Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu dịch tễ học bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis - IB) ở gà nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm xác định được các đặc điểm dịch tễ, sự phân bố của các chủng IBV để làm cơ sở đề xuất các biện pháp phòng chống IB (tiêm phòng vacxin) nhằm tạo điều kiện cho chăn nuôi phát triển bền vững.

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Văn Phan

HÀ NỘI - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018

Tác giả luận án

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Văn Phan và TS Lê Huỳnh Thanh Phương, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian

và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,

Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ Tập đoàn DABACO Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến những đồng nghiệp công tác tại Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam, Trung tâm Chẩn đoán Thú y DABACO đã hỗ trợ và cung cấp tài liệu cũng như các nguyên liệu cần thiết để tôi thực hiện nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án

Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Loan

MU ̣C LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lu ̣c iii

Danh mục các ký hiê ̣u và các chữ viết tắt vi

Danh mục các bảng viii

Danh mục các hình ix

Trích yếu luận án xi

Thesis abstract xiii

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Phạm vi nghiên cứu 2

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 2

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Những đóng góp mới của đề tài 2

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.5.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 3

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà 4

2.1.1 Lịch sử bệnh viêm phế quản truyền nhiễm trên thế giới 4

2.1.2 Tình hình bệnh và những vấn đề nghiên cứu về bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm ở Việt Nam 7

2.2 Đặc tính sinh học của IBV 9

2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại 9

2.2.2 Sức đề kháng, phương thức truyền lây của IBV 15

2.2.3 Đặc tính nuôi cấy của IBV 17

2.3 Đặc điểm phân tử của virus viêm phế quản truyền nhiễm 19

2.3.1 Gen Glycoprotein S 20

2.3.2 Gen Glycoprotein S1 21

2.3.3 Gen Glycoprotein S2 22

2.3.4 Nghiên cứu dịch tễ học IBV dựa trên genotype 22

2.4 Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm 24

2.4.1 Dịch tễ học 24

2.4.2 Phương thức truyền lây 24

2.4.3 Cơ chế gây bệnh 25

2.4.4 Triệu chứng lâm sàng 26

2.4.5 Bệnh tích 27

2.5 Vacxin phòng bệnh 32

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 34

3.1 Địa điểm nghiên cứu 34

3.2 Thời gian nghiên cứu 34

3.3 Nội dung nghiên cứu 34

3.3.1 Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chẩn đoán phát hiện IBV và nghiên cứu biến đổi bệnh lý IB trên gà 34

3.3.2 Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ IB ở gà ta ̣i mô ̣t số tỉnh miền Bắc Việt Nam 34

3.3.3 Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của các chủng IBV phân lập được 34

3.3.4 Phân tích trình tự gen và xây dựng cây phả hệ 35

3.4 Vật liệu nghiên cứu 35

3.4.1 Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 1 35

3.4.2 Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 2 36

3.4.3 Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 3 36

3.4.4 Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 4 36

3.5 Phương pháp nghiên cứu 37

3.5.1 Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 1 37

3.5.2 Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 2 40

3.5.3 Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 3 44

3.5.4 Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 4 46

Phần 4 Kết quả và thảo luận 49

4.1 Ứng dụng kỹ thuật rt-pcr để chẩn đoán phát hiện IBV và nghiên cứu biến đổi bệnh lý IB 49

4.1.1 Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán phát hiện IBV 49

4.1.2 Kết quả nghiên cứu một số biến đổi bệnh lý IB ở gà 55

4.2 Đặc điểm dịch tễ ib ở gà tại một số tỉnh miền bắc Việt Nam 67

4.2.1 Tình hình mắc IB ở gà tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam 67

4.2.2 Xác định một số yếu tố liên quan đến bệnh IB 73

4.3 Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của các chủng IBV phân lập được 82

4.3.1 Phân lập IBV trên trứng gà sạch có phôi 82

4.3.2 Xác định một số đặc tính sinh học của các chủng IBV phân lập được 86

4.4 Phân tích trình tự gen và xây dựng cây phả hệ 91

4.4.1 Phân tích trình tự gen S1 và xây dựng cây phả hệ 91

4.4.2 Phân tích trình tự gen S của các chủng IBV phân lập được từ thực địa 99

4.4.3 Phân tích đặc điểm của các chủng IBV lưu hành ở miền Bắc Việt Nam 107

Phần 5 Kết luận và đề nghị 114

5.1 Kết luận 114

5.2 Đề nghị 114

Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án 116

Tài liê ̣u tham khảo 117

Phụ lục 133

DANH MU ̣C CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

aa Amino acid

BPL Betapropiolactone

BHK-21 Baby hamster kidney-21

CAM Chorioallantois membrane

cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

CEK Chicken embryo kidney

CEL Chicken embryo liver

CI Confidence interval

CK Chicken kidney

CPE Cytopathic effect

EID50 Embryo infection dose 50%

ELD50 Embryo lethal dose 50%

ED50 Embryo (infection or lethal) dose 50%

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

DNA Deoxyribonucleic acid

HI Haemagglutination inhibition

HVR Hypervariable region

IB Infectious bronchitis

IBV Infectious bronchitis virus

IFA Indirect immunofluorescent assay

kb Kilo base

kDa Kilo dalton

MAb Monoclonal antibodies

mRNA Messenger ribonucleic acid

N Nucleocapsid

nt Nucleotide

OIE World organisation for Animal health

ORF Open reading frame

ORT Ornithobacterium rhinotracheale

PCR Polymerase chain reaction

PBS Phosphate-buffered saline

RFLP Restriction fragment length polymorphism

RNA Ribonucleic acid

RNP Ribonucleoprotein

RR Relative risk hay Risk ratio

RT-PCR Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction

sM Small membrane

SPF Specific pathogen free

TAE Tris-acetate-ethylendiamin tetraacetic acid

TOC Tracheal organ culture

UTR Untranslated region

VN Virus neutralization

VNT Virus neutralization test

DANH MU ̣C CÁC BẢNG

3.1 Thành phần của phản ứng PCR 39

3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 39

3.3 Bảng 2x2 về quan hệ yếu tố khảo sát với IB theo đàn 43

4.1 Kết quả chẩn đoán IB bằng phương pháp RT-PCR 54

4.2 Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng chủ yếu của gà mắc IB 57

4.3 Kết quả nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể của gà mắc IB 61

4.4 Sản lượng trứng của gà đẻ mắc IB 62

4.5 Kết quả nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể của gà mắc IB 64

4.6 Tỉ lệ gà mắc IB trên địa bàn nghiên cứu 68

4.7 Tỷ lệ gà mắc IB theo lứa tuổi gà trên địa bàn nghiên cứu 69

4.8 Tỷ lệ gà mắc IB theo mùa trên địa bàn nghiên cứu 71

4.9 Yếu tố nguy cơ về phương thức chăn nuôi 73

4.10 Yếu tố nguy cơ về quy mô chăn nuôi 75

4.11 Yếu tố nguy cơ về tiêm phòng vacxin IB 76

4.12 Yếu tố nguy cơ về nguồn gốc giống 78

4.13 Yếu tố nguy cơ về vị trí trang trại 79

4.14 Yếu tố nguy cơ về vệ sinh chuồng trại 80

4.15 Thông tin về các chủng IBV phân lập được 85

4.16 Kết quả kiểm tra sự thích nghi của các chủng IBV trên phôi gà 86

4.17 Kết quả tổng hợp số phôi chết và số phôi nhiễm IBV ở từng nồng độ gây nhiễm 89

4.18 Kết quả tính EID50/ml và ELD50/ml 90

4.19 Các chủng IBV tham chiếu được sử dụng so sánh với chủng VNUA-HN01 94

4.20 Mức độ tương đồng về nucleotide và amino acid của chủng VNUA-HN01 so sánh với các chủng tham chiếu 95

4.21 So sánh mức độ tương đồng nucleotide và amino acid của gen S của các chủng IBV phân lập ở Việt Nam và các chủng IBV tham chiếu khác 101

DANH MU ̣C CÁC HÌNH

2.1 Hình ảnh IBV trên kính hiển vi điện tử 10

2.2 Tổ chức hệ gen của IBV với các điểm nóng đột biến, mối quan hệ với sự sửa đổi trong glycoprotein spike và nucleoprotein của virus và tầm quan trọng liên quan đến các đặc tính sinh học và miễn dịch học của IBV 12

2.3 Tổ chức bộ gen điển hình của coronavirus gia cầm 20

2.4 Gà bị nhiễm IBV 26

2.5 Bất thường về hình dạng và kích cỡ trứng gà bị nhiễm IBV (a) 27

2.6 Khí quản tiết dịch nhầy, tắc nghẽn và tăng trương lực (a); các vùng tập trung viêm phổi nhẹ (b) 28

2.7 Thận sưng và sung huyết do IBV 29

2.8 Bệnh tích đại thể ở phủ tạng của gà nhiễm IBV (a) tích tụ lòng đỏ trứng trong xoang bụng; (b) gan sưng, nhợt nhạt và dễ vỡ; (c) xuất huyết nhiều trên bề mặt dạ dày tuyến, (d) dạ dày cơ và (e) ruột non 30

2.9 Sự giãn nở của toàn bộ ống dẫn trứng 30

2.10 Bằng chứng về chất tiết niêm mạc của tế bào biểu mô (a) và sự xâm nhập của tế bào lympho trong biểu mô (b) 31

3.1 Thu hoạch nước xoang niệu nang sau khi phân lập IBV trên phôi gà 44

4.1 Kết quả kiểm tra tính bắt cặp nucleotide của cặp mồi với trình tự gen của các IBV trong GenBank - Tóm tắt bằng đồ hoạ 49

4.2 Kết quả kiểm tra tính bắt cặp nucleotide của cặp mồi với trình tự gen của các IBV trong GenBank - Các trình tự tạo ra bắt cặp có ý nghĩa 50

