kết nhân gen S1 chủng virus RTD IB H120 phản ứng PCR M: Marker AND 36 Hình 4.3 Cây phát sinh chủng loại gen S1 chủng RTD IB H120 với chủng tham chiếu khác 37 Hình 4.4 Biểu đồ thể độ dài miễn dịch vắc-xin 45 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Vũ Diệu Hoa Tên luận văn: “Thử nghiệm vắc-xin nhược độc đơng khơ phịng bệnh Viêm phế quản truyền nhiềm (Infectious Bronchitis –IB) sản xuất Công ty Trách nhiệm hữu hạn thành viên AVAC Việt Nam” Chuyên nghành: Thú y Mã học viên: 60 64 01 01 Cơ sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích Đánh giá tiêu vơ trùng, hiệu giá, an tồn, hiệu lực, độ dài miễn dịch, thời gian bảo quản vắc-xin RTD IB H120 Các phương pháp nghiên cứu sử dụng Sử dụng phương pháp thu thập số liệu kết hợp với bố trí thí nghiệm phân tích phịng thí nghiệm Áp dụng phương pháp phân tích thống kê toán học, lấy mẫu, xử lý số liệu Các kết Giống virus IB chủng H120 cơng ty AVAC có đặc điểm: Vơ trùng, hiệu giá 105.54EID50/0,1ml, có đặc tính gây miễn dịch, giải mã gen đặc trưng (S1 độ dài 1,611 bp) kiểm tra giám định gen xác định IBV Vắc-xin RTD IB H120 công ty AVAC kiểm nghiệm đạt tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực Vắc-xin RTD IB H120 thử nghiệm thực địa an toàn gà chủng gấp 10 lần liều quy định, HGKT bảo hộ vắc-xin từ 90%-100% Mỗi liều vắc-xin chứa tối thiểu 103EID50 Gà bảo hộ đến 42 ngày sau chủng vắc-xin RTD IB H120, thời gian bảo quản vắc-xin lên đến 18 tháng Kết luận Virus RTD IB H120 đạt tiêu chuẩn để làm giống gốc Vắc-xin RTD IB H120 đủ điều kiện vơ trùng, an tồn, hiệu lực thử nghiệm thực địa, có kích thích sinh miễn dịch, độ dài miễn dịch kéo dài đến gà 49 ngày tuổi gà chủng vắc-xin thời điểm ngày tuổi, thời gian bảo quản vắc-xin đảm bảo đến 18 tháng viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com THESIS ABSTRACT Author: Vu Dieu Hoa Thesis title: “Testing attenuated lyophilized vaccine preventing infectious bronchitis (Infectious Bronchitis –IB), produce at AVAC Vietnam Company Limited” Major: Veterinary ID: 60 64 01 01 Training institution: Vietnam National University of Agriculture Objective Evaluate criteria including sterility, titer, safety, effectiveness, duration of immunity, and storage time of RTD IB H120 vaccine Method Collection of data combines with arranging experiments and analysis in the laboratory Applying mathematical and statistical analysis method, sampling and data processing Key findings RTD IB H120 Virus of Company AVAC has characteristics: sterile, titer is 5.54 10 EID50/0,1ml, immunogenic features, specific genes are decoded (S1 length is 1,611 bp) and inspection assessment identified as IBV genes RTD IB H120 vaccine from Company AVAC has been tested and satisfied criteria including sterility, safety, and effectiveness RTD IB H120 Vaccine was tested in the field are safe when chicken use vaccine over 10 times compare to prescribed dose, the protection antibiotic titers of the vaccine from 90%-100% Each dose of vaccine contains at least 103 EID50 Chickens are protected within 42 days after using RTD IB H120 vaccine, while vaccines preservation period is up to 18 months Conclusion RTD IB H120 virus satisfy standard to be original species RTD IB H120 vaccine meets sterile conditions, safety and effectiveness has been tested in the field, have immune stimulants, immune duration extended