Hoàn thiện quy trình sản xuất quy mô công nghiệp vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại công ty tnhh mtv avac việt nam

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ THỊ XIÊM HỒN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT QUY MƠ CƠNG NGHIỆP VẮC XIN VƠ HOẠT NHŨ DẦU PHỊNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TẠI CÔNG TY TNHH MTV AVAC VIỆT NAM Chuyên Ngành: Thú Y Mã Số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày … tháng năm 2019 Tác giả luận văn Lê Thị Xiêm i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Bá Hiên tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám Đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh Vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y – Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán công nhân viên công ty TNHH thành viên Avac Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày … tháng năm 2019 Tác giả luận văn Lê Thị Xiêm ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thıết đề tàı 1.2 Mục tıêu nghıên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Hội chứng rối loạn sınh sản hô hấp lợn 2.1.1 Lịch sử hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp 2.1.2 Tình hình phân bố lưu hành hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp tại Việt Nam 2.2 Vırus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 2.2.1 Hình thái cấu trúc virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 2.2.2 Sức đề kháng virus đặc tính ni cấy 2.3 Bệnh học hộı chứng rốı loạn sınh sản hô hấp lợn 2.3.1 Triệu chứng lâm sàng bệnh lý 2.3.2 Bệnh virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Type II thể độc lực cao 2.4 Miễn dịch virus hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 10 2.5 Vắc xın phòng hộı chứng rốı loạn sınh sản hô hấp 12 2.5.1 Hiểu biết chung vắc xin 12 iii 2.5.2 Những nguyên tắc để đảm bảo chất lượng sản xuất vắc xin, chế phẩm sinh học quy mô công nghiệp 13 2.5.3 Sản xuất vắc xin phương pháp vô hoạt virus 15 2.5.4 Sản xuất vắc xin phương pháp nhược độc virus môi trường tế bào 16 2.5.5 Phương pháp sản xuất vắc xin hệ 17 2.6 Chất bổ trợ 21 Phần Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 23 3.1 Thời gian nghiên cứu 23 3.2 Địa điểm nghiên cứu 23 3.3 Nguyên vật liệu, đối tượng sử dụng nghiên cứu 23 3.3.1 Đối tượng, vật liệu 23 3.3.2 Hóa chất bất hoạt 23 3.3.3 Chất bổ trợ 23 3.3.4 Các loại dung dịch, môi trường 23 3.3.3 Trang thiết bị, dụng cụ 25 3.4 Nội dung nghiên cứu 26 3.4.1 Nghiên cứu sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn quy mô công nghiệp 26 3.4.2 Kiểm nghiệm vắc xin vơ hoạt nhũ dầu phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn quy mô công nghiệp 26 3.5 Phương pháp nghiên cứu 26 3.5.1 Quy trình tóm tắt sản xuất vắc xin PRRS quy mô công nghiệp 26 3.5.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào 27 3.5.3 Phương pháp gây nhiễm, thu hoạch chuẩn độ virus PRRS 29 3.5.4 Phương pháp cô đặc, vơ hoạt, nhũ hóa kiểm tra sau nhũ hóa vắc xin 30 3.5.5 Kiểm tra thành phẩm vắc xin 32 3.5.6 Phương pháp IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay): Phương pháp miễn dịch có gắn enzyme thảm tế bào lớp 35 3.5.7 Phương pháp Elisa phát kháng thể hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (theo TCVN 8400-21:2014) 37 3.5.8 Phương pháp phân lập virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (theo TCVN 8400-21:2014) 38 iv 3.6 Xử lý số liệu 39 Phần Kết thảo luận 40 4.1 Tối Ưu trình sản xuất kháng nguyên VIRUS PRRS hệ thống chai roller 40 4.1.1 Tối ưu hóa quy trình nuôi tế bào Marc – 145 chai roller 40 4.1.2 Tối ưu hóa quy trình gây nhiễm, thu hoạch virus PRRS hệ thống chai roller 45 4.2 Tối ưu trình bất hoạt kháng nguyên sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu 48 4.2.1 Nghiên cứu q trình đặc kháng ngun 48 4.2.2 Nghiên cứu trình bất hoạt kháng nguyên 50 4.2.3 Xác nhận q trình nhũ hóa, bổ sung chất bổ trợ vắc xin 52 4.2.4 Kiểm sốt q trình sản xuất vắc xin PRRS vô hoạt 