(TIỂU LUẬN) KIẾN tập sản XUẤT đề tài TÁCH các PHÂN đoạn từ CAO TỔNG ETHANOL của lá cây SEN (nelumbo nucifera gaertn )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI BỘ MƠN KỸ THUẬT HĨA HỌC HỌC PHẦN: KIẾN TẬP SẢN XUẤT ĐỀ TÀI: TÁCH CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ CAO TỔNG ETHANOL CỦA LÁ CÂY SEN (Nelumbo nucifera Gaertn ) Người hướng dẫn: TS.DS Phạm Ngọc Khanh TS Ngô Xuân Đại Họ tên: Mã Nguyễn Thị Kim Khánh sinh viên: 1851181975 Lớp: 60KTH HÀ NỘI, 04/2022 MỞ ĐẦU Học phần Kiến tập sản xuất thực phòng Hoạt chất Sinh học, Viện Hóa học Hợp chất Thiên nhiên Thời gian từ 15/02/2022đến 03/04/2022 Người hướng dẫn: TS.DS Phạm Ngọc Khanh TS Ngô Xuân Đại Nội dung báo cáo kiến tập gồm: Tìm hiểu nơi kiến tập Tìm hiểu Lá Sen, phương pháp chiết phương pháp sắc ký (bản mỏng, cột) Tiến hành tách chiết chất từ Lá Sen (Nelumbo nucifera Gaernt) MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Phòng Hoạt chất sinh học [1] 1.1.1 Chức nhiệm vụ 1.1.2 Cơ cấu tổ chức 1.1.3 Cơ sở vật chất 1.1.4 Hướng nghiên cứu, đào tạo sản phẩm phòng Hoạt chất sinh học 1.2 Tìm hiểu Sen 1.2.1 Cây sen (Nelumbo nucifera) 1.2.2 Tình hình nghiên cứu 1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 1.2.3.Tác dụng sinh học 1.2.4 Phương pháp chiết CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Nguyên liệu, hóa chất dụng cụ 2.2 Thực nghiệm kết 2.2.1 Chiết phân đoạn n- hexan, diclometan, etyaxetat, butanol từ cao Sen TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Phòng Hoạt chất sinh học [1] Phòng Hoạt chất Sinh học thuộc Viện Hóa học Hợp chất Thiên nhiên, thành lập vào ngày 05 tháng 06 năm 1992 Địa chỉ: Phòng 602, 603 tầng 6, nhà 1H, số 18 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội 1.1.1 Chức nhiệm vụ a) Chức Phòng Hoạt chất Sinh học nghiên cứu triển khai lĩnh vực Hoá học Hợp chất Thiên nhiên, Hoá dược Tổng hợp Hữu b) Nhiệm vụ Nghiên cứu khai thác hợp lý Hơp chất Thiên nhiên từ tài nguyên thực vật gồm có: Phát hiện, nghiên cứu khai thác chất có Hoạt tính sinh học tài nguyên thực vật nghiên cứu ứng dụng cho công nghiệp dược, nông nghiệp xuất Nghiên cứu tổng hợp toàn phần bán tổng hợp chất chất hữu cơ, đặc biệt chất có hoạt tính sinh học cao, có khả ứng dụng dược phẩm xuất Nghiên cứu công nghệ phục vụ cho ngành công nghiệp lĩnh vực hoá học hợp chất thiên nhiên, công nghiệp dược, thực phẩm Xây dựng triển khai phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học, phương pháp phân tích thành phần dược liệu thiên Đào tạo cán sau đại học thuộc lĩnh vực “Hoá học hợp chất thiên nhiên” mã số 9.44.01.17 1.1.2 Cơ cấu tổ chức Trưởng phòng: GS.TS Nguyễn Mạnh Cường Các cán cơng tác phịng trình bày Bảng 1.1: Bảng 1: Danh sách thành viên phòng Hoạt chất sinh học STT Họ tên GS.TS Nguyễn Mạnh Cường