until chicken reach 49 days for chicken strains vaccine at the time of days old, while vaccines preservation period is up to 18 months ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết giải trình tự gen S1 xử lý phần mềm CLUSTAL X ver.1.81 MegAlign (DNASTAR, Madi-son, WI) so sánh với trình tự gen S1 tham chiếu khác ngân hàng giữ liệu gen quốc tế (GenBank) Kết phân tích trình tự gen amino acid gen S1 cho thấy chủng virus “RTD IB H120” có mức độ tương đồng cao so sánh với chủng virus H120 (mã số GenBank GU393335) Hình 4.3 Cây phát sinh chủng loại gen S1 chủng RTD IB H120 với chủng tham chiếu khác 4.2 KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM VẮC-XIN 4.2.1 Kết kiểm tra vô trùng vắc-xin RTD IB H120 Để kiểm tra tiêu vô trùng vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 chế phôi gà SPF, lô vắc-xin lấy mẫu theo QCVN 01-03: 2009/BNNPTNT Mẫu lơ vắc-xin hồn ngun trở lại PBS, sau ni cấy mơi trường nuôi cấy vi khuẩn: nước thịt, thạch máu, thạch thường, nước thịt gan yếm khí mơi trường ni cấy nấm: thạch nấm Hút 0,2 ml vắc-xin cấy vào ống môi trường, loại môi trường dùng ống, sau để vào tủ ấm 370C/7 ngày, đem kiểm tra phát triển vi khuẩn, riêng mơi trường thạch nấm để nhiệt độ phịng ngày (bảng 4.5) Từ kết bảng 4.5 cho thấy, lô vắc-xin kiểm tra cho kết âm tính (khơng có vi khuẩn nấm mọc môi trường kiểm tra) Căn theo TCVN 8684:2011, lô đạt tiêu chuẩn vô trùng Kết đáp ứng yêu cầu OIE, (2016) tiêu chuẩn ASEAN, (2002) 37 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 4.5 Kết kiểm tra vô trùng văc-xin RTD IB H120 Loại môi trường kiểm tra Số lô Thời gian theo dõi Thạch máu (2 ống) Thạch thường (2 ống) Nước thịt (2 ống) Yếm khí (2 ống) Thạch nấm (2 ống) Kết luận Lô ngày Đạt Đạt Đạt Lô ngày Đạt Đạt Đạt Lô ngày Đạt Đạt Đạt Ghi chú: - âm tính (khơng có vi khuẩn nấm mọc) 4.2.2 Kết kiểm tra tiêu an toàn vắc-xin IB H120 Chỉ tiêu an toàn tiêu bắt buộc đánh giá chất lượng vắc-xin Điều quan trọng loại vắc-xin phải an toàn không gây phản ứng nghiêm trọng vật sử dụng vắc-xin Một vắcxin đánh giá an tồn tiêm cho động vật phịng thí nghiệm liều vắc-xin gấp từ 10-100 lần liều sử dụng đốivới vắc-xin nhược độc, động vật không bị chết khơng có triệu chứng lâm sàng quan sát Có nhiều phương pháp sử dụng để đánh giá mức độ an toàn vắc-xin RTD IB H120 Nhưng dù phương pháp phải khẳng định vắc-xin an tồn hay khơng an tồn gà sử dụng Để kiểm tra an tồn, lơ vắc-xin lấy lọ bất kỳ, pha trở lại PBS vô trùng, trộn lọ với nhau, sau nhỏ mắt, nhỏ mũi gà với 10 liều vắc-xin sử dụng Gà đối chứng không sử dụng vắc-xin nuôi cách ly với lơ thí nghiệm Lơ an tồn nhà nuôi động vật gồm 10 gà chủng vắc-xin với liều gấp 10 lần định nhãn Gà theo dõi liên tục thời gian 21 ngày sau chủng vắc-xin Kết theo dõi lơ cho thấy khơng có biểu bất thường tất 10 gà Như vắc-xin đảm bảo tính an toàn sử dụng với liều gấp 10 lần liều định 38 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 4.6 Kết kiểm tra tiêu an tồn vắc-xin nhược độc đơng khơ H120 Số lô Lứa Tổng số tuổi gà chủng (con) Lô I Lô II Lô III Lô ĐC Gà tuần tuổi Gà tuần tuổi Gà tuần tuổi Gà tuần tuổi 10 10 10 10 Liều Đường Theo dõi chủng dung sau tiêm 10 liều Nhỏ mắt, Bình nhãn mũi thường 10 liều Nhỏ mắt, Bình nhãn mũi thường 10 liều Nhỏ mắt, Bình nhãn mũi thường Khơng nhỏ Bình thường Tỷ lệ an tồn (%) 100 100 100 100 Ghi chú: ĐC lô gà đối chứng không chủng