4.3 Kết quả kiểm tra tính bắt cặp nucleotide của cặp mồi với trình tự gen của các IBV trong GenBank - Sự bắt cặp 50

4.4 Kết quả kiểm tra tính bắt cặp nucleotide của cặp mồi với trình tự gen của chủng virus vacxin IB 4-91 51

4.5 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR trong chẩn đoán IB 52

4.6 Kết quả kiểm tra độ nhạy của phản ứng RT- PCR để chẩn đoán IB 53

4.7 Kết quả chẩn đoán IB trên gà bằng phương pháp RT- PCR 54

4.8 Các triệu chứng lâm sàng của gà mắc IB 56

4.9 Bệnh lý đại thể của gà mắc IB (A, B, C, D G, H) và hình dạng trứng gà dị dạng, vỏ lụa, lòng trắng loãng do IB (E, F, I) 60 4.10 Hình ảnh bệnh lý vi thể của gà mắc IB 67 4.11 Kết quả diện di sản phẩm RT-PCR từ các mẫu sau phân lập đời P5 M:Maker 83 4.12 Kết quả gây nhiễm IBV trên phôi gà 84 4.13 Kết quả nhân gen S1 (1.7 kb) của chủng virus ck/VN/VNUA-HN01/2014 bằng phản ứng RT-PCR 92 4.14 Kết quả phân biệt plasmid DNA mang gen S1 (làn 2, 3, và 5) và không mang gen S1 (làn 1, 4, và 6) 93 4.15 So sánh trình tự amino acid giữa chủng IBV ck/VN/VNUA-HN01/2014 với các chủng tham chiếu 96 4.16 Cây phả hệ phân tích mối tương quan giữa gen S1 của chủng IBV ck/VN/VNUA-HN01/2014 với các chủng tham chiếu 98 4.17 Sắp xếp trình tự của các chuỗi amino acid của gen S1 (16 chủng) và gen S2 (8 chủng) 103 4.18 Cây phả hệ được xây dựng dựa trên các trình tự nucleotide của gen S1 105 4.19 Cây phả hệ được xây dựng dựa trên các trình tự nucleotide của gen S2 106 4.20 Cây phả hệ phân tích mối tương quan giữa các chủng phân lập của Việt Nam

và các chủng tham chiếu khác dựa trên trình tự gen S hoàn chỉnh của IBV 108

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Nguyễn Thị Loan

Tên Luận án: Nghiên cứu dịch tễ học bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious

Bronchitis - IB) ở gà nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được các đặc điểm dịch tễ, sự phân bố của các chủng IBV để làm cơ

sở đề xuất các biện pháp phòng chống IB (tiêm phòng vacxin) nhằm tạo điều kiện

cho chăn nuôi phát triển bền vững

- Chẩn đoán, phân lập và khảo sát được đă ̣c tính sinh ho ̣c của IBV gây bệnh tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, giai đoạn 2014–2017

Phương pháp nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu gồm: Các đặc điểm dịch tễ IB và một số đặc tính sinh học của IBV gây bệnh tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, 2014–2017

Luận án sử dụng các phương pháp nghiên cứu dịch tễ học như dịch tễ học mô tả, hồi cứu, thống kê sinh học

Phương pháp mổ khám gà của Thomas Carlyle Jones, phương pháp lấy mẫu theo QCVN 01-83: 2011/BNNPTNT

Phương pháp làm tiêu bản vi thể tẩm đúc bằng paraffin và nhuộm Haematoxylin – Eosin theo quy trình của Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phương pháp phân lập virus trên phôi gà sạch 10 ngày tuổi theo quy trình của OIE (2018)

Phương pháp nghiên cứu các đặc tính sinh học của IBV: gây nhiễm IBV trên trứng

gà sạch SPF và xác định hiệu giá EID50/ml và ELD50/ml bằng phương pháp của Spearman and Karber

Các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng bao gồm: phương pháp RT-PCR và giải trình tự gen Phân tích và so sánh trình tự gen sử dụng phần mềm DNASTAR Lasergene

và BioEdit 6.0 Cây phả hệ được xây dựng dựa vào thuật toán Neighbor-joining algorithms của chương trình PHYLIP suite và phần mềm MEGA 7.0

Kết quả chính và kết luận

- IBV lưu hành thường xuyên ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam (2014 - 2017) với

tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết do IB lần lượt là 14,70% và 2,45% Gà ở giai đoạn ≤ 17 tuần tuổi mắc nhiều nhất (17,57%), tỷ lệ chết cao nhất (7,52%) và tỷ lệ gà mắc IB cao nhất vào mùa đông là 20,50%, tỷ lệ chết 4,23%

- Các yếu tố có liên quan đến bệnh IB bao gồm: phương thức chăn nuôi, quy mô chăn nuôi, tiêm chủng, nguồn gốc giống, vị trí trại và vệ sinh chuồng trại

- Cặp mồi sử dụng trong PCR phát hiện IBV đảm bảo độ nhạy và chính xác cao

- Gà mắc IB có biểu hiện lâm sàng và các biến đổi bệnh tích đặc trưng như: hô hấp khó khăn, sưng đầu, viêm kết mạc, khí quản và phổi xuất huyết, viêm đường hô hấp và sinh sản, thận sưng và lắng đọng urate , đặc biệt là hiện tượng tích dịch trong tử cung

“gà đẻ giả”

- Đã phân lập thành công 10 chủng IBV Các chủng IBV này thích ứng cao và ổn định trên phôi gà, hiệu giá của các chủng IBV dao động từ 104,3- 107,5EID50/ml; EID50/mldao động từ 102,3- 105,5ELD50/ml

- Kết quả phân tích cây phả hệ dựa trên trình tự gen S của 3 chủng virus HN01, VNUA-TN08 và VNUA-HP11 phân lập được trong nghiên cứu này thuộc về 3 kiểu gen khác nhau là Q1-like, QX-like và TC07-2-like Khi so sánh về trình tự nt và aa của gen S cho thấy các chủng virus IB trong nghiên cứu này có mức độ tương đồng thấp khi so sánh với các chủng virus vacxin (H120, Ma5 và 4/91) đang lưu hành trên thị trường Việt Nam

VNUA-THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Nguyen Thi Loan

Thesis title: Research on epidemiologic characteristics of infectious bronchitis in chicken

in some Northern provinces of Vietnam

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

- Identifying epidemiological characteristics as well as distribution of IBV strains

as the basis for proposing measures to prevent IB (vaccination) to facilitate sustainable development of livestock

- Diagnose, isolate and survey biological characteristics of IBV that caused disease

in chicken in some Northern provinces of Vietnam during the 2014–2017 period

Materials and Methods

Research contents include: epidemiological characteristics of IB and some biological characteristics of IBV strains isolated in some Northern provinces of Vietnam during the period from 2014 to 2017

Methods used in the present study include: epidemiological methods such as descriptive epidemiology, retrospective study, and biological statistics

- Chicken nescropsy was performed according to Thomas Carlyle Jones’s method and sampling method was based on TCVN 01-83: 2011/BNNPTNT

- Method of making microscopic specimens impregnated with paraffin and Haematoxylin - Eosin staining was done according to the protocol developed by Department of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Vietnam National University of Agriculture

- Isolation method of IBV on 10-day-olds pathogen-free embryonated chicken eggs was done according to the protocol of OIE (2018)

- Methods for studying of biological characteristics of IBV: IBV was inoculated into 10-day-olds pathogen-free embryonated chicken eggs, and EID50/ml and ELD50/ml of IBV were titrated according to the method of Spearman and Karber

- Molecular methods used in the study including RT-PCR and gene sequencing Genetic analysis and comparison were conducted using DNASTAR Lasergene and BioEdit 6.0 software Phylogenetic tree were constructed basing on the Neighbor-joining algorithms

of the PHYLIP suite and the MEGA 7.0 software

Main findings and conclusions

- IBVs have been circulating regularly in some Northern provinces of Vietnam (2014

- 2017) with the morbidity and mortality rates of 14.70% and 2.45%, respectively Chickens

in the period of ≤17 weeks of age were the most susceptible age to the IB with morbidity and mortality rates of 17.57% and 7.52%, respectively Winter was the most severe season

with morbidity and mortality rates of 20.50 and 4.23%, respectively

- Factors related to IB including breeding mode, scale of breeding, vaccination, breeder origin, farm location and sanitation

- Primers were used in PCR method has been applied successfully for IBV detection, giving sensitive and accurate results

- The chicken disease caused by IBV has typical symptoms and lesions such as dyspnea, facial swelling, conjunctivitis, tracheal and pulmonary hemorrhage, inflammed respiratory and reproductive tracts, kidney swelling and deposits of urate…, especially the phenomenon of stagnant fluid in the uterus "false layer"

- 10 IBV strains have been isolated successfully IBVs have high adaptability and stability on chicken embryos EID50 and ELD50/ml of isolated IB virusesranged from 104.3-

107.5EID50/ml and from 102.3- 105.5ELD50/ml, respectively

- Genetic and phylogenetic analysis based on the S gene of IBV showed that 3 IBV strains of VNUA-HN01, VNUA-TN08 and VNUA-HP11 isolated in the present study belonged to three different genotypes Q1-like, QX-like and TC07-2-like The results of nucleotide and amino acid comparison based on S gene showed that the present Vietnamese IBV strains had a low degree of similarity with vaccine strains (H120, Ma5 and 4/91) available in Vietnam

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Thịt gia cầm là một nguồn protein ngày càng có vai trò quan trọng trong cuộc sống hàng ngày Trên thế giới, sản lượng thịt gia cầm tăng 16% kể từ năm 1995

Ở các nước đang phát triển, mức tăng có thể đến 77% (Anon, 2006) Theo số liệu của Tổng cục Thống kê và giá thực tế, ngành chăn nuôi Việt Nam đang có sản lượng thịt gia cầm đứng thứ 2 khu vực ASEAN trong đó gà chiếm chủ yếu Tuy ngành công nghiệp chăn nuôi gà đang ngày càng phát triển nhưng vẫn còn gặp không ít khó khăn nhất là vấn đề dịch bệnh trong đó phải kể đến bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà (IB - Infectious Bronchitis) IB là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan nhanh và gây thiệt hại kinh tế nặng nề, không những vậy do tính chất phức tạp của mầm bệnh, virus gây bệnh có nhiều serotype,

dễ biến đổi nên bệnh rất khó kiểm soát Những vụ dịch vẫn xảy ra thường là kết quả của sự lây nhiễm với các chủng khác về serotype so với các chủng vacxin

(Wang et al., 1996) Vacxin sống đã được phát triển để chống lại một số serotype mới của IBV (Bande et al., 2015) Tuy nhiên, do ngày càng có nhiều biến chủng

IBV mới xuất hiện khiến cho việc khống chế bệnh vẫn còn là một vấn đề nan giải

Vì vậy việc điều tra dịch tễ học IB, nghiên cứu và tìm ra những serotype IBV phổ biến lưu hành trong mỗi khu vực là rất quan trọng trong công tác kiểm soát bệnh Tuy nhiên từ trước tới nay, câu hỏi về đặc điểm dịch tễ học IB, các serotype IBV lưu hành ra sao ở Việt Nam vẫn còn chưa có câu trả lời cụ thể và thỏa đáng