54 4.3 Kiểm nghiệm thành phẩm vắc xin 58 4.3.1 Kiểm tra cảm quan 58 4.3.2 Kiểm tra vô trùng 59 4.3.3 Kiểm tra an toàn 60 4.3.4 Kiểm tra hiệu lực 62 Phần Kết luận kiến nghị 69 5.1 Kết luận 69 5.2 Kiến nghị 69 Tài liệu tham khảo 70 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BEI Binary Ethylenimine CPE Cytophathogenic Effect DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid ĐC Đối chứng ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum FTM Fruit Thioglycolate Agar GMP Good Manufacturing Practices IPC In Process control IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay NBCS Newborn Calf Serum NSP Non structural protein OD Optical Density OIE Office International des Epizooties PBS Photphat Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome S/P Sample/Positive SD Sabouraud dextrose agar SP Structural protein TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TN Thí nghiệm TRS Technical Report Series TSA Trypticase Soy Agar TSB Trypticase Soy Broth WHO World Health Organization XLD Xylose Lysine Deoxycholate vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số tên thường gặp tài liệu Bảng 2.2 Tổng hợp ổ dịch PRRS xảy Việt Nam từ 2007-2016 Bảng 2.3 Các vắc xin thử nghiệm sản xuất 18 Bảng 4.1 Kết kiểm tra khả phát triển tế bào Marc – 145 điều kiện có 5% CO2 khơng có CO2 40 Bảng 4.2 Kết xác định lượng tế bào Marc-145 chai thích hợp 41 Bảng 4.3 Kết xác định tốc độ lăn phù hợp 42 Bảng 4.4 Khả sinh trưởng tế bào Marc – 145 chai roller 2X 44 Bảng 4.5 Kết xác định liều gây nhiễm thích hợp virus PRRS chủng KTY-PRRS1 môi trường nuôi cấy tế bào 46 Bảng 4.6 Kết xác định thời gian thu hoạch thích hợp virus PRRS chủng KTY-PRRS-01 môi trường nuôi cấy tế bào 48 Bảng 4.7 Hiệu giá virus sau cô đặc phương pháp lọc tiếp tuyến 49 Bảng 4.8 Kiểm tra sản phẩm sau bất hoạt (bằng formaldehyde BEI) 50 Bảng 4.9 Xác nhận quy trình bất hoạt BEI 52 Bảng 4.10 Kết nhũ hóa vắc xin dầu khoáng ISA 201VG 53 Bảng 4.11 Kết kiểm tra vô trùng vắc xin trước bất hoạt 54 Bảng 4.12 Kết kiểm tra hiệu giá virus trước bất hoạt 55 Bảng 4.13 Kết kiểm tra q trình vơ hoạt virus vắc xin BEI 56 Bảng 4.14 Kết kiểm tra vô trùng virus vắc xin sau bất hoạt 56 Bảng 4.15 Kết kiểm tra vắc xin sau nhũ hóa 57 Bảng 4.16 Kết kiểm tra vơ trùng sau nhũ hóa 57 Bảng 4.17 Kết sản xuất thử nghiệm vắc xin PRRS 58 Bảng 4.18 Kết kiểm tra cảm quan vắc xin PRRS vô hoạt 59 Bảng 4.19 Kết kiểm tra vô trùng vắc xin 59 Bảng 4.20 Kết kiểm tra an toàn vắc xin PRRS lợn thí nghiệm 60 Bảng 4.21 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp ELISA 63 Bảng 4.22 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp IPMA 64 Bảng 4.23 Kết đánh giá công cường độc 66 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ dịch tễ phân bố PRRS Việt Nam từ 2007-2013 Hình 2.2 Hình ảnh hình thái, cấu trúc virus PRRS Hình 2.3 Hình ảnh cấu trúc gen virus PRRS Hình 2.4 Gen từ chủng virus khác 19 Hình 3.1 Sơ đồ sản xuất vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp theo quy mô công nghiệp 27 Hình 4.1 Hình ảnh nuôi cấy tế bào chai roller 2X 43 Hình 4.2 Tế bào Marc-145 qua thời điểm 45 Hình 4.3 CPE virus PRRS đối chứng 47 Hình 4.4 Hiệu giá kháng thể (bằng ELISA, số S/P, tiêm vắc xin thời điểm D0, D21 thử thách cường độc thời điểm D49) 51 Hình 4.5 Hiệu giá kháng thể (bằng phương pháp IPMA, tiêm vắc xin thời điểm D0, D21 thử thách cường độc thời điểm D49) 51 Hình 4.6 Hình ảnh kiểm tra hạt nhũ hóa kính hiển vi 53 Hình 4.7 Vắc xin PRRS vơ hoạt sau chia liều 58 Hình 4.8 Một số hình ảnh kiểm tra vơ trùng sản phẩm 60 Hình 4.9 Thân nhiệt lợn kiểm tra an tồn 61 Hình 4.10 Kiểm tra an toàn vắc xin 61 Hình 4.11 Ảnh lấy máu kiểm tra kháng thể kháng VIRUS PRRS 62 Hình 4.12 Hình ảnh kiểm tra IPMA 65 Hình 4.13 Lợn trước sau cơng cường độc 67 Hình 4.14 Biến đổi thân nhiệt lợn sau công cường độc 68 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Lê Thị Xiêm Tên luận văn: Hồn thiện quy trình sản xuất quy mô công nghiệp vắc xin vô hoạt nhũ dầu phịng Hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn công ty TNHH MTV Avac Việt Nam Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Chúng áp dụng kết thu từ đề tài cấp nhà nước KC.04.15/11-15 PGS.TS Nguyễn Bá Hiên chủ nhiệm đề Học viện Nơng nghiệp Việt Nam chủ trì “Nghiên cứu cơng nghệ sản xuất vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn”, Tiến hành sản xuất vắc xin quy mô công nghiệp nhà máy sản xuất vắc xin Avac nhằm hoàn thiện quy trình sản xuất quy mơ cơng nghiệp để tạo sản phẩm vắc xin thương mại phục vụ cho cơng tác phịng bệnh Phƣơng pháp nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu sử dụng: Phương pháp sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu môi trường tế bào như: Nuôi cấy tế bào hệ thống chai roller, gây nhiễm, thu hoạch, cô đặc kháng nguyên, vơ hoạt virus, nhũ hóa vắc xin Phương pháp kiểm nghiệm vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn: kiểm tra cảm quan, vô trùng, khiết, kiểm tra tiêu an tồn hiệu lực theo TCVN 8685-13:2014 Kết kết luận Hồn thiện quy trình sản xuất kháng nguyên virus PRRS hệ thống chai roller với quy mơ 100 lít kháng ngun/mẻ - Ni cấy tế bào Marc-145 hệ thống chai roller tối ưu điều kiện không CO2 với lượng tế bào ban đầu 1x105 Cells/ml, sau 72h cấy chuyển tế bào lần tốc độ lăn 0,2 đến 0,3 rpm.Liều gây nhiễm thích hợp virus hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp chủng KTY - PRRS - 01 môi trường nuôi cấy tế bào Marc 145 104 TCID50 Thời gian thu hoạch huyễn dịch virus PRRS thích hợp nhất, hàm lượng virus cao, chất lượng tốt sau gây nhiễm virus 72 - Vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp bất hoạt theo quy trình thích hợp BEI nồng độ 1mM 24h 370C, hiệu giá virus trước ix 4.3.4 Kiểm tra hiệu lực Để đánh giá khả phịng bệnh, bảo hộ vắc xin cho vật ni, yếu tố hiệu lực vắc xin quan trọng, việc kiểm tra hiệu lực cho loại vắc xin công việc bắt buộc cần thiết Vắc xin vô hoạt PRRS kiểm nghiệm tiêu hiệu lực theo TCVN 8685-13:2014 phương pháp trọng tài Mỗi lơ vắc xin bố trí lơ lợn, lơ thí nghiệm (5 lợn) lơ đối chứng (3 lợn), lơ thí nghiệm tiến hành gây miễn dịch cách tiêm vắc xin lần, lần liều vắc xin, lần lợn 21 ngày, lần lợn 42 ngày tuổi, lợn 70 ngày tuổi lợn thí nghiệm lợn đối chứng tiến hành lấy máu chắt huyết công cường độc chủng KTY-PRRS-01: 100 TCID50/con (Phạm Văn Sơn, 2018), lấy máu thời điểm lợn 70 ngày 91 ngày tuổi, theo dõi lợn sau cơng cường độc 21 ngày Hình 4.11 Ảnh lấy máu kiểm tra kháng thể kháng VIRUS PRRS Kết đánh giá hiệu giá kháng thể PRRS phương pháp Elisa lô PR1-0118, 0119, 0219 thể bảng sau: 62 Bảng 4.21 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp ELISA Giá trị S/P Lô vắc xin Nhóm 0dpi PR1-0119 Thí nghiệm 21dpi 0.06 1.72 0.03 0.87 0.05 1.85 0.07 1.37 0.07 0,96 0.03 0.34 0.03 0.22 0.05 0.18 0,06 1.28 0.07 1.41 0.10 0.97 0.17 1.32 0.12 0.95 0.06 0.12 0.02 0.2 0.05 0.16 0.03 1.45 0.07 0.87 0.04 1.27 0.02 1.55 0.08 1.01 0.03 0.25 0.07 0.32 0.004 0.18 Tỷ lệ dƣơng tính 100% Đ/C PR1-0119 Thí nghiệm 100% Đ/C PR1-0219 Thí nghiệm 100% Đ/C Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng virus PRRS phương pháp ELISA cho thấy lô đối chứng không phát kháng thể dương tính sau 21 ngày tiêm vắc xin lơ thí nghiệm Trong lơ thí nghiệm 21 ngày 63 sau tiêm cho kết dương tính Như vắc xin vơ hoạt kích thích sản sinh kháng thể kháng PRRS lợn Đồng thời trình kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp Elisa, chung tiến hành kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp IPMA lơ thí nghiệm, kết thí nghiệm thể bảng sau: Bảng 4.22 Kết kiểm tra hàm lƣợng kháng thể phƣơng pháp IPMA Hiệu giá IPMA Lơ vắc xin Nhóm PR1-0119 Thí nghiệm Đ/C Thí nghiệm PR1-0119 Đ/C Thí nghiệm PR1-0219 Đ/C 3 3 0dpi 21dpi 1/80 1/40 1/40 1/80 1/40 1/80 1/40 1/40 1/40 1/80 1/80 1/160 1/80 1/40 1/80 1/80 1/40 1/40 1/80 1/40 1/80 1/40 1/1280 1/640 1/2560 1/1280 1/1280 1/160 1/160 1/80 1/1280 1/2560 1/640 1/1280 1/640 1/160 1/160 1/80 1/1280 1/640 1/2560 1/1280 1/1280 1/40 1/160 1/80 