vắc-xin Qua bảng 4.6 cho thấy: Tất số gà thí nghiệm dùng 10 liều vắc-xin RTD IB H120 vào lúc tuần tuổi theo đường nhỏ mắt, nhỏ mũi với gà đối chứng khơng sử dụng vắc-xin khoẻ mạnh, phát triển bình thường khơng có biểu lâm sàng bệnh IB Tỷ lệ sống lô gà thí nghiệm đạt 100% khơng phát thấy dấu hiệu đường hô hấp đặc trưng lơ gà thí nghiệm Điều chứng tỏ: Vắc-xin RTD IB H120 đông khô nuôi cấy phôi gà an toàn sử dụng cho gà Kết đáp ứng yêu cầu Asean, 2002 khuyến cáo OIE, 2016 4.2.3 Kết kiểm tra hiệu lực vắc-xin RTD IB H120 Hiệu phòng bệnh vắc-xin phụ thuộc vào nhiều yếu tố, hiệu lực vắc-xin đánh giá yếu tố định Vì vậy, kiểm tra hiệu lực vắc-xin khâu thiếu kiểm nghiệm loại vắc-xin Để kiểm tra tiêu hiệu lực vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120, sử dụng gà tuần tuổi đường chủng vắc-xin nhỏ mắt, mũi 39 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 4.7 Kết kiểm tra hiệu lực vắc-xin RTD IB H120 Sau 14 ngày Sau 28 ngày Số lô Đối tượng Tổng số gà chủng (con) Lô I TN ĐC 20 20 0,295 0,012 19 95 0,432 0,065 20 100 Lô II TN ĐC 20 20 0,334 0,023 19 95 0,504 0,043 20 100 Lô TN 20 0,302 18 90 0,489 19 95 III ĐC 20 0,027 0 0,052 0 HGKT trung bình Số mẫu dương tính HGKT bảo hộ (%) HGKT trung bình HGKT trung bình 0,310 Số mẫu HGKT dương bảo hộ tính (%) 0,475 Ghi chú: HGKT hiệu giá kháng thể ĐC lô đối chứng, TN lơ thí nghiệm Vào ngày thứ 14 28 sau chủng vắc-xin, lấy máu 20 gà lô hiệu lực với 20 gà lô đối chứng để kiểm tra phát kháng thể kháng virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (IB) phương pháp ELISA Kit ELISA hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá: S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ S/P ≤ 0,15 => Âm tính HGKT gà sau chủng vắc-xin 14 ngày đạt trung bình 0,310 HGKT bảo hộ cho gà đạt từ 90% đến 95% HGKT gà sau chủng vắc-xin 28 ngày đạt trung bình 0,475 HGKT bảo hộ cho gà đạt từ 95% đến 100% Vắc-xin đạt tiêu hiệu lực gà mẫn cảm chủng liều vắc-xin, 14 28 ngày sau kiểm tra hiệu giá kháng thể gà bảo hộ 4.3 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM VẮC-XINRTD IB H120 4.3.1 Kết kiểm tra tiêu an toàn vắc-xin IB H120 Vắc-xin coi an toàn sử dụng cho thể chưa mắc bệnh phải đạt yêu cầu sau: Con vật khơng có phản ứng phụ, khơng sốt sốt nhẹ, ăn uống hoạt động bình thường, khơng ảnh hưởng đến khả sinh sản sức sảnxuất Sau kiểm tra chất lượng lô vắc- xin RTD IB H120 Công ty đạt 40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com yêu cầu, tiến hành thử nghiệm vắc-xin trại gà Công ty Cổ phần Phát triển Công nghệ Nông thôn làm tương tự nhà động vật với số lượng lô 50 Lơ an tồn traị gàgồm 50 gà chủng vắc-xin với liều gấp 10 lần định nhãn Gà theo dõi liên tục thời gian 21 ngày sau chủng vắc-xin Kết theo dõi lơ cho thấy khơng có biểu bất thường tất 50 gà Như vắc-xin đảm bảo tính an tồn sử dụng với liều gấp 10 lần liều định Bảng 4.8 Kết kiểm tra tiêu an toàn vắc-xin nhược độc đông khô H120 Số lô Lứa Tổng số tuổi gà chủng (con) Liều chủng Đường dùng Theo dõi sau tiêm Tỷ lệ an tồn (%) Lơ I Gà tuần tuổi 50 10 liều nhãn Nhỏ mắt, mũi Bình thường 100 Lơ II Gà tuần tuổi 50 10 liều nhãn Nhỏ mắt, mũi Bình thường 100 Lô III Gà tuần tuổi 50 10 liều nhãn Nhỏ mắt, mũi Bình thường 100 Lơ ĐC Gà tuần tuổi 50 Khơng nhỏ Bình thường 100 Ghi chú: ĐC lô gà đối chứng không chủng vắc-xin Qua bảng 4.8 cho thấy: Tất số gà thí nghiệm dùng 10 