Để có thêm thông tin về các chủng IBV đang lưu hành, sự phân bố của IB ở Việt Nam, đặc biệt là ở các tỉnh phía Bắc nơi các đàn gà tập trung chủ yếu (chiếm tới 75% đàn gà cả nước), nghiên cứ u các đă ̣c tính sinh ho ̣c cũng như sinh học phân

tử củ a mầm bê ̣nh, tìm ra các yếu tố nguy cơ liên quan đến dịch IB nhằm kiểm soát bệnh, nâng cao hiệu quả chăn nuôi, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài này

Đề tài nghiên cứu nhằm giải đáp một số câu hỏi về các vấn đề gồm:

Việt Nam;

- Đặc điểm bệnh lý IB và các yếu tố nguy cơ liên quan;

- Đặc tính sinh học và sinh học phân tử của những chủng IBV hiện đang lưu hành trên khu vực nghiên cứu

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xác định được các đặc điểm dịch tễ, sự phân bố của các chủng IBV để làm cơ sở đề xuất các biện pháp phòng chống IB (tiêm phòng vacxin) nhằm

tạo điều kiện cho chăn nuôi phát triển bền vững

- Chẩn đoán, phân lập và khảo sát được đă ̣c tính sinh ho ̣c của IBV gây bệnh tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, giai đoạn 2014–2017

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các đàn gà nuôi tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam;

- Các chủng IBV phân lập được từ các đàn gà mắc IB

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Khảo sát dịch bệnh IB tại 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam trên cơ sở xác định lâm sàng, giám định bệnh lý và phân tử, khẳng định IBV thường xuyên lưu hành và có

tỷ lệ mắc và chết đáng quan tâm trong đàn gà nuôi hướng trứng

- Đã phân lập được 10 chủng IBV, xác định được đầy đủ các đặc tính sinh học, virus học của 3 chủng cường độc là VNUA-HN01, VNUA-TN08 và VNUA-HP11 Xác định 3 chủng này thuộc 3 nhóm di truyền là Q1-like, QX-like và TC07-2-like, có quan hệ gần gũi nguồn gốc và dịch tễ học với Trung Quốc

- Khẳng định dịch bệnh IB vẫn xảy ra ở đàn có vacxin nếu không có kháng nguyên tương đồng giữa chủng vacxin và chủng cường độc lưu hành

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Luận án đã phân tích, đánh giá và chỉ ra một số đặc điểm dịch tễ học mô tả của bệnh IB tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam: tỷ lệ lưu hành bệnh, đặc điểm lưu hành bệnh theo độ tuổi gà và theo mùa vụ Xác định được một số yếu tố có liên quan đến sự lưu hành bệnh IB trên gà

- Xác định được 10 chủng IBV lưu hành trên địa bàn nghiên cứu; khi phân tích, đánh giá chuyên sâu về mặt di truyền cho thấy 3 chủng IBV phân lập được thuộc 3 kiểu di truyền khác nhau, các chủng này đều có mức tương đồng thấp với các chủng vacxin IB hiện đang lưu hành trên thị trường

- Luận án là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho những nghiên cứu khoa học tiếp theo về IB, IBV và là tư liệu tham khảo cho giảng dạy trong chuyên ngành thú

y

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Khẳng định dịch bệnh IB vẫn xảy ra ở đàn có vacxin nếu không có kháng nguyên tương đồng giữa chủng vacxin và chủng cường độc lưu hành

- Phân lập thành công 10 chủng IBV và khảo sát đặc tính virus học qua nuôi cấy trên phôi gà 10 ngày tuổi, trong đó có chủng có thể phát triển thành chủng vacxin ứng dụng trong thực tế

- Kết quả của luận án là cơ sở khoa học cần thiết và sát với thực tế để người chăn nuôi, cũng như các nhà quản lý hiểu rõ hơn và đề ra các giải pháp phòng, chống IB hiệu quả hơn

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ

IB là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở gà do virus thuộc nhóm Coronavirus gây ra, dễ lây lan qua tiếp xúc với những triệu chứng đặc trưng ở đường hô hấp như: ho, hắt hơi và có tiếng ran khí quản Ngoài ra, bệnh có thể gây ảnh hưởng đến thận, gây viêm thận cấp hoặc mạn tính, gây chảy nước mũi ở gà con và gây ảnh hưởng rất lớn đến sản lượng và chất lượng trứng ở đàn gà đẻ (Cavanagh and Gelb, 2008)

Hậu quả kinh tế IB để lại đối với ngành công nghiệp gia cầm rất lớn:

+ Đối với gà nuôi hướng thịt: gà thịt gầy do chuyển đổi thức ăn kém và giảm

tỷ lệ tăng trưởng (King and Cavanagh, 1991) gây thiệt hại kinh tế lớn

+ Ảnh hưởng tới gà nuôi lấy trứng thương phẩm hoặc sản xuất con giống:

bên cạnh việc gây nhiễm trùng đường hô hấp, IB có thể ảnh hưởng đến sản lượng

trứng (Cavanagh et al., 1998) Broadffoot et al (1956) đã tìm ra bằng chứng chứng

minh sự phá hủy vĩnh viễn ở ống dẫn trứng của gà dưới 2 tuần tuổi bị nhiễm IBV, những gà này đến giai đoạn đẻ sẽ không đẻ được hoặc gây giảm sản lượng trứng Ngoài việc giảm sản lượng trứng, chất lượng trứng cũng bị giảm mạnh ở những đàn gà nhiễm bệnh do đó ảnh hưởng đến tỷ lệ nở (Cavanagh and Naqi, 2003) Mặc dù áp dụng các vacxin IB sống và vô hoạt nhưng bệnh vẫn tiếp tục xảy

ra Để kiểm soát bệnh hiệu quả cần hiểu sâu rộng về đặc điểm gây bệnh, đặc tính sinh học cũng như sinh học phân tử của các chủng IBV đang lưu hành trong khu vực, các nhân tố ảnh hưởng đến sự lây lan bệnh…

2.1.1 Lịch sử bệnh viêm phế quản truyền nhiễm trên thế giới

IB được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1930 ở Dakota, nước Mỹ Báo cáo đầu tiên về triệu chứng lâm sàng IB là của Schalk and Hawn (1931) Đến năm 1936, Beach and Schalm (1936) đã phát hiện ra virus căn nguyên, xác định bệnh lý học của virus Năm 1937, Beaudette and Hudson lần đầu tiên nuôi cấy virus trên phôi gà Lúc đầu, IB được coi như một bệnh chủ yếu ở gà con Tuy nhiên, sau này nó lại được biết đến như một bệnh phổ biến trên đàn gà hậu bị và gà đẻ Một biểu hiện khác của bệnh IB bao gồm mất khả năng đẻ trứng của đàn gà và có các triệu chứng điển hình của bệnh hô hấp cũng đã được ghi nhận những năm 1940; virus gây tổn thương ở thận được ghi nhận vào những năm 1960 Đứng trước sự lưu hành và những ảnh hưởng

nghiêm trọng của IB đến nền kinh tế quốc dân, nhiều quốc gia đã đưa ra những chiến lược nhằm ngăn chặn và khống chế bệnh này Trong đó đặc biệt quan tâm đến việc kiểm soát sự bùng phát của bệnh trong giai đoạn phát triển của gà trước khi virus gây giảm sản lượng trứng Biện pháp này đã được Van Roekl thực hiện vào năm 1941 và đã đạt được những thành công bước đầu, tạo tiền đề cho chương trình miễn dịch được sử dụng ngày nay (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2013)

Năm 1956, theo báo cáo của Jungherr et al (1956) thì 2 chủng virus Connecticut

(phân lập vào năm 1951) và chủng Massachusetts (phân lập năm 1941) gây bệnh tương

tự nhau nhưng không gây miễn dịch chéo hoặc không có khả năng bảo hộ chéo cho nhau Báo cáo của Jungherr lần đầu tiên đã chứng minh được căn nguyên gây bệnh IB

có nhiều hơn một serotype

Bệnh phân bố khắp nơi trên thế giới Ở Mỹ, ngoài type Massachusetts (Mass) lần đầu tiên được phân lập vào những năm 1950, một số serotype cũng được phát hiện Những năm 1940, type Mass cũng được phân lập ở Châu Âu Một số serotype được phân lập ở Bắc Mỹ, châu Phi, châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật, Hàn Quốc); Úc và châu Âu Bệnh thường xuyên xảy ra ở những đàn gà mặc dù đã sử dụng vacxin phòng bệnh Virus phân lập từ những vụ dịch đó thường khác với type virus vacxin

Những năm sau đó càng có nhiều nghiên cứu hơn về IB và IBV, Cavanagh

(1984) đã mô tả những đặc điểm cấu trúc của các glycoprotein của IBV Otsuki et

al (1990) đã so sánh tính nhạy cảm giữa 2 dòng gà lai của gà Lơgo trắng đối với

IBV Ramneek et al (2005) đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR, giải và phân tích trình

tự gen để phát hiện nhanh và xác định đặc điểm của IBV từ New Zealand

Năm 2008, Mase et al (2008) đã báo cáo phân tích đa dạng di truyền của IBV ở Nhật Bản dựa trên phân tích gen glycoprotein S2 Mardani et al (2008) đã

báo cáo về IBV với một tổ chức bộ gen mới, vùng 3’ 7,5kb của bộ gen của 17 chủng IBV ở Úc đã được giải trình tự và so sánh với 6 chủng nổi bật khác cho thấy

tổ chức bộ gen của các chủng mới ở Úc này có tổ chức bộ gen như sau: X1-E-M-N-UTR-3’ hoặc 5’-Pol-S-X1-E-M-5b-N-UTR-3’

5’-Pol-S-Những năm gần đây, IB và IBV càng được quan tâm nhiều hơn và có nhiều

nghiên cứu về IB và IBV đã được báo cáo Pohuang et al (2009) đã báo cáo phát

hiện và mô tả đặc điểm phân tử của các IBV phân lập được ở các vụ dịch gần năm

đó ở gà thịt ở Thái Lan Ren et al (2009) đã báo cáo về đặc điểm và phân tích phát

sinh dòng dựa trên gen M của IBV HH06 ở Trung Quốc Cũng trong năm này, Liu

et al (2009) đã báo cáo đánh giá sự bảo vệ bởi các vacxin thương mại và các phân

lập nhược độc tương đồng ở Trung Quốc chống lại chủng IBV CK/CH/LDL/97I

Năm 2010 cũng đã có nhiều nghiên cứu về IBV như nghiên cứu của Mase et

al (2010) đã báo cáo một kiểu gen IBV mới đã được phân lập ở Nhật Bản vào năm

2009 Montassier (2010) đã có báo cáo dịch tễ học phân tử và sự phát triển của

virus viêm phế quản truyền nhiễm ở gia cầm ở Braxin Seifi et al (2010) đã báo

cáo sự đồng nhiễm tự nhiên gây nên bởi virus cúm gia cầm phân type H9 và virus

viêm phế quản truyền nhiễm ở các trang trại gà thịt Nghiên cứu của Li et al (2010)