Tỷ lệ dƣơng tính bảo hộ 100% 100% 100% Từ kết kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp IPMA cho thấy lợn đối chứng có hàm lượng kháng thể kháng PRRS mức thấp, mức bảo hộ (IPMA ≥1/640 (TCVN 8685-13:2014 2014)) lơ thí nghiệm thời điểm 21 ngày sau tiêm có tỷ lệ dương tính bảo hộ (IPMA ≥1/640 (TCVN 8685-13:2014 2014) 100% lô thí nghiệm 64 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 Hình 4.12 Hình ảnh kiểm tra IPMA Từ kết xác định hàm lượng kháng thể kháng VIRUS PRRS phương pháp ELISA IPMA, tiếp tục đánh giá hiệu lực vắc xin 65 vô hoạt PRRS phương pháp công cường độc, 21 ngày sau tiêm sau tiêm mũi 2, tiến hành công cường độc chủng virus PRRS cường độc phân lập Việt Nam cho lợn lơ thí nghiệm đối chứng (chủng KTY-PRRS-01 với liều công 100 TCID50) (Phạm Văn Sơn, 2018) Sau công cường độc, theo dõi lợn thí nghiệm triệu chứng lâm sàng, đo thân nhiệt hàng ngày theo dõi tình trạng ăn uống lợn 21 ngày Lợn mổ khám sau 21 ngày thí nghiệm để đánh giá biến đổi bệnh lý Theo dõi triệu chứng lâm sàng biểu phản ứng cục lợn lô thời gian 21 ngày sau công cường độc Kết thể bảng 4.23 Bảng 4.23 Kết đánh giá công cƣờng độc STT Nhóm TN Lơ 0118 Đ/C TN Lơ 0119 Đ/C TN Lô 0219 Đ/C Triệu chứng lâm sang Lợn ăn uống bình thường, có biểu mệt mỏi trở lại bình thường sau – ngày Lợn sốt cao, chảy nước mũi, ho, sưng mí mắt Lợn sau cơng cường độc 12h có phản xạ chậm chạp, sốt nhẹ (39,5 0C), 2-3 ngày sau hoạt động bình thường Lợn sốt cao, bỏ ăn, vận động, ho Lợn sốt nhẹ (390C), ăn uống bình thường Lợn bỏ ăn, sốt cao (40 - 41,50C), mệt mỏi, vận động, da mẩn đỏ vùng da mỏng, khó thở Từ bảng 4.23 cho thấy lô vắc xin với lợn thí nghiệm tiêm vắc xin sau 21 ngày sau Cơng cường độc tồn lợn khỏe mạnh khơng biểu triệu chứng bệnh tích PRRS tỷ lệ bảo hộ đạt 100% Ở lô đối chứng tất lợn ốm nặng (với biểu lâm sàng: bỏ ăn, sốt cao, tiêu chảy…) Tổn thương đại thể điển hình phổi hạch lympho, hạch lympho sung huyết, xuất huyết kết hợp hoại tử (hạch hàm, hạch bẹn nông, hạch ruột, hạch phổi…), viêm phổi kẽ Các tổn thương quan sát thấy mổ khám lợn hoàn toàn giống với tổn thương lợn mắc PRRS tự nhiên số nghiên cứu trước công bố (Nguyễn Thị Lan, 2012) Để có thêm thơng tin nghiên cứu hiệu lực vắc xin, tiến hành mổ khám để kiểm tra bệnh tích lợn chết thời gian thí nghiệm hết 21 ngày thí nghiệm Bệnh tích lợn thí nghiệm chúng tơi tổng hợp sau: Lợn nhóm khơng tiêm vắc xin: Bệnh tích đặc trưng thấy chủ yếu phổi hạch lympho Tồn nhóm lợn phổi bị viêm nặng, có 66 đám viêm lan tràn nên làm cho phổi có màu đỏ, xám, chắc, đặc Lợn nhóm tiêm vắc xin khơng thấy biến đổi quan tổ chức lợn Một số hình ảnh mổ khám lợn Lợn trước cơng cường độc Lợn sau cơng cường độc Hình 4.13 Lợn trƣớc sau công cƣờng độc 67 BIẾN ĐỔI THÂN NHIỆT CỦA LỢN SAU CÔNG CƯỜNG ĐỘC 41 40.5 40 39.5 39 38.5 38 37.5 37 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 PR1-0118 TN PR 1-0119 TN PR1-0219 TN PR1-0118 DC PR 1-0119 DC PR1-0219 DC Hình 4.14 Biến đổi thân nhiệt lợn sau công cƣờng độc Từ kết đánh giá công cường độc, đánh giá hiệu giá kháng thể hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp phản ứng ELISA phản ứng IPMA tham chiếu với tiêu chuẩn TCVN 8685-13:2014 quy trình kiểm nghiệm vắc xin vơ hoạt phịng bệnh hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS) (TCVN 8685-13:2014 2014) vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn đạt tiêu hiệu lực thành phẩm Tổng kết thí nghiệm kiểm nghiệm vắc xin thành phẩm vơ hoạt phịng hội chửng rối loạn sinh sản hô hấp lợn sản xuất quy mô công nghiệp đạt yêu cầu chất lượng theo quy định TCVN 8685-13:2014 (TCVN 868513:2014 2014) 68 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 5.1.1 Hồn thiện quy trình sản xuất vắc xin phịng hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn hệ thống chai roller với quy mô 100 lít kháng ngun/mẻ - Ni cấy tế bào Marc-145 hệ thống chai roller tối ưu điều kiện không CO2 với lượng tế bào ban đầu 1x105 Cells/ml, sau 72h cấy chuyển tế bào lần tốc độ lăn 0,2 đến 0,3 rpm - Liều gây nhiễm thích hợp virus hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp chủng KTY - PRRS - 01 môi trường nuôi cấy tế bào Marc - 145 là: 104 TCID50 - Thời gian thu hoạch huyễn dịch virus PRRS thích hợp nhất, hàm lượng virus cao, chất lượng tốt sau gây nhiễm virus 72 - Bất hoạt, nhũ hóa vắc xin vơ hoạt nhũ dầu phịng PRRS, sản xuất thành cơng 03 lô liên tiếp quy mô tối thiểu 20.000 liều/mẻ - Vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp bất hoạt theo quy trình thích hợp BEI nồng độ 1mM 24h 370C, hiệu giá virus trước bất hoạt 108 TCID50/ml nhũ hóa dầu khống ISA 201 VG 5.1.2 Kiểm nghiệm vắc xin phòng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn theo quy mô công nghiệp Vắc xin sản xuất đạt chất lượng theo tiêu chuẩn TCVN 8685-13:2014 - Vắc xin đạt cảm quan, khơng lắng cặn, khơng đơng vón, màu trắng sữa - Vắc xin đạt yêu cầu vô trùng, không bị tạp nhiễm vi khuẩn nấm mốc - Vắc xin đạt yêu cầu an toàn tiêm gấp liều sử dụng - Văc xin đạt yêu cầu hiệu lực đánh giá tiêu ELISA, IPMA công cường độc 5.2 KIẾN NGHỊ - Tiến hành thử nghiệm vắc xin thực địa nhằm đánh giá hiệu lực việc sử dụng vắc xin vô hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn - Đánh giá độ dài miễn dịch lợn sau tiêm vắc xin, xác định thời gian tái chủng phù hợp - Nghiên cứu hạn sử dụng vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp điều kiện lão hóa cấp tốc, điều kiện khắc nghiệt - Đưa vắc xin vào sản xuất thương mại 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Bộ Khoa học Công nghệ (2014) TCVN 8685-13:2014 Quy trình kiểm nghiệm phần 13: Vắc xin vơ hoạt phịng bệnh hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS) Việt Nam: Bộ Y Tế (2018) Nguyên tắc, tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc tổ chức y tế giới 35/2018/TT-BYT B Y Tế Chăn nuôi Việt Nam (2018) Thống Kê Chăn Nuôi Việt Nam 01/10/2018 Truy cập 20/03/2019, 2019 http://channuoivietnam.com/thong-ke-chan-nuoi/ Cục Thú Y (2007) Báo cáo tình hình dịch bệnh lợn tỉnh đồng Sông Hồng Cục Thú Y (2018) Báo cáo tổng kết Cục thú y 2018 Feng Y., T Zhao, N Tùng, K Inui, Y Ma, N T Hoa, Nguyễn Văn Cảm, D Liu, Bùi Quang Anh, Tô Long Thành, C Wang, K Tian and G F Gao (2009) "Các biến chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp Việt Nam Trung Quốc năm 2007" Khoa học thú y XVI (1) Kamakawa A., Hồ Thị Viết Thu S Yamada (2006) "Epidemiological survey of viral diseases of pigs in the Mekong delta of Vietnam between 1999 and 2003." Vet Microbiol 118(1-2).tr 47-56 Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hương (2010) Miễn Dịch Học Ứng Dụng Nhà xuất nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Ngọc Tiến (2011) "Tình hình dịch lợn tai xanh (PRRS) Việt Nam cơng tác phịng chống dịch" Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 1.tr 18 10 Nguyễn Lương Hiền Ngô Thành Long., (2001) Bước đầu khảo sát hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp số trại heo giống thuộc vùng thành phố Hồ Chí Minh Báo cáo khoa học, phần chăn nuôi thú y 1999-2000.tr 224-227 11 Nguyễn Bá Hiên, Trần Xuân Hạt, Phạm Quang Thái, Hồng Văn Năm., (2010) Cơng nghệ chế tạo sử dụng vắc xin thú y Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội 12 Nguyễn Bá Hiên Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2013), Bệnh truyền nhiễm động vật nuôi biện pháp khống chế Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 13 Nguyễn Thị Lan (2012) "Đặc điểm bệnh lý Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) lợn sau cai sữa lợn choai xác định kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang" Tạp chí Khoa học Kỹ thuật thú y 19 (3) 70 14 Phạm Văn Sơn (2018) Nghiên cứu tạo giống gốc thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn từ chủng virus phân lập việt nam Luận án tiến sĩ, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 15 Phạm Văn Sơn, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Văn Cảm Nguyễn Bá Hiên (2017) "Nghiên cứu ổn định số đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-01 phân lập Việt Nam" Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 15(2).tr 13 16 Tô Long Thành Nguyễn Văn Long (2007) “Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn”, Khoa học kỹ thuật thú y." Khoa học kỹ thuật thú y XIV (3).tr 17 Wiliam T, Christianson H S Joo (2001) "Hội chứng sinh sản hô hấp lợnPorcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS)." Khoa học thú y VIII (2).tr.74-87 II Tài liệu tiếng Anh: 18 Allende R., G F Kutish, W Laegreid, Z Lu, T L Lewis, D L Rock, J Friesen, J A Galeota, A R Doster and F A Osorio (2000) "Mutations in the genome of porcine reproductive and respiratory syndrome virus responsible for the attenuation phenotype." Arch Virol 145(6) pp 1149-1161 19 An T.-Q., Z.-J Tian, C.-L Leng, J.-M Peng and G.-Z Tong (2011) "Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Asia." 20 Bahnemann H G (1990) "Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with particular reference to the application of binary ethylenimine" Vaccine 8(4): 299-303 21 Bautista E M., S M Goyal, I J Yoon, H S Joo and J E Collins (1993) "Comparison of porcine alveolar macrophages and CL 2621 for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and anti-PRRS antibody" J Vet Diagn Invest 5(2) pp 163-165 22 Beura L K., S N Sarkar, B Kwon, S Subramaniam, C Jones, A K Pattnaik and F A Osorio (2010) "Porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 1beta modulates host innate immune response by antagonizing IRF3 activation" J Virol 84(3) pp 1574-1584 23 Bloemraad M., E P de Kluijver, A Petersen, G E Burkhardt and G Wensvoort (1994) "Porcine reproductive and respiratory syndrome: temperature and pH stability of Lelystad virus and its survival in tissue specimens from viraemic pigs" Vet Microbiol 42(4) pp 361-371 71 24 Burch R A., E E Maso, P R Pujadas and N S Roca (1999) Attenuated strain of the virus causing the porcine reproductive respiratory syndrome (PRRS), and vaccines, Google Patents 25 Chand R J., B R Trible and R R Rowland (2012) "Pathogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus." Curr Opin Virol 2(3): 256-263 26 Charerntantanakul W (2012) "Porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Immunogenicity, efficacy and safety aspects." World journal of virology 1(1): 23 27 Charerntantanakul W., R Platt, W Johnson, M Roof, E Vaughn and J A Roth (2006) "Immune responses and protection by vaccine and various vaccine adjuvant candidates to virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus" Vet Immunol Immunopathol 109(1-2) pp 99-115 28 Collins J (1991) "Newly recognized respiratory syndromes in North American swine herds." American Association of Swine Practitioners Newsletter 3(7): 29 Collins J E., D A Benfield, W T Christianson, L Harris, J C Hennings, D P Shaw, S M Goyal, S McCullough, R B Morrison, H S Joo and et al., (1992) "Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs." J Vet Diagn Invest 4(2) pp 117-126 30 De Lima, M., A K Pattnaik, E F Flores and F A Osorio (2006) "Serologic marker candidates identified among B-cell linear epitopes of Nsp2 and structural proteins of a North American strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus" Virology 353(2) pp 410-421 31 Delrue I., P L Delputte and H J Nauwynck (2009) "Assessing the functionality of viral entry-associated domains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus during inactivation procedures, a potential tool to optimize inactivated vaccines" Veterinary research 40(6) pp 1-15 32 Duan, X., H J Nauwynck and M B Pensaert (1997) "Virus quantification and identification of cellular targets in the lungs and lymphoid tissues of pigs at different time intervals after inoculation with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (virus PRRS)." Vet Microbiol 56(1-2) pp 9-19 33 EC (1991) "New Pig Disease" European Parliament Technical sheet Strasburd: 72 34 Feng Y., T Zhao, T Nguyen, K Inui, Y Ma, T H Nguyen, V