liều vắc-xin RTD IB H120 vào lúc tuần tuổi theo đường nhỏ mắt, nhỏ mũi với gà đối chứng không sử dụng vắc-xin khoẻ mạnh, phát triển bình thường khơng có biểu lâm sàng bệnh IB Tỷ lệ sống lơ gà thí nghiệm đạt 100% không phát thấy dấu hiệu đường hô hấp đặc trưng lơ gà thí nghiệm Điều chứng tỏ: Vắc-xin RTD IB H120 đơng khơ ni cấy phơi gà an tồn sử dụng cho gà Kết đáp ứng yêu cầu Asean, 2002 khuyến cáo OIE, 2016 Từ số liệu bảng 4.6và bảng 4.8khẳng định: Cả gà nuôi nhà nuôi động vật gà nuôi thực địa, sau tiêm vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 qua thời gian theo dõi 21 ngày, tất gà sống khoẻ mạnh, ăn uống 41 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com hoạt động bình thường, tỷ lệ an tồn đạt 100% Điều chứng tỏ rằng: với quy mơ phịng thí nghiệm hay thực địa văc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 cho kết an toàn 4.3.2.Kết kiểm tra hiệu lực vắc-xin RTD IB H120 Tương tự nhà nuôi động vật, thực địa lấy máu 50 gà lô hiệu lực với 20 gà lô đối chứng để kiểm tra phát kháng thể kháng virus gây bệnh IB phương pháp ELISA Hiệu lực vắc-xin đánh giá thơng qua số gà thí nghiệm bảo hộ Kit ELISA hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá: S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ S/P ≤ 0,15 => Âm tính Để kiểm tra tiêu hiệu lực vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120, sử dụng gà tuần tuổi đường chủng vắc-xin nhỏ mắt, mũi Vào ngày thứ 14 28 sau chủng vắc-xin, lấy máu 20 gà lô hiệu lực với 20 gà lô đối chứng để kiểm tra phát kháng thể kháng virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (IB) phương pháp ELISA Kết trình bày bảng 4.9 Bảng 4.9 Kết kiểm tra hiệu lực vắc-xin RTD IB H120 Số lô Đối tượng Tổng số gà chủng (con) Lô I TN Sau 14 ngày Sau 28 ngày HGKT trung bình Số mẫu dương tính 50 0,298 49 98 0,485 Số mẫu dương tính 50 ĐC 20 0,025 0 0.033 0 Lô TN 50 0,302 48 96 0,517 49 98 II ĐC 20 0,031 0 0,039 0 Lô TN 50 0,312 49 98 0,515 50 100 III ĐC 20 0,024 0 0,029 0 HGKT trung bình lơ TN HGKT bảo hộ (%) HGKT trung bình 0,304 HGKT bảo hộ (%) 100 0,506 Ghi chú: HGKT hiệu giá kháng thể ĐC lô đôi chứng, TN lơ thí nghiệm 42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Qua bảng 4.9 cho thấy: HGKT gà sau chủng vắc-xin 14 ngày đạt trung bình 0,304 HGKT bảo hộ cho gà đạt từ 90% đến 98% HGKT gà sau chủng vắc-xin 28 ngày đạt trung bình 0,506 HGKT bảo hộ cho gà đạt từ 98% đến 100% Trong lơ đối chứng HGKT âm tính tỷ lệ bảo hộ Theo 10 TCN 183-93, vắc-xin nhược độc đơng khơ RTD IB H120 thích nghi phơi gà để sử dụng phòng bệnh cho đàn gà phải đạt tiêu vơ trùng, an tồn hiệu lực Vắc-xin coi an toàn sau dùng cho gà mẫn cảm liều vắc-xin gấp 10 lần liều sử dụng, đườn dung nhỏ mắt, mũi, theo dõi 21 ngày, gà ăn uống, hoạt động bình thường Vắc-xin đạt tiêu hiệu lực gà mẫn cảm chủng liều vắc-xin, 14 và28 ngày sau kiểm tra hiệu giá kháng thể gà bảo hộ Như vậy, qua kết nghiên cứu khẳng định vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 chế phơi gà hồn tồn vơ trùng, có độ an tồn hiệu lực cao 4.3.3.Kết đánh giá độ dài miễn dịch gà sau tiêm vắc-xin phương pháp kiểm tra HGKT Độ dài miễn dịch gà khả trì tồn trạng thái miễn dịch thể gà thí nghiệm gây chủng vắc-xin RTD IB H120 nhược độc Khả miễn dịch gà chủng vắc-xin dài chứng tỏ bảo hộ vắc-xin gà nhiêu Độ dài miễn dịch gà sau chủng vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 