đã báo cáo sự phân lập và phân tích di truyền học cho thấy không có chủng mới nổi trội nào của IBV lưu hành ở miền Nam Trung Quốc trong những năm 2004

đến năm 2008 Năm 2010, Chen et al (2010) đã xác định được các IBV tái tổ hợp intertypic từ những con gà được giết mổ ở Trung Quốc Gaba et al (2010) đã phân

lập, xác định và mô tả đặc tính phân tử của biến thể IBV từ vụ dịch của bệnh gout nội tạng ở những gà thịt thương phẩm

Ji et al (2011) đã báo cáo phân loại phát sinh dòng và tổng hợp kiểu gen chiếm ưu thế của IBV ở Trung Quốc 2008-2009 Han et al (2011) đã có báo cáo

phân tích miễn dịch học phân tử 15 năm của các coronavirus ở Trung Quốc

Pohuang et al (2011) đã báo cáo phân tích trình tự của gen S1 của IBV phân lập

ở Thái Lan trong năm 2008-2009 và xác định sự tái tổ hợp tự nhiên trong những

phân lập thực địa Cũng trong năm 2011 này, Toffan et al (2011) đã báo cáo phát

hiện chủng IBV Q1 của Trung Quốc ở Châu Âu

Dolz et al (2012) đã báo cáo những hiểu biết mới về sinh bệnh học viêm phế

quản truyền nhiễm, cụ thể là đặc tính của serotype Italy 02 gây bệnh ở gà con và

gà trống trưởng thành Ababneh et al (2012) đã nghiên cứu và báo cáo sự hiện

diện của chủng IBV CK/CH/LDL/97I ở Trung Đông, chủng này được biết đến có

nguồn gốc từ Trung Quốc và Đài Loan Feng et al (2012) đã báo cáo tính độc lực

của IBV, chủng YN ở Trung Quốc, chủng này khi gây nhiễm vào gà 30 ngày tuổi SPF gây ra những tổn thương nghiêm trọng và dẫn đến tỉ lệ tử vong ở mức 65%

Ngoài ra, còn có báo cáo của Lim et al (2012) cho thấy rằng vacxin IB

nephropathogenic sống nhược độc có thể cung cấp sự bảo vệ chéo rộng chống lại

các chủng biến thể mới Luo et al (2012) đã phân tích phát sinh loài trên gen

glycoprotein S1 của những IBV phân lập ở Trung Quốc trong năm 2009 và 2010

Năm 2013, Jahantigh et al (2013) đã phát hiện được các serotype IBV bằng phản ứng RT-PCR ở gà thịt Năm 2014, Feng et al (2014) đã báo cáo phân tích từ

gen S1 của IBV phân lập ở miền Nam Trung Quốc trong năm 2011 và 2012

Năm 2015, Ganapathy et al (2015) đã báo cáo kiểu gen của các IBV lưu

hành ở Trung Đông trong những năm từ 2009 đến 2014 Cũng năm 2015, Fellahi

et al (2015) đã phân tích phát sinh loài dựa trên vùng glycoprotein S1 của IBV và

cho thấy sự nổi lên của 1 kiểu gen mới ở những đàn gà thịt ở Marốc Zou et al

(2015) đã báo cáo 2 epitope kháng nguyên trung hòa mới của protein tiểu đơn vị S1 của chủng IBV QX-like Sczy3 bằng cách sử dụng 1 thư viện peptide hiển thị thể thực khuẩn

Năm 2016 cũng đã có nhiều nghiên cứu về IB và IBV Umar et al (2016) đã báo cáo sự tiến hóa và chủng ngừa đối với IBV Valastro et al (2016) đã báo cáo

phát sinh học dựa trên gen S1 của IBV và thử nghiệm phù hợp với việc phân loại

IBV Xia et al (2016) đã phân tích phát sinh loài và kháng nguyên của IBV gây

bệnh trên gia cầm ở Tây Nam Trung Quốc từ 2012 - 2016

Năm 2017, Faruku et al (2017) đã nêu ra đánh giá về sự phân bố toàn cầu

và sự đa dạng của các chủng IBV Zhao et al (2017) đã nghiên cứu và báo cáo

về nguồn gốc và sự phát triển của coronavirus viêm phế quản truyền nhiễm kiểu gen LX4 ở Trung Quốc

2.1.2 Tình hình bệnh và những vấn đề nghiên cứu về bệnh Viêm phế quản

truyền nhiễm ở Việt Nam

Ở Việt Nam, IB ở gà được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1996 Từ đó đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về bệnh, tuy nhiên hầu hết những nghiên cứu này chỉ tập trung vào lĩnh vực bệnh lý; xác định đặc tính của mầm bệnh và vacxin phòng bệnh Có rất ít nghiên cứu đặc điểm dịch tễ của bệnh một cách có hệ thống và trên quy mô lớn

Những nghiên cứu đầu tiên đã tập trung vào nghiên cứu IB trên gà và sự ảnh

hưởng của nó đến sự sản xuất của gà như: nghiên cứu của Bui Tran Anh Dao et al

(2001) đã thử nghiệm 2 chương trình vacxin (chương trình 1: vacxin sống nhược độc; chương trình 2: vacxin sống nhược độc kết hợp với vacxin vô hoạt) với 3 bệnh Newcastle, Gumboro và IB; kết hợp thử nghiệm cùng với 2 loại thức ăn (công nghiệp và phi công nghiệp) trên 4997 con gà tại thành phố Hồ Chí Minh chia thành

4 nhóm, kết quả cho thấy đối với IB, động lực học của các kháng thể chống lại

virus không có sự khác biệt đáng kể giữa các lô vào ngày 21 và ngày 50 sau khi chủng ngừa, tuy nhiên vào ngày 30, có sự khác biệt đáng kể giữa tất cả các lô, đối với các lô áp dụng chương trình vacxin 1 thì kháng thể giảm ở ngày 30 so với ngày

21, còn đối với các lô áp dụng chương trình vacxin 2, tốc độ tăng trưởng kháng thể chậm từ ngày 21 đến ngày 30; từ đó cho thấy áp dụng chương trình vacxin 2 cùng với cho ăn thức ăn công nghiệp đem lại hiệu quả tốt hơn

Đến năm 2000, Trần Thanh Vân (2000) đã chứng minh được sự hiện diện của 2 biến chủng IBV mới 4/91 và CR88 và cho thấy tỷ lệ gà chết tăng và sản lượng trứng giảm do 2 biến chủng này gây nên trên đàn gà bố mẹ giống thịt

Hubbard High - Yield tại trại Ando và Bắc Sơn Về sản lượng trứng: lô khảo sát

tại trại Ando chịu ảnh hưởng bởi biến chủng IBV 4/91 nhưng không nghiêm trọng bằng ảnh hưởng của biến chủng IBV CR 88 tới lô khảo sát tại trại Bắc Sơn Về năng suất trứng ấp: tỷ lệ nở của lô khảo sát tại trại Ando hầu như không giảm trong khi đó tỷ lệ nở của lô khảo sát tại trại Bắc Sơn giảm nghiêm trọng Về tỷ lệ chết:

tỷ lệ chết ở lô khảo sát cao gấp đôi lô đối chứng đối với kiểu nhà nuôi kín và cao hơn 50% đối với kiểu mở, lô khảo sát ở kiểu kín có tỷ lệ chết cao hơn ở kiểu mở 89%

Sau này cũng có những nghiên cứu, thử nghiệm về vacxin phòng IB như: Nguyễn Hồng Minh (2013) đã nghiên cứu, sản xuất và thử nghiệm vacxin nhược độc đồng khô đa giá phòng 3 bệnh là Newcaste, gumboro và IB ở gà Võ Thị Trà

An và Nguyễn Thị Kim Yến (2014) đã báo cáo, so sánh về những hiệu quả phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm của 3 quy trình tiêm chủng vacxin trên gà ở

4080 con gà lấy thịt đã được chủng ngừa với IB H120 ở 1 ngày tuổi với hiệu quả phòng bệnh tốt hơn với những lô gà được tái tiêm chủng với vacxin IB 4/91 và IB

88 ở 14 ngày tuổi so với lô gà không được tái tiêm chủng

Ngoài những nghiên cứu về bệnh lý và vacxin phòng bệnh, đã có những nghiên cứu tập trung vào đặc tính mầm bệnh như: Võ Thị Trà An và cs (2012) đã phân lập virus từ 100 mẫu bệnh tích khí quản sung huyết hoặc có dịch nhầy ở tại các trại gà công nghiệp tỉnh Lâm Đồng cho thấy 54% mẫu cho bệnh tích phôi lùn, phát hiện IBV bằng RT-PCR cho 9/54 mẫu dương tính với gen S của IBV và giải trình tự gen cho thấy 4 mẫu tương đồng với serotype 793B dòng 4/91 và 1 mẫu

tương đồng với serotype Mass dòng H120 Tran Ngoc Bich et al (2017) cũng đã

phân lập 5 chủng IBV trên phôi gà và cho các bệnh tích phôi đặc trưng của IBV, phân tích trình tự gen và xây dựng cây phả hệ của 5 chủng này cho thấy chúng

phân thành 3 nhóm: nhóm 1 gồm 3 chủng tương đồng 99% với kiểu gen 793B; nhóm 2 tương đồng 98% với kiểu gen QX-like; đặc biệt nhóm 3 tương đồng 99%

so với một phân lập nephropathogenic của Malaysia và có khoảng cách di truyền 8-10% so với các chủng khác

Nhìn chung, những nghiên cứu trong nước về IB còn tương đối ít và nghiên cứu trên từng khía cạnh riêng của bệnh như về đặc điểm gây bệnh, về vacxin phòng bệnh, về đặc tính của mầm bệnh chưa có nghiên cứu hệ thống nào về dịch tễ học của IB tại Việt Nam

2.2 ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA IBV

2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại

IBV thuộc họ Coronaviridae, gồm có hai giống là Coronavirus và Torovirus IBV thuộc nhóm 3 của giống Coronavirus với kháng nguyên đa dạng, vì vậy có

rất nhiều chủng được xác định như: Massachusets, Arkansats 99, Connecticut, O72… IBV có khả năng biến chủng rất cao, và là bệnh đang rất được quan tâm trên toàn thế giới