C Nguyen, D Liu, Q A Bui, L T To, C Wang, K Tian and G F Gao (2008) "Porcine respiratory and reproductive syndrome virus variants, Vietnam and China, 2007" Emerg Infect Dis 14(11) pp 1774-1776 35 Goyal S M (1993) "Porcine reproductive and respiratory syndrome." J Vet Diagn Invest 5(4) pp 656-664 36 Gulyaeva A., M Dunowska, E Hoogendoorn, J Giles, D Samborskiy and A E Gorbalenya (2017) "Domain Organization and Evolution of the Highly Divergent 5' Coding Region of Genomes of Arteriviruses, Including the Novel Possum Nidovirus." J Virol 91(6) 37 Halbur P G., P S Paul, M L Frey, J Landgraf, K Eernisse, X J Meng, J J Andrews, M A Lum and J A Rathje (1996) "Comparison of the antigen distribution of two US porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus" Vet Pathol 33(2) pp 159-170 38 Halbur P G., P S Paul, M L Frey, J Landgraf, K Eernisse, X J Meng, M A Lum, J J Andrews and J A Rathje (1995) "Comparison of the pathogenicity of two US porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus." Vet Pathol 32(6) pp 648-660 39 Keffaber K (1989) "Reproductive failure of unknown etiology." American Association of Swine Pracitioners Newletter 1: 10 40 Kim H S., J Kwang, I J Yoon, H S Joo and M L Frey (1993) "Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line." Arch Virol 133(3-4) pp 477-483 41 Kim H., H K Kim, J H Jung, Y J Choi, J Kim, C G Um, S B Hyun, S Shin, B Lee, G Jang, B K Kang, H J Moon and D S Song (2011) "The assessment of efficacy of porcine reproductive respiratory syndrome virus inactivated vaccine based on the viral quantity and inactivation methods." Virol J 8: 323 42 Kimman T G., L A Cornelissen, R J Moormann, J M Rebel and N StockhofeZurwieden (2009) "Challenges for porcine reproductive and respiratory syndrome virus (VIRUS PRRS) vaccinology." Vaccine 27(28) pp 3704-3718 43 Labarque G., S Van Gucht, K Van Reeth, H Nauwynck and M Pensaert (2003) "Respiratory tract protection upon challenge of pigs vaccinated with attenuated porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines." Vet Microbiol 95(3) pp 187-197 73 44 Lee J A., B Kwon, F A Osorio, A K Pattnaik, N H Lee, S W Lee, S Y Park, C S Song, I S Choi and J B Lee (2014) "Protective humoral immune response induced by an inactivated porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressing the hypo-glycosylated glycoprotein 5." Vaccine 32(29) pp 3617-3622 45 Lopez O J and F A Osorio (2004) "Role of neutralizing antibodies in VIRUS PRRS protective immunity." Vet Immunol Immunopathol 102(3) pp 155-163 46 Loula T (1991) "Mystery pig disease." Agri-Practice (USA) 47 Martelli P., P Cordioli, L G Alborali, S Gozio, E De Angelis, L Ferrari, G Lombardi and P Borghetti (2007) "Protection and immune response in pigs intradermally vaccinated against porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) and subsequently exposed to a heterologous European (Italian cluster) field strain." Vaccine 25(17) pp 3400-3408 48 Morrison R B., J E Collins, L Harris, W T Christianson, D A Benfield, D W Chladek, D E Gorcyca and H S Joo (1992) "Serologic evidence incriminating a recently isolated virus (ATCC VR-2332) as the cause of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS)." J Vet Diagn Invest 4(2) pp 186-188 49 Murtaugh M P., M R Elam and L T Kakach (1995) "Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus." Arch Virol 140(8) pp 1451-1460 50 Murtaugh M P., Z Xiao and F Zuckermann (2002) "Immunological responses of swine to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection." Viral immunology 15(4) pp 533-547 51 OIE (2015) "Porcine reproductive and respiratory syndrome." (cited 2019 20/03/2019); Available from: http://www.oie.int/standard-setting/terrestrial-manual/access-online/ 52 Ostrowski M., J A Galeota, A M Jar, K B Platt, F A Osorio and O J Lopez (2002) "Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain" J Virol 76(9) pp 4241-4250 53 Paton D J., I H Brown, S Edwards and G Wensvoort (1991) "'Blue ear' disease of pigs." Vet Rec 128(26).pp 617 54 Paton D., I Brown, S Edwards and G Wensvoort (1991) "'Blue ear' disease of pigs." Vet Rec 128(24) pp 574 74 55 Pileri E and E Mateu (2016) "Review on the transmission porcine reproductive and respiratory syndrome virus between pigs and farms and impact on vaccination." Vet Res 47(1).pp 108 56 Plagemann P G and V Moennig (1992) "Lactate dehydrogenase-elevating virus, equine arteritis virus, and simian hemorrhagic fever virus: a new group of positive-strand RNA viruses." Adv Virus Res 41 pp 99-192 57 Rossow K D (1998) "Porcine reproductive and respiratory syndrome." Vet Pathol 35(1) pp 1-20 58 Shimizu M., S Yamada, Y Murakami, T Morozumi, H Kobayashi, K Mitani, N Ito, M Kubo, K Kimura, M Kobayashi and et al., (1994) "Isolation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus from Heko-Heko disease of pigs." J Vet Med Sci 56(2) pp 389-391 59 Silva J., D Rocha, I Cunha, L R Sales, F Neto, M Fontes and J Simões (2015) "Serological profile of offspring on an intensive pig farm affected by porcine reproductive and respiratory syndrome" Asian Pacific Journal of Reproduction 4(4) pp 317-321 60 Terpstra C., G Wensvoort and J M Pol (1991) "Experimental reproduction of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease) by infection with Lelystad virus: Koch's postulates fulfilled" Vet Q 13(3) pp 131-136 61 Terpstra C., G Wensvoort and J Pol (1991) "Experimental reproduction of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease) by infection with Lelystad vims: Koch's postulates fulfilled" Veterinary Quarterly 13(3) pp 131-136 62 Tian K., X Yu, T Zhao, Y Feng, Z Cao, C Wang, Y Hu, X Chen, D Hu and X Tian (2007) "Emergence of fatal VIRUS PRRS variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark" PloS one 2(6): e526 63 Tong G Z., Y J Zhou, X F Hao, Z J Tian, T Q An and H J Qiu (2007) "Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome, China" Emerg Infect Dis 13(9) pp 1434-1436 64 Vet Rec (1992) "Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS or blueeared pig disease)" Vet Rec 130(5) pp 87-89 75 65 Wensvoort G., C Terpstra, J M Pol, E A ter Laak, M Bloemraad, E P de Kluyver, C Kragten, L van Buiten, A den Besten, F Wagenaar and et al., (1991) "Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus" Vet Q 13(3) pp 121-130 66 White,M (1991) "'Blue ear'disease of pigs." Veterinary Record (United Kingdom) 67 WHO (1992) Good Maunfacturing practices for biological products, WHO (cited 2019 20/03/2019); Available from: https://www.who.int/biologicals/areas/vaccines/Annex_2_WHO_Good_manufacturing_ practices_for_biological_products.pdf 68 WHO (2011) WHO good manufacturing practices for sterile pharmaceutical products (cited 2019 20/03/2019); Available from: http://www.who.int /medicines/services/expertcommittees/pharmprep/GMP-Sterile_QAS09295.pdf 69 WHO (2014) WHO good maunfacturing practices for pharmaceutical products: Main principles (cited 2019 20/03/2019); Available from: https://www.who.int/medicines/areas/quality_safety/quality_assurance/GMPPhar maceuticalProductsMainPrinciplesTRS961Annex3.pdf 70 Yoo D., C Song, Y Sun, Y Du, O Kim and H C Liu (2010) "Modulation of host cell responses and evasion strategies for porcine reproductive and respiratory syndrome virus" Virus Res 154(1-2).pp 48-60 76 ... cứu sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn quy mô công nghiệp 26 3.4.2 Kiểm nghiệm vắc xin vơ hoạt nhũ dầu phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn. .. Nơng nghiệp Việt Nam chủ trì “Nghiên cứu cơng nghệ sản xuất vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn? ??, Tiến hành sản xuất vắc xin quy mô công nghiệp nhà máy sản xuất vắc xin Avac. .. thiện quy trình sản xuất quy mơ cơng nghiệp vắc xin vơ hoạt nhũ dầu phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn công ty TNHH MTV Avac Việt Nam? ?? 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu hồn thiện quy