thể qua tỷ lệ bảo hộ gà vắc-xin sau thời gian chủng Kháng thể không xuất sau tiêm mũi tiêm đầu trước 24 mà xuất sau 24 trở đi, lượng kháng thể tăng dần đến mức bảo hộ Theo Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hương (2009) đưa vắc-xin vào thể, kháng thể chưa sinh mà phải sau thời gian tiềm tàng, dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng nguyên chứa vắc-xin xâm nhập kháng nguyên lần đầu hay lần thứ hai, thứ ba sau kháng thể sinh ra, lượng kháng thể tăng dần, đạt mức cao sau 2-3 tuần giảm dần sau vài tháng vài năm Bố trí 150 gà tuần tuổi, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm chia thành lô 43 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lơ thí nghiệm: 100 gà sử dụng vắc-xin RTD IB H120 theo đường Nhỏ mắt, mũi, liều vắc-xin Lô đối chứng: 50 gà không sử dụng vắc-xin Các lô gà nuôi cách ly, chăm sóc ni dưỡng điều kiện có kiểm sốt dinh dưỡng, nước uống điều kiện vệ sinh thú y Gà lô tiến hành lấy máu, chắt huyết vào thời điểm 7, 14, 21, 28, 35, 42 49 ngày tuổi Mỗi lần lấy máu lấy ngẫu nhiên, lơ thí nghiệm I lấy 10 mẫu, lơ thí nghiệm II lấy mẫu Máu gà sau lấy, cho vào ống lấy máu chuyên dụng, để nghiêng cố định 15 phút cho máu đơng hồn tồn Sau ủ ấm 370C/ Chắt huyết thanh, vô hoạt 560C 30 phút để diệt bổ thể bảo quản nhiệt độ -200C chờ kiểm tra kháng thể Các mẫu huyết gà xác định hiệu giá kháng thể IB phương pháp ELISA Kết trình bày bảng 4.10 Bảng 4.10 Kết xác định hiệu giá kháng thể trung bình IB huyết gà sử dụng vắc-xin RTD IB H120 phản ứng ELISA Thời điểm kiểm tra Lơ thí nghiệm Lô đối chứng ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 0,125 0,162 0,298 0,375 0,110 0,097 0,08 0,06 35 ngày 42 ngày 49 ngày 0,501 0,366 0,153 0 Kháng thể IB xác định phương pháp ELISA có sử dụng Kit hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá: S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ S/P ≤ 0,15 => Âm tính Từ kết với tiêu chuẩn kit, nhận thấy: Tại thời điểm ngày tuổi hiệu giá kháng thể trung bình gà lơ nhỏ 0,15 (lơ thí nghiệm 0,125 lơ đối chứng 0,110) Lơ thí nghiệm , gà sử dụng vắc-xin RTD IB H120, hiệu giá kháng 44 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thể IB bắt đầu tăng nhẹ (0,162 ), 14 ngày sau chủng vắc-xin RTD IB H120, hiệu giá kháng thể tăng cao lên đến 0,298, 21 ngày sau chủng văc-xin HGKT đạt 0,375 đạt đỉnh cao 35 ngày tuổi 0,501 Sau hiệu giá kháng thể giảm dần đến 49 ngày tuổi 0,153 Trong đó, lơ đối chứng - gà khơng sử dụng vắc-xin, hiệu giá kháng thể thụ động giảm dần không phát kháng thể 35 ngày tuổi Như vậy, gà sử dụng vắc-xin RTD IB H120 vào lúc ngày tuổi bảo hộ với bệnh IB đến 49 ngày tuổi Làm tương tự với lơ ta có độ dài miễn dịch gà thể biểu đồ hình 4.4 0,6 0,5 0,4 Lô I Lô II 0,3 Lô III 0,15 0,2 0,1 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày 42 ngày 49 ngày Hình4.4 Biểu đồ thể độ dài miễn dịch vắc-xin Như vậy, nhìn vào biểu đồ hình 4.4 quan sát rõ ổn định hay giảm xuống hiệu giá kháng thể gà lô vắc-xin qua thời điểm kiểm tra độ dài miễn dịch Từ kết nghiên cứu khẳng định: gà sau chủng vắc-xin từ ngày đến 42 ngày bảo hộ công virus cường độc Điều chứng tỏ gà chủng vắc-xin nhược độc đông khôRTD IB H120 chế phơi gà SPF có độ dài miễn dịch đến 49 ngày tuổi chủng vắc-xin thời điểm gà ngày tuổi 45 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.3.4 Kết