2.2.1.1 Đặc điểm hình thái

IBV có hình tròn hoặc đa hình thái có đường kính 50 - 220nm với các gai hình chùy nhô ra bề mặt dài khoảng 20nm (Cavanagh and Naqi, 2003) Những gai

này không xếp khít nhau như những gai hình roi của Paramyxovirus Vỏ virion

bao gồm các phospholipid, glycolipid, cholesterol, di- và tri- glycerides và axit béo

tự do (Cavanagh, 1983) Bên trong lớp vỏ có những nucleocapsid hình ống, đối xứng xoắn và mang thông tin di truyền Cấu trúc lõi (ribonucleoprotein) được giải phóng ra từ những phân tử bị phá vỡ tự nhiên có thể quan sát được thông qua độ bóng, nhưng không bắt màu Trong hầu hết các trường hợp, ribonucleoprotein

(RNP) được quan sát như một sợi tơ có đường kính khoảng 1–2 nm (Davies et al.,

1981), nhưng khi ở dạng cấu trúc cuộn cô đặc xoắn ốc có thể quan sát được đường kính khác nhau từ 10 – 20 nm (McMartin, 1993) Đầu nhọn này không giống với

dạng đầu que của nhóm Paramyxovirus Nhân của IBV có cấu tạo là RNA sợi đơn,

7x106 dalton (Cavanagh, 2000)

Hình 2.1 Hình ảnh IBV trên kính hiển vi điện tử

Nguồn: Cook (1983)

Các chủng IBV khác nhau về tỷ trọng (gradient) đường Tỷ trọng đường trong cấu tạo phân tử của các chủng virus thường từ 1,15 – 1,18 g/ml Dựa vào đặc điểm này, Macnaughton and Davies (1980) đã chia IBV làm hai loại:

- Loại thứ nhất: là những virus có tỷ trọng đường cao 1,18 g/ml, những loại này thường có cấu trúc polypeptid và có bộ gen hoàn chỉnh, đồng thời có hình thái điển hình của coronavirus

- Loại thứ hai: là những virus có tỷ trọng đường thấp hơn  1,13 g/ml, những loại virus này cũng có hình thái của coronavirus nhưng không điển hình, trong cấu trúc phân tử thiếu polypeptit ribonucleoprotein và hệ gen

2.2.1.2 Cấu trúc kháng nguyên của IBV

Virion của IBV có 3 protein đặc hiệu chính là: protein gai: S (Spike); protein màng: M (Membrane) và protein nhân: N (Nucleocapsid) Ngoài ra, còn có loại protein thứ tư (hay còn gọi là protein màng nhỏ sM hay E) được xác định là protein liên kết với lớp vỏ virion (Cavanagh and Naqi, 2003)

Protein S: Spike của IBV được hình thành bởi sự phân cắt theo sau của hai thành phần polypeptit riêng biệt, được gọi là S1 và S2 (Cavanagh, 1983) Glycoprotein S1 có liên quan đến sự gắn kết virus và là một mục tiêu chính của

kháng thể trung hòa ở gà Serotype của IBV được xác định bởi gen S, đặc biệt là gen S1 biến đổi

Protein nucleocapsid N và protein M tương tác với RNA hệ gen Protein N của IBV là protein ưu tiên sử dụng trong việc phát triển các xét nghiệm huyết thanh theo nhóm đặc hiệu và được sản xuất dồi dào trong suốt quá trình nhiễm bệnh, có tính miễn dịch cao, dễ gây kháng thể và miễn dịch độc tế bào T-lymphocyte ở gà

(Gibertoni et al., 2005) Protein N phổ biến trong tế bào bị nhiễm bệnh (Spencer

and Hiscox, 2006) và hầu hết protein N nằm ở bên trên với trọng lượng phân tử

52000 dalton (Cavanagh, 1983) Protein N là một phosphoprotein chứa 409 amino

acid, và được bảo tồn tốt (Williams et al., 1992), quan trọng đối với miễn dịch trung gian tế bào (Seo et al., 1997) Nó tạo thành một lớp bảo vệ đóng gói RNA

gen virus và được cho là tham gia vào việc sao chép và dịch mã RNA Theo Fan

et al (2005), sự đóng gói đặc hiệu của vật liệu di truyền virus thường được thực

hiện thông qua việc nhận biết một trình tự nucleotide đặc biệt bằng một protein nucleocapsid

Protein M, một protein polytopic (protein nhiều vùng, nhiều nơi ở), là thành phần dồi dào nhất của coronavirions (Rottier, 1995) Khi được tổng hợp mà không

có các thành phần virus khác, protein M có xu hướng tích tụ trong phức hợp Golgi

là các cấu trúc polyme không tan, có lẽ đây là một phần cơ chế lưu giữ của nó

(Locker et al., 1995) Protein M như là thành phần thúc đẩy chính đóng vai trò trong sự kích thích interferon (Baudoux et al., 1998) Sự giải phóng các protein M

và E cho phép hình thành các hạt giả, có hoạt tính interferogenic tương tự như các

virion hoàn chỉnh (Baudoux et al., 1998) Protein M của coronavirus là một protein

cấu trúc màng và đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổ hợp virus Một phần Glycoprotein M ở bề mặt của virion không được bảo vệ với phạm vi trọng lượng phân tử từ 27-36 kDa (Cavanagh, 1983)

Do đó, sự biến đổi gen S1 và N được cho là có ý nghĩa quyết định đối với sự xuất hiện của các biến thể do vai trò của chúng trong quá trình sao chép và miễn dịch virus, và vì thế các gen S1 và N và các protein có nguồn gốc từ 2 gen này được sử dụng thường xuyên hơn để xác định mối quan hệ của các IBV

Hình 2.2 Tổ chức hệ gen của IBV với các điểm nóng đột biến, mối quan hệ với sự sửa đổi trong glycoprotein spike và nucleoprotein của virus và tầm quan trọng liên quan đến các đặc tính sinh học và miễn dịch học của IBV

Nguồn: Montassier (2010)

Gần đây, người ta gợi ý rằng protein IBV phụ 5b có một chức năng tương đương với nsp1 của coronavirus Alpha- và Beta và không thể thiếu cho việc hạn chế sản xuất interferon bằng cách gây ra một sự ngừng vật chủ, đóng một vai trò quan trọng trong đối kháng phản ứng miễn dịch bẩm sinh của vật chủ, do đó nó có

thể là một yếu tố độc lực virus quan trọng của IBV (Kint et al., 2016)

2.2.1.3 Phân loại

Tyrrell et al (1968) đã quan sát bằng kính hiển vi điện tử và phát hiện ra

những phần tử virus không bắt màu và chỉ ra những cảm thụ quan trên bề mặt virus giống như vầng hào quang Do vậy coronavirus được đề nghị đặt tên cho IBV và những virus có hình thái tương tự được xếp vào nhóm này

IBV ở gà được phân loại lần đầu tiên vào năm 1970 (Cunningham, 1970)

Tyrrell et al (1975) đã xác định IBV là một thành viên của giống Coronavirus, họ

Coronaviridae Năm 1994, Cavanagh et al (1994) xem xét lại sự phân loại của

các giống Coronavirus, Torovirus và Arterivirus và đã xác định IBV ở gà, gà tây

và ít nhất 9 loài của động vật có vú tạo thành giống Coronavirus, họ

Coronaviridae, bộ Nidovirales Tuy nhiên, IBV ở gà khác hoàn toàn với Coronavirus ở gà tây về trình tự protein và đặc tính kháng nguyên

Năm 2000, một số tác giả đã xác định họ Coronaviridae bao gồm 2 giống là

Coronavirus và Torovirus IBV được xếp vào nhóm 3 của giống Coronavirus, 2 nhóm

khác là các Coronavirus ở động vật có vú Hai nhóm này khác hoàn toàn với IBV về

tổ chức kiểu gen và trình tự gen (Cavanagh, 2000) Gần đây, một số chủng

Coronarvirus phân lập từ gà tây được chứng minh là có mối liên quan chặt chẽ với

IBV và cũng được xếp vào nhóm 3 của giống Coronavirus (Cavanagh, 2001)

Đến năm 2011, Ủy ban quốc tế về phân loại virus (International Committee

on Taxonomy of Viruses) đã loại 18 loài thuộc họ phụ Coronavirinae và IBV vào giống gammacoronarvirus, IBV gây bệnh ở bồ câu và gà tây không nằm cùng trong họ này nữa (King et al., 2011)

IBV đang hiện diện trên toàn thế giới Ở Mỹ, nhiều serotype được xác định

từ những năm 1950 (Fabricant, 1998), ngoài type Massachusetts Các type Mass được xác định và phân lập ở Châu Âu vào những năm 1940 (Cavanagh and Davis, 1993), những serotype nổi bật khác được phân lập ở Châu Phi, Châu Á (Trung

Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc) (El Houadfi et al., 1986; Lin et al., 1991; Chen et al., 1997; Wang et al., 1997; Pan et al., 1998; Rajeswar et al., 1998; Song

et al., 1998), Úc (Ignjatovic et al., 1997) và Châu Âu (Cavanagh and Davis, 1993;

Kant et al., 1992) Trong vài năm gần đây, một trong những kiểu gen IBV nổi bật

nhất lưu hành trong những đàn gà trên toàn thế giới được cho là chủng LX4 (còn

gọi là QX-like) (Liu and Kong, 2004; De Wit et al., 2011; Jackwood, 2012) Kiểu

gen LX4 được bắt nguồn từ giữa những năm 1990 ở Trung Quốc (Liu and Kong, 2004) Sau đó là kiểu gen nổi bật lưu hành trong những đàn gà ở Trung Quốc (Han

et al., 2011) Gần đây, sự phổ biến của kiểu gen này đã được báo cáo ở nhiều nước

Châu Âu và Châu Á (De Wit et al., 2011; Jackwood, 2012; Promkuntod, 2016)

Kiểu gen LX4 đang trở thành một trong những kiểu gen quan trọng nhất của IBV gây tổn thất kinh tế lớn ở các đàn đã được tiêm vacxin IB ở nhiều nước trên thế

giới (De Wit et al., 2011) Dường như kiểu gen này vẫn có thể lây lan nhanh giữa

các đàn gia cầm nhạy cảm ở các nước khác trên thế giới

a Phân loại IBV bằng phản ứng huyết thanh học

Theo truyền thống, phân loại IBV thành các serotype được thực hiện bởi

VNT trong trứng có phôi (Capua et al., 1998), nuôi cấy tế bào (Hopkins, 1974), hoặc TOCs (Wang et al., 1997) Một nhân tố phức tạp trong việc phát hiện các

serotype khác nhau là những phản ứng chéo có thể xuất hiện sau khi nhiễm IBV

trong những gia cầm mà đã tiếp xúc với nhiều hơn một serotype (Cavanagh et al., 1992b; De Wit et al., 1997)