nghiên cứu độ ổn định vắc-xin RTD IB H120 đông khô Bệnh IB bệnh thường tiến triển thể cấp tính, tỷ lệ tử vong cao, bệnh xảy quanh năm Vì thế, việc sản xuất dự trữ đủ lượng vắc-xin nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn chăn ni cần thiết Trong q trình lưu kho dự trữ, điều kiện bảo quản tốt để không làm giảm chất lượng vắc-xin thiếu Vấn đề đặt vắc-xin sau sản xuất, bảo quản 2o-8oC thời gian bảo quản kéo dài mà hiệu lực khơng bị ảnh hưởng Do đó, việc đưa thơng tin thời hạn bảo quản vacxin nhà sản xuất người tiêu dùng cần thiết Trong trình bảo quản vào thời điểm tháng, tháng, tháng, tháng 12 tháng, 15 tháng 18 tháng tiến hành lấy mẫu lơ vắc-xin thí nghiệm kiểm tra vật lý chuẩn độ xác định hiệu giá virus mẫu vắc-xin Kiểm tra vật lý gồm có kiểm tra độ ẩm kiểm tra độ chân không − Kiểm tra độ ẩm: Ta có nhiều phương pháp để xác định độ ẩm như: Phương pháp sấy khô vắc-xin chân không, phương pháp xác định độ ẩm khơng hồn tồn phương pháp cộng hưởng từ tính nguyên tử Việc xác định độ ẩm vắc-xin RTD IB H120 tiến hành kiểm tra thiết bị phân tích độ ẩm - Sartorius MA Thiết bị đo độ ẩm theo phương pháp làm nước mẫu nhiệt sử dụng tia hồng ngoại, halogen vi sóng Thiết bị cho kết phân tích sau - 15 phút − Kiểm tra độ chân không: Mức độ chân không lọ vắc-xin đông khô thường xác định thiết bị kiểm tra phát tia sáng có tần số cao (high frequency) Thiết bị phát có mặt mức độ chân khơng lọ vắc-xin Khi kiểm tra, người ta đưa thiết bị qua lọ vắc-xin đặt nằm ngang, thiết bị phát ánh sáng màu tím đậm lọ vắc-xin có chân khơng cao, thiết bị phát ánh sáng màu tím nhạt xanh lọ vắc-xin có chân khơng thấp khơng có chân khơng Những lọ vắc-xin khơng có chân khơng bị loại bỏ Ba lơ thí nghiệm, thời điểm lấy lọ vắc-xin lơ thí nghiệm Các lọ kiểm tra tiêu vật lý vắc-xin đơng khơ hình thái, màu sắc,… sau hoàn nguyên trở lại dung dịch PBS, trộn lại với nhau, tiến hành chuẩn độ để xác định hiệu giá virus liều vắc-xin 46 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết thí nghiệm trình bày bảng 4.12 Qua kết bảng 4.12 cho thấy: Cả lơ thí nghiệm cho kết kiểm tra vật lý đạt thời điểm bảo quản khác có hiệu giá virus đạt mức cho phép (>103,0 EID50), khơng có mẫu có hiệu giá virus khơng đạt (< 103,0 EID50 ) Ở thời điểm bảo quản 18 tháng, lơ thí nghiệm có hiệu giá virus ổn định đạt tiêu chuẩn Vậy qua lơ thí nghiệm cho thấy: Virus IB có tính kháng nguyên bền vững ổn định với nhiệt độ q trình đơng khơ thời gian bảo quản, hiệu giá virus ổn định, không thay đổi lô kiểm tra đạt 103,6 EID50, hiệu giá hiệu giá virus liều vắc-xin RTD IB H120 sản xuất Bảng 4.11 Kết xác định độ ổn định vắc-xin RTD IB H120 đông khô bảo quản nhiệt độ 2-8oC LôTN Lô Lô Lô Thời gian bảo quản (tháng) 12 15 18 12 15 18 12 15 18 Số lượng mẫu kiểm tra (n) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Trạng thái vật lý Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Hiệu giá virus (EID50/ liều) 103,6 103,6 103,6 103,5 103,5 103,3 103,1 103,6 103,6 103,6 103,4 103,4 103,3 103,2 103,6 103,6 103,5 103,5 103,3 103,3 103,1 47 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Mặc dù nhiệt độ lạnh sâu trình đơng khơ nhiệt độ bảo quản thời gian dài, lớp protein virus bảo vệ tốt làm cho virus khơng bị phá huỷ tính kháng ngun bảo tồn Vì thế, giống virus IB nên bảo quản điều kiện nhiệt độ lạnh sâu, ổn định, vừa đảm bảo hiệu giá virus, vừa đảm bảo chất lượng giống Còn vắc-xin RTD IB H120 đông khô nên bảo quản nhiệt độ (+2) đến (+8)0C, nhiệt độ hiệu giá virus vắc-xin đảm bảo, tính kháng ngun virus khơng thay đổi, đồng thời nguyên liệu dùng để chứa vắcxin không bị ảnh hưởng Mặt khác sản xuất với số lượng lớn nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng, bảo quản vắc-xin lạnh sâu khó khăn thiết bị bảo quản chất lượng nguyên liệu chứa vắc-xin (như chai, lọ, nút) Các nguyên liệu bị nứt, hở nhãn lọ vắc-xin bị bong đưa sử dụng, từ đó, dẫn đến chất lượng vắc-xin khơng đảm bảo Qua nghiên cứu đề tài cho thấy, vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 sau sản xuất có độ dài bảo quản 18 tháng điều kiện nhiệt độ 2o-8oC Từ đưa lịch bảo quản cho nhà sản xuất người tiêu dùng, giúp cho họ có kế hoạch hoạch định xác cơng tác sản xuất kinh doanh đem lại nguồn lợi kinh tế cao cho doanh nghiệp 48 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam sản xuất hàng năm theo quy trình sản xuất vắcxin trứng gà SPF 9-11 ngày tuổi, để cung cấp cho cơng tác phịng, chống bệnh IB quốc gia Căn vào kết thu trình nghiên cứu luận văn, đưa số kết luận sau đây: 5.1.1 Giống virus RTD IB H120 có đặc điểm số sau Giống virus RTD IB H120 không bị tạp Hiệu giá gây nhiễm 50% phôi gà EID50/0,1ml 105,54 Virus RTD IB H120 đáp ứng yêu cầu kỹ thuật tính an tồn đặc tính gây miễn dịch Mẫu virus RTD IB H120 kiểm tra giống virus RTD IB H120 5.1.2 Vắc-xin RTD IB H120 đạt tiêu vơ trùng, an tồn, hiệu lực q trình kiểm nghiệm Vắc-xin đảm bảo vơ trùng Đảm bảo an toàn thử nghiệm chủng 10 liều cho gà Tạo kháng thể IB cho gà sau chủng theo huớng dẫn nhà sản xuất 5.2 ĐỀ NGHỊ - Xác định hàm lượng kháng thể bị động gà sinh từ gà mẹ tiêm phịng vắc-xin nhược độc đơng khơ RTD IB H120 để định thời điểm chủng mũi thích hợp gà giai đoạn nở - Cần thực cách nghiên ngặt việc tiêm phòng cho đàn gia cầm để góp phần phịng chống dịch IB gia cầm - Khuyến khích ngành chăn ni sử dụng vắc-xin sản xuất nước để giảm chi phí mà đạt hiệu 49 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bùi Trần Anh Đào (1999).Kiểm soát cảm nhiễm virus gây bệnh Newcastle, Gumboro viêm phế quản truyền nhiễm gà thịt Hiệu phòng bệnh hiệu kinh tế chương trình vaccin phịng bệnh thành phố Hồ Chí Minh Luận văn thạc sĩ, Khoa sau đại học, Đại học nông lâm TPHCM Đỗ Thị Thanh Hương (2010).Chẩn đoán bệnh viêm phế quản truyền nhiễm gà có triệu chứng bệnh hơ hấp.Báo cáo tốt nghiệp Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Cục thú y, Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y Nhà nước (1996).Qui trình kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng thú y.NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hương (2009) Giáo trình miễn dịch học ứng dụng, NXB Nông nghiệp Nguyễn Bá Hiên (2010) Công nghệ chế tạo sử dụng vắc-xin Thú y Việt Nam, NXB Nông Nghiệp Nguyễn Bá Hiên Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2013) Bệnh truyễn nhiễm động vật nuôi biện pháp khống chế, NXB Nông nghiệp Nguyễn Hồng Minh (2012).Nghiên cứu, sản xuất thử nghiệm vacxin nhược độc đông khô đa giá phòng bệnh Newcastle, Gumboro Viêm phế quản truyền nhiễm gà, Luận án Tiến sĩ, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội Phạm Sĩ Lăng (2010) Bệnh gia cầm Việt Nam, NXB Nông Nghiệp Trần Thanh Vân (2000) Khảo sát ảnh hưởng biến chủng gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm tỉ lệ chết sản xuất trứng đàn gà bố mẹ giống thịt Hubbard High – Yield.Luận văn thạc sĩ , Khoa sau đại học, Trường đại học nông lâm TP Hồ Chí Minh 10 Trương Thị Hồng Thắm (2002).Khảo sát bệnh tích thận gà mắc bệnh Gumboro, viêm phế quản truyền nhiễm E.Coli mổ khám Bệnh xá thú y Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, Báo cáo tốt nghiệp, Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Tiếng Anh: 11 Andrew M K., E Lefkowitz, J.A Michael and E B Carstens (2011) Virus Taxonomy, Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses 12 ASEAN Cooperation in Food, Agriculture and Forestry (2002).Asean standards for animal vaccines, Second Edition, Livestock Publication series No.2A 13 Cavanagh D., D A Brian, M A Brinton, L Enjuanes, K V Holmes, M.C Horzinek, M.M.C Lai, H Laude, P.G.W Plagemann, S.G Siddell, W Spaan, F Taguchi and P.J Talbot (1994) "Revision of the taxonomy of the Coronavirus, Torovirus and Arterivirus genera", Arch Virol 135, p 227-237 14 Cavanagh D (2000) Coronaviruses and Toroviruses In A Z Zuckerman, J E Banatvala, and J R Pattison (eds.) Principles and Practice of Clinical Virology, 4th ed John Wiley and Sons: Chichester, United Kingdom, p 345 – 356 15 Cavanagh D (2001) Commentary: a nomenclature for avian coronavirus isolates and the question of species status, Avian Pathol 30, p 109 – 115 16 Cavanagh D and G.J Jack (2008) "Infectious Bronchitis" Disease of Poultry, Twelfth edition, IOWA, USA p 117 - 136 17 Enjuanes L., D Brian, D Cavanagh, K Holmes, M M C Lai, H Laude, P Masters, P Rottier, S Siddell, W J M Spaan, F Taguchi and P Talbot (2000) Coronaviridae, In F A Murphy, C M Fauquet, D H L Biship, S A Ghabrial, A W Jarvis, G P Martelli, M A Mayo, and M D Summers (eds.) Virus Taxonomy, Academic Press: New York, p 835 – 849 18 Ignjatovic J andL Galli (1994) The S1 glycoprotein but not the N or M proteins of avian infectious bronchitis virus induces protection in vaccinated chickens, Arch Virol 138, p.117–134 19 Nakamura K., J.K.A Cook, K Otsuki, M.B Huggins and J.A Frazier (1991) Comparative study of respiratory lesions in two chicken lines of different susceptibility infected with infectious bronchitis virus: histology, ultrastructure and immunohistochemistry, Avian Pathology 20, p 241– 257 20 OIE (World organisation for animal health) (2016).Manual of dianostic tests and vaccines for terrestrial animal, Sixth Edition Otsuki K., M.B Huggins and J.K.A Cook (1990) "Comparison of the susceptibility to avian infectious bronchitis virus infection of two inbred lines of white leghorn chickens", Avian Pathol 19, p.467 – 475 51 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... nghiệm thử nghiệm vắc- xin sản xuất từ số chủng virus theo tiêu chuẩn GMP – WHO, chúng tơi thực đề tài: “ Thử nghiệm vắc- xin nhược độc đông khô phòng bệnh Viêm phế quản truyền nhiềm (Infectious Bronchitis. .. Kiểm nghiệm vắc- xin Vắc- xin nhược độc đông khô phòng bệnh IB chủng H120 sản xuất theo quy trình Cơng ty TNHH MTV AVAC Việt Nam sau tiến hành kiểm nghiệm tiêu vơ trùng, an toàn, hiệu lực 3.1.3 Thử. .. dịch động vật thí nghiệm Gà thí nghiệm gà khỏe mạnh chưa sử dụng vắc- xin phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm, gà gây miễn dịch vắc- xin IB H120 công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam, đường dùng nhỏ