Việc phân loại các chủng IBV bằng phản ứng HI cũng đã được tiến hành

(Capua et al., 1998) Các kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu sinh ra rất sớm,

ngay từ lần gây nhiễm đầu tiên và có sự đặc hiệu chủng rất cao Phản ứng HI được tiến hành đối với những chủng có đặc tính nhiễm chéo cao, dễ biến chủng

b Phân loại dựa vào kháng thể đơn dòng

Các kháng thể đơn dòng (MAb) đã được tạo ra kháng lại một số chủng virus

có nguồn gốc Bắc Mỹ như Massachusetts, Connecticut 46, Arkansas 99, Iowa 97, Gray Một số chủng được phân lập ở châu Âu như nhóm D274, nhóm D1466 và

những chủng được phân lập ở Úc (Karaca et al., 1990; Koch et al., 1990; Ignjatovic and McWaters, 1991; Kant et al., 1992; Ignjatovic et al., 1997) Các MAb đặc hiệu

chủng được sử dụng để nhận biết các chủng mới phân lập

Bằng các MAb, có thể kiểm tra epitope cố định có mặt trên một chủng (Ignjatovic and McWaters, 1991) Khi epitope này liên quan đến một serotype cố định, nó có thể được sử dụng để tạo ra một xét nghiệm ELISA đặc hiệu serotype

(Karaca et al., 1992) hoặc xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang (IFA) (De Wit et

al., 1995)

c Phân loại dựa trên các kiểu miễn dịch

Định nhóm của các chủng IBV thành các kiểu miễn dịch hoặc các kiểu bảo

vệ (Cunningham, 1975) là hữu ích vì nó cung cấp thông tin trực tiếp về hiệu quả của một vacxin và cung cấp nhiều thông tin thực tế trên các chủng IBV (Darbyshire

et al., 1975)

Các IBV thuộc các serotype/genotype khác nhau có các epitope khác nhau nhưng cũng có các epitope chung, các epitope chung này rất quan trọng trong miễn

dịch chéo (Cavanagh et al., 1997) Để quyết định kiểu miễn dịch của một chủng,

nghiên cứu các miễn dịch chéo được thực hiện, đây là một công việc tốn nhân lực, chi phí cao, và yêu cầu quá nhiều gà thí nghiệm và sự phân lập (Raggi and Lee,

1965; Cook et al., 1998)

d Phân loại dựa vào trình tự acid nucleic

Phân tích trình tự hệ gen protein S1 đã phân loại các chủng IBV được chính xác hơn và hơn 20 chủng IBV đã xác định được trình tự gen protein S1 Bằng việc xác định trình tự các amino acid của protein S1 cho thấy giữa các chủng có sự khác nhau từ 20-25% Do vậy, việc xác định trình tự các acid nucleic ngày càng hữu ích trong việc phân loại các chủng IBV trong tương lai

Kingham et al (2000) đã sử dụng giải trình tự chu kì tự động trực tiếp sản

phẩm RT-PCR của gen S1 sử dụng bộ mồi biến tính và kết luận rằng có thể nhanh chóng xác định các serotype, chủng và biến thể

2.2.2 Sức đề kháng, phương thức truyền lây của IBV

2.2.2.1 Sức đề kháng của IBV

IBV có thể tồn tại trong dịch niệu mô nhiều năm trong điều kiện nhiệt độ -30oC Ở ngoài môi trường, virus có thể sống đến 12 ngày vào mùa xuân và 56 ngày vào mùa đông

- Với sự khô lạnh: trong dịch niệu mô được làm khô lạnh, đóng nút môi trường chân không và bảo quản trong tủ lạnh, virus có thể tồn tại ít nhất 30 năm

- Sức đề kháng với pH: các chủng IBV sẽ bị thay đổi về cấu trúc ở độ

pH = 3 Trong môi trường nuôi cấy tế bào có pH từ 6 - 6,5 IBV sẽ ổn định hơn ở

độ pH 7 - 8

- Các yếu tố hóa học: IBV bị phá hủy bởi Ether, nhưng một số chủng có thể

dịch Chloroform 50% ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và 0,1% sodium deoxycholate (Cavanagh and Naqi, 2003) 1:10,000 potassium permanganate, 1:1000 mercuric chloride và 5% sodium hydroxide có thể cũng phá hủy được tính lây nhiễm IBV mẫn cảm với các chất sát trùng thông thường và bị bất hoạt bởi chloroform và các dung môi lipid, vì vậy có thể dùng dung dịch β – propiolactone

0,05% hoặc 0,1% (BPL), formalin 0,1% để tiêu diệt căn bệnh (Cavanagh et al.,

1999) Tuy nhiên nếu chỉ xử lý bằng dung dịch BPL không ảnh hưởng đến hoạt tính kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination) của IBV Gần đây, các tấm thẻ lọc màng cellulose sợi cơ bản gồm các hóa chất đông khô được

sử dụng thành công cho lưu trữ các mẫu virus từ các trường hợp lâm sàng cho ít

nhất 15 ngày (Moscoso et al., 2005)

2.2.2.2 Tính gây bệnh và độc lực

IBV gây nên sự trì trệ hoạt động mao khí quản và tính chất này đã được sử dụng để đánh giá độc lực của nó Các biến thể của các dòng IBV có khả năng gây

ra sự giảm sản lượng và chất lượng trứng, ảnh hưởng đến ống dẫn trứng tùy thuộc

từng chủng (Parsons et al., 1992) và một số chủng biến thể có ảnh hưởng rõ rệt

đến màu trứng

Các tổn thương thận gây ra bởi các dòng IBV khác nhau và mức độ nghiêm

trọng của chúng khác nhau (Meulemans et al., 2001) IBV nephropathogenic gây

tử vong cao hơn ở gà thịt so với gà đẻ; gà trống bị viêm thận nặng hơn so với gà

mái (Zanella et al., 2003) Ngoài đường hô hấp, thận và đường sinh sản của gà, El Houadfi et al (1986) đã tìm thấy một chủng IBV G gây bệnh về ruột, phân lập và

cho thấy có liên quan đến đường tiêu hóa của gà

Tính gây bệnh còn phụ thuộc vào các mầm bệnh thứ phát Raggi and Lee

(1965) cho thấy khi nhiễm cả IBV và Haemophilus paragallinarum, thời gian ủ

bệnh ngắn hơn và tỉ lệ tử vong cao hơn kèm theo các tổn thương nghiêm trọng

Kết hợp M synoviae đã gây ra viêm túi khí nặng (Hopkins and Yoder, 1984) Kết hợp tiêm truyền IBV và E coli gây chết và cổ trướng (tích tụ dịch trong khoang phúc mạc, gây sưng bụng) ở gà non (Cumming, 1969; Smith et al., 1985)

Tuổi của gà bị nhiễm cũng đóng vai trò quan trọng, những con gà non dưới

3 tuần tuổi dễ mắc bệnh hơn so với những con gà lớn hơn (Smith et al., 1985;

Cavanagh and Naqi, 2003) Ngoài ra, chế độ ăn protein cao có thể làm tăng khả năng

tử vong từ bệnh thận do IBV gây ra (Cumming, 1969) Nhiệt độ thấp hoặc stress lạnh cũng có khả năng tăng mức độ nghiêm trọng của bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở

gà (Cumming, 1969)

2.2.2.3 Sự thích nghi mô của IBV

Các chủng IBV có khả năng lây nhiễm một lượng lớn các bề mặt biểu mô,

nghĩa là gần như toàn bộ cơ thể của con gà Các IBV khác nhau về mức độ nhân

lên trong các mô IBV ban đầu nhiễm vào đường hô hấp trên Hiệu giá của virus

sống là tối đa ở mũi và khí quản vào ba ngày sau khi gây nhiễm (bằng cách nhỏ mắt và nhỏ vào trong mũi) và duy trì trong vòng từ hai đến năm ngày tiếp theo, tùy thuộc vào chủng (Ambali and Jones, 1990; Cavanagh, 2003) Sau đó hiệu giá

thường rơi xuống dưới mức phát hiện được, mặc dù một số lượng nhỏ virus vẫn còn được phát hiện ra ở 14 ngày sau khi nhiễm trong một số nghiên cứu (Ambali and Jones, 1990) Virus bị giới hạn ở các tế bào mao và tế bào tiết chất nhầy trong mũi và khí quản (Raj and Jones, 1997) Sau khi gây nhiễm vào những gà SPF thí

nghiệm, virus đã được phục hồi từ mũi, tuyến Harderian (Toro et al., 1996), ngoài

ra còn có trong khí quản, phế quản, phổi, thực quản, tuyến dạ dày, tá tràng, hồi tràng, ruột chay, túi Fabricius, ruột tịt (amiđan ruột tịt), thận, trực tràng và lỗ huyệt

(Ambali và Jones, 1990; El Houadfi et al., 1986; Hofstad and Yoder, 1996; Lucio

and Fabricant, 1990; Yu et al., 2001)

Các chủng khác nhau về hiệu giá tương đối của chúng trong các mô khác nhau Ambali and Jones (1990) cho thấy chủng Moroccan G của IBV cho hiệu giá trong thận tương đương với hiệu giá cao trong khí quản Trong một số bài báo khác (Raj and Jones, 1997, Cavanagh and Naqi, 2003) hiệu giá của virus trong các mô ở đường hô hấp cao hơn một đến hai lần so với hiệu giá ở các mô khác Ngoài đường hô hấp, sự thích nghi mô của virus được nghiên cứu nhiều nhất

là đối với thận Các nghiên cứu mô bệnh học và miễn dịch học cho thấy dòng virus MA-97 tấn công chủ yếu vào nephron (ống nhỏ trong thận đưa chất thải ra khỏi

máu và tạo nước tiểu) xuống các tế bào biểu mô ống thu (Chen et al., 1996; Chen

and Itakura, 1996) Một nghiên cứu siêu cấu trúc cho thấy virus được tái tạo trong tất cả các phân đoạn của các ống và ống dẫn, nhưng thường xuyên hơn trong các

tế bào biểu mô của ống dẫn thu, ống thu, các ống xoắn ngoại biên và các vòng Henle (Chen and Itakura, 1996)

Các chủng IBV có thể sinh sôi dễ dàng trong xoang niệu nang của trứng gà

có phôi, và trong màng đệm túi niệu của trứng không có phôi (Cavanagh, 1981) Virus này cũng có thể thích nghi với sự tăng trưởng tốt ở các tế bào thận của gà

con sơ cấp (Hodgson et al., 2006) và một số chủng đã được thích nghi với các tế bào Vero (Casais et al., 2003)

2.2.3 Đặc tính nuôi cấy của IBV

IBV thích ứng khi nuôi cấy trên phôi gà, trên môi trường tế bào và trên môi trường nuôi cấy tổ chức khí quản Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy IBV trên môi trường tế bào và trên phôi gà đã được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực sản

xuất vacxin phòng IB từ virus nhược độc có chất lượng cao, an toàn và thuần khiết

2.2.3.1 Trên phôi gà

IBV phát triển tốt trên phôi gà đang phát triển Nếu gây nhiễm những chủng cường độc tự nhiên vào phôi gà ấp 10 – 11 ngày tuổi, ở lần gây nhiễm đầu tiên phôi còi cọc và sống đến 90% cho dù nuôi cấy đến ngày thứ 19 Nhưng nếu tiếp tục cấy chuyển liên tiếp trên phôi gà đang phát triển thì tỷ lệ chết phôi và còi cọc phôi càng gia tăng và cấy chuyển liên tiếp đến đời thứ 10 thì hầu như các phôi bị còi cọc và có đến 80% phôi bị chết nếu nuôi cấy tiếp đến ngày thứ 20 Phôi gà tây không được sử dụng để gây bệnh, tuy nhiên vẫn có thể được sử dụng để khảo sát một số chủng của IBV (Beaudette và M41)

Sự thay đổi các đặc tính của phôi thể hiện rõ nhất khi gây nhiễm virus sau vài ngày Sự biến đổi nhẹ của những phôi còi cọc có thể quan sát được trong quá trình soi trứng Trứng nhiễm IBV có hiện tượng co quắp của phôi giống như một hình cầu với chân bị biến dạng ép chặt vào đầu phôi và dính đầy màng ối xung quanh phôi Túi lòng đỏ bị teo lại và lớp màng dễ bị phá vỡ Có sự gia tăng dịch niệu nang một cách rõ ràng Những phôi bị nhiễm IBV có một bệnh tích điển hình

là sự lắng đọng urate ở trung thận Bệnh tích này kết hợp với sự còi cọc của phôi

là đặc trưng của sự gây nhiễm IBV trên phôi gà (OIE, 2018) Một bệnh tích khác cũng được phát hiện ở những phôi gà được gây nhiễm từ những chủng IBV phân lập không gây chết phôi là màng ối dầy và cùng với những lớp màng xoang niệu nang liền kề bao bọc chặt lấy thai bị còi cọc Bệnh tích này thường có thể phát hiện

ở ngày thứ ba sau khi gây nhiễm Những bệnh tích trên cũng quan sát được trong trường hợp gây nhiễm virus Newcastle chủng Lentogenic trên phôi gà (OIE, 2018) Theo Jordan and Nassar (1973) và một số tác giả khác thời điểm gây nhiễm, nhiệt độ ấp sau khi gây nhiễm, thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu giá virus

2.2.3.2 Trên môi trường tế bào

Môi trường nuôi cấy tế bào một lớp đã được sử dụng để nghiên cứu IBV, trong đó tế bào thận phôi gà (CEK) và tế bào thận gà (CK) được sử dụng thành công nhất Gillette (1973) đã cấy chuyển thành công IBV vào môi trường tế bào CEK Theo tác giả phải cấy chuyển IBV trên môi trường tế bào CEK một số lần

nhất định thì virus mới tạo ra bệnh lý tế bào điển hình (CPE) cho dù những plaque được phát hiện bằng cách nhuộm màu có thể nhìn thấy ngay trong lần cấy chuyển đầu tiên và hiệu giá IBV trên môi trường tế bào CEK có sự khác nhau giữa các chủng Việc cấy chuyển một vài chủng IBV trên môi trường tế bào CEK thích hợp hơn cấy chuyển trên phôi gà Kích cỡ và hình thái của các plaque biến đổi theo các

với nuôi cấy ở 37oC

Khi nuôi cấy IBV trên môi trường tế bào CEK và CK hiệu giá virus đạt tối

đa ở 14 – 36 giờ sau khi gây nhiễm, tùy thuộc vào nhiều nhân tố gây nhiễm pH thích hợp nhất cho sự nhân lên của virus là 6,5 Nếu gây nhiễm trên môi trường tế bào gan phôi gà (CEL) hiệu giá virus cũng đạt giống như khi nuôi cấy trên môi trường tế bào CEK Chuẩn độ IBV trên phôi gà cho hiệu giá cao hơn so với môi trường tế bào CEK và CK từ 10 đến 100 lần, nhưng ngược lại tế bào CEK và CK lại mẫn cảm hơn tế bào CEL

Những chủng IBV đã được cấy chuyển trên phôi gà và nhiều lần trên môi trường tế bào CK thì có thể nhân lên được trong môi trường tế bào xơ phôi gà,

cấy tế bào có trypsin thì sự hình hình thành các plaque sẽ rõ hơn

2.2.3.3 Trên tổ chức khí quản

Darbyshire (1978) đã thông báo kết quả gây nhiễm IBV vào tổ chức khí quản

và một số mô khác của gà Tác giả đã sử dụng tổ chức khí quản của phôi gà ấp 20 ngày tuổi, nuôi cấy trong các chai lăn, sau đó gây nhiễm IBV, bệnh lý lông rung

dễ dàng quan sát bằng kính hiển vi sau 3 – 4 ngày Việc nuôi cấy virus vào tổ chức khí quản đã phục vụ cho việc phân lập virus, chuẩn độ xác định hiệu giá và xác định type virus được chính xác hơn

2.3 ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA VIRUS VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM

Bộ gen của IBV bao gồm khoảng 27 kb (Boursnell et al., 1987) và mã hóa

cho ba protein cấu trúc: glycoprotein spike (S), glycoprotein màng (M) và phosphoprotein nucleocapsid (N) (Stern and Sefton, 1982) Các gen cấu trúc, cùng với các khung đọc mở khác (ORFs), tổ chức bộ gen điển hình của coronavirus gia

cầm đặc trưng theo thứ tự 5’-Pol-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-UTR-3’ (Mardani et al., 2008; Umar et al., 2016) (Hình 2.3)

Hình 2.3 Tổ chức bộ gen điển hình của coronavirus gia cầm

Nguồn: Umar et al (2016)

Sự tái tổ hợp di truyền được biết đến như một đặc điểm của IBV (Cavanagh

et al., 1992a) Cho đến nay, dựa trên sự phân tích phát sinh loài với gen S1 và N,

sự tái tổ hợp di truyền của IBV được cho là tồn tại ở một số quốc gia (Bochkov et

al., 2007; Huang et al., 2004; Shieh et al., 2004; Yu et al., 2001) Nhưng phạm vi

của các sự kiện tái tổ hợp giữa các dòng phân lập thực địa IBV vẫn chưa được hiểu

rõ Trong serotype Massachusetts, tái tổ hợp đã được gợi ý xảy ra bên trong gen

S2 do hệ quả của sự đồng nhất nucleotide cao giữa các chủng IBV (Cavanagh et

al., 1992a) Tuy nhiên, khu vực được phân tích trong gen S2 đa dạng di truyền, vì

vậy các vị trí tái tổ hợp có thể tồn tại trong các vùng còn lại của gen S2 hoặc các

gen khác (Mase et al., 2008)

2.3.1 Gen Glycoprotein S

Protein S được lắp ráp vào màng virion, thông qua các tương tác không

cộng hóa trị với protein M (Godeke et al., 2000), chịu trách nhiệm ràng buộc

với thụ thể tế bào đích và sự kết hợp của các màng virus và tế bào, thực hiện vai trò chính trong sự nhiễm trùng của các tế bào nhạy cảm (Gallagher and Buchmeier, 2001) Tất cả các glycoprotein S coronavirus bao gồm bốn phần: một trình tự tín hiệu được tách ra trong quá trình tổng hợp; Ectodomain, hiện diện ở bên ngoài của hạt virion; vùng xuyên màng chịu trách nhiệm cho việc gắn kết protein S vào màng kép lipid của hạt virion; và đuôi tế bào chất

Glycoprotein S IBV (1145 axit amin) được cắt thành hai tiểu đơn vị: S1 (520 axit amin, 92-kDa) bao gồm tiểu đơn vị đầu cuối N của protein S; và S2 (625 amino

acids, 84-kDa) bao gồm tiểu đơn vị đầu cuối C của protein S (Cavanagh, 1983; Cavanagh and Naqi, 2003) Tiểu đơn vị S2 kết hợp không đồng nhất với tiểu đơn

vị S1 và chứa phần xuyên màng và phần đuôi tế bào chất đầu cuối Tiểu đơn vị S1

chứa hoạt động gắn kết thụ thể của protein S (Koch et al., 1990) Vùng ectodomain

của tiểu đơn vị S2 chứa một vùng hợp nhất giống peptide (Luo and Weiss, 1998)

và hai vùng lặp lại bộ bảy liên quan đến sự oligomer hóa của protein S (De Groot

et al., 1987) cần thiết cho sự đi vào trong các tế bào nhạy cảm (Guo et al., 2009)

Các glycoprotein S ở bên ngoài của virus chứa các epitope liên quan đến sự

khác biệt serotype (Cavanagh and Davis, 1986; Cavanagh et al., 1992a) Mã hoá

glycoprotein S, glycosyl hóa một cách chậm chạp, bản chất dễ bị lỗi của RNA polymerase làm cho gen S1 có thể dễ dàng tạo ra chèn, xóa bỏ nucleotide, đột biến điểm, và sự tái tổ hợp RNA dưới áp lực vacxin, để tạo ra các chủng biến thể mới

và thay đổi sự thích nghi mô (Jia et al., 1995; Casais et al., 2003)

Vì vậy có thể nói rằng chỉ có một vài sự khác biệt amino acid giữa các protein

S là đủ để có một tác động bất lợi đối với sự bảo vệ chéo (Cavanagh et al., 1997,

1998) Sự bảo vệ hoàn toàn được mong đợi khi sử dụng chủng vacxin liên quan chặt chẽ vì mức độ bảo vệ chéo giữa các chủng IBV thường phản ánh sự tương

đồng giữa các protein S (Canavagh et al., 1992b; Canavagh et al.,1997)

2.3.2 Gen Glycoprotein S1

Glycoprotein S1 là chất kích thích chính của các kháng thể trung hòa virus,

và điều chỉnh một số hoạt động quan trọng khác, như gắn vào tế bào, sự kết hợp của vỏ virus với màng tế bào chủ và đôi khi là sự kết hợp tế bào với tế bào (Kant

et al., 1992; Koch et al., 1990) Trong một nghiên cứu gần đây sử dụng một vùng

khoảng 450-bp bao gồm HVRI và HVRII để phân loại IBV, người ta thấy rằng

việc phân loại bởi khu vực này tương quan với kết quả trung hòa virus (Lee et al.,

2003) Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) và kháng thể trung hòa virus

(VN) được gây ra bởi tiểu đơn vị S1 bảo tồn kém (Jia et al., 1995; Ignjatovic et al., 1997; Gelb et al., 1997) và việc phát triển của sự phòng ngừa miễn dịch nhắm mục

tiêu đến protein này

Tiểu đơn vị S1 thể hiện sự biến đổi trình tự nhiều hơn so với S2 (Kusters et

al., 1989) Các epitopes trung hòa và đặc hiệu huyết thanh được liên kết với vùng

siêu biến xác định (HVR) trong tiểu đơn vị S1; Do đó, đặc tính phân tử của IBV

dựa trên phân tích gen S1 (Kingham et al., 2000) Gen S1 chứa các yếu tố quyết định đối với sự thích nghi tế bào (Cavanagh et al., 2005)

Glycoprotein S1 có liên quan đến sự gắn kết virus và là một mục tiêu chính

của kháng thể trung hoà ở gà (Cavanagh et al., 1992b) Do đó, nhóm di truyền gần

đây của IBV chủ yếu được thực hiện trên cơ sở các trình tự nucleotide của gen

glycoprotein S1 (Lee et al., 2003; Yu et al., 2001) Glycoprotein S1 xác định sự

tiến hóa huyết thanh học, sự thay đổi kiểu hình và sự đa dạng di truyền của các IBV (Mondal and Cardona, 2007)

Phân tích trình tự của một vùng siêu biến từ gen S1 là thông tin cho sự khác

biệt của các chủng có liên quan mật thiết (Ramneek et al., 2005) Các trình tự đầy

đủ của gen S1 có thể cần được phân tích để phân biệt giữa các chủng giống hệt và

tương tự nhau (Ramneek and McFarlane, 1998; Ramneek et al., 2005) Sự đa dạng

trong S1 có thể là kết quả từ sự đột biến, tái tổ hợp và lựa chọn tích cực mạnh mẽ

trong cơ thể (Canavagh et al., 1997)

2.3.3 Gen Glycoprotein S2

Glycoprotein S2 và N cũng quan trọng vì chúng mang các epitopes cho sự cảm ứng của các kháng thể phản ứng chéo (Ignjatovic and Galli, 1995), một số nhà khoa học đã thực hiện những nghiên cứu phân tích dựa trên trình tự gen S2, và cho

ra những kết quả khả quan về đa dạng dựa trên vùng gen S2 này Mase et al (2008)

đã cho thấy sự đa dạng của vùng N-terminal của gen S2 của IBV tại Nhật Bản và khẳng định rằng vùng này rất hữu ích cho việc phân nhóm các chủng IBV Mặc dù một vùng kháng nguyên chính không tồn tại trong gen S2, khu vực này vẫn được coi là có liên quan đến kháng nguyên bị ảnh hưởng bởi cấu trúc gen S2 (Callison

et al., 1999) Do đó, phân tích gen S2 cũng rất quan trọng để hiểu thêm về tính

kháng nguyên của các dòng phân lập Mặt khác, một phương pháp phân nhóm di truyền khác của IBV được báo cáo trên cơ sở sự đa hình về chiều dài đoạn enzyme

cắt giới hạn (RFLP) các trình tự nucleotide của gen glycoprotein S2 (Lin et al.,

1991) Các nhà nghiên cứu báo cáo rằng các kết quả của RFLP gần như phù hợp với phân loại huyết thanh học, mặc dù glycoprotein S2 không phải là vùng chính

để mã hóa các epitope trung hòa đặc hiệu chủng Do đó, người ta cho rằng sự đa dạng di truyền như gen S1 đã được nhận ra ngay cả trong gen S2

2.3.4 Nghiên cứu dịch tễ học IBV dựa trên genotype

Thông tin bộ gen là khách quan và cung cấp những thông tin cần thiết cho

các nghiên cứu dịch tễ học (De Wit et al., 2011) Một yếu tố phức tạp liên quan

đến việc định genotype của IBV là sự thay đổi chỉ một phần nhỏ của amino acid

trong protein S1 có thể dẫn đến thay đổi serotype (Cavanagh et al., 1992) do sự

thay đổi trong các epitope trung hoà virus, trong khi tỷ lệ lớn hơn của các đột biến

ở các phần khác của S1 có thể không dẫn đến một thay đổi có liên quan trong tính kháng nguyên của virus Mặt khác, các serotype và genotype khác nhau của các IBV không chỉ có các epitope khác nhau mà còn chia sẻ các epitope phổ biến quan

trọng trong tính miễn dịch chéo (Cavanagh et al., 1997) và các phản ứng miễn dịch trung gian tế bào (Boots et al., 1992; Ignjatovic and Galli, 1995) Những đặc tính

này của IBV gây ra bất lợi trong việc định genotype để sử dụng trong thực địa Mặc dù có những hạn chế này, vẫn có báo cáo rằng so sánh trình tự gen S1 (một phần 700 nucleotide) là một dự đoán tốt hơn về thử thách khả năng miễn dịch ở gà

so với định serotype bằng trung hòa virus (Ladman et al., 2006) Nói chung, một

sự tương đồng thấp hơn trong trình tự của tiểu đơn vị S1 của 2 chủng ( ví dụ một chủng vacxin và một chủng thực địa) có nghĩa là các đột biến liên quan có cơ hội

xảy ra lớn hơn, có thể dẫn đến bảo vệ chéo thấp hơn (De Wit et al., 2011)

Phân tích của một số báo cáo cho thấy mức bảo vệ chéo tốt hơn giữa các chủng có mức độ tương đồng cao Tuy nhiên, những dữ liệu này cũng cho thấy rằng mối quan hệ không phải là rất mạnh Một số chủng khác nhau chỉ một vài phần trăm nhưng có sự tụt giảm đáng kể trong bảo vệ chéo, trong khi lại có mức

bảo vệ chéo cao với một số chủng có sự tương đồng thấp hơn nhiều (De Wit et al.,

2011)

Ở nhiều quốc gia, vacxin IB được sử dụng là sự kết hợp của 2 chủng hoặc chương trình chủng ngừa bao gồm 2 lần vacxin với 2 hoặc nhiều chủng IBV khác nhau Mức độ bảo vệ chéo sau đó phụ thuộc vào hiệu quả của sự kết hợp của các chủng, cái mà làm cho không thể xác định mức độ tương đồng giữa chủng thực địa

và chủng vacxin Điều này dẫn đến kết luận rằng kiểu gen là một công cụ tuyệt vời

cho các nghiên cứu dịch tễ học (De Wit et al., 2011), và là một công cụ tiện lợi,

thiết thực để định type, sử dụng tốt nhất như một công cụ sàng lọc để chọn ra các chủng tiềm năng quan trọng Trong trường hợp có sự nghi ngờ trong thực địa mà kiểu gen của các phân lập gần đó không cung cấp thông tin chính xác về tính kháng nguyên thực của chúng, sau đó tiến hành thử nghiệm thông thường (định serotype)

và đặc biệt các nghiên cứu sự bảo hộ trong cơ thể là cần thiết

Được sử dụng nhiều nhất cho việc định genotype là phần gen mã hoá cho tiểu

đơn vị S1 của glycoprotein S (De Wit et al., 2011) IBV tồn tại trong nhiều type

khác nhau về mặt di truyền, phân tích phát sinh loài và cả độ tương đồng cặp giữa các trình tự nucleotide hoặc amino acid đã được sử dụng để phân loại các chủng

IBV Tuy nhiên, hiện tại không có sự đồng thuận về phương pháp, theo đó trình tự IBV nên được so sánh, và các chỉ định nhóm di truyền không nhất quán không phù hợp với lịch sử phát sinh loài đã được áp dụng, dẫn đến sự cùng tồn tại lẫn lộn của

nhiều kiểu gen Valastro et al (2016) đã đề xuất một hệ thống phân loại dựa trên

hệ thống phát sinh loài đơn giản và lặp lại được kết hợp với một danh pháp lineage

rõ ràng và có cơ sở hợp lý cho việc phân bổ các chủng IBV Bằng cách sử dụng trình tự nucleotide hoàn chỉnh của gen S1, các tác giả đã xác định cấu trúc phát sinh loài của IBV, do đó cho phép xác định 6 kiểu gen bao gồm 32 lineage virus

khác nhau và một số tái tổ hợp liên dòng (inter-lineage) (Valastro et al., 2016)

2.4 BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM

2.4.1 Dịch tễ học

Gà được coi là vâ ̣t chủ tự nhiên duy nhất của bê ̣nh, tuy nhiên tính mẫn cảm đối với bệnh thay đổi phụ thuộc vào giống gà (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2013) Gây

bệnh thực nghiê ̣m IBV cho gà tây bằng cách phun sương không biểu hiê ̣n triê ̣u

khi gây nhiễm 48 giờ Con vật mắc bê ̣nh ở mo ̣i lứa tuổi, nhưng gà con mẫn cảm nhất và có tỷ lê ̣ chết cao Khi tuổi càng tăng, gà trở nên đề kháng tốt hơn với những biến đổi bê ̣nh lý ở thâ ̣n, ống dẫn trứng và tỷ lê ̣ chết giảm (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2013)

Các nghiên cứu gần đây ở Trung Quốc cho thấy IBV có thể tái tạo trong chim

công nuôi làm cảnh (Pavo cristatus) (Liu et al., 2005), gà gô (Alectoris sp.), gà Guinea (Numida meleagris) và mòng két (Anas sp.f duck) (Liu et al., 2005;

Canavagh, 2005) Những loài này, giống như chim công nuôi làm cảnh, gà tây và

gà lôi, là những loài chim thuộc họ gà (“fowl-like”, bộ Galliformes) Giải trình tự

toàn bộ bộ gen của những virus được phân lập từ những loài này cho thấy chúng giống như IBV ở tổ chức bộ gen và trình tự của các gen được mã hóa

2.4.2 Phương thức truyền lây

Đặc tính truyền lây của IBV là rất dễ lây lan Thời kỳ ủ bệnh tương đối ngắn (18 - 36 giờ), và những con gà không được bảo vệ với thuốc xịt nước xoang niệu

mô bị nhiễm phát triển rales khí quản trong 24 giờ (Hofstad, 1984), việc lây lan ra toàn đàn chỉ trong 1 hoặc 2 ngày và những con gà nhạy cảm cùng chuồng với gà bệnh thường xuất hiện triệu chứng trong vòng 48 giờ Virus lan truyền nhanh giữa những con gà theo đường ngang (Hofstad and Yoder, 1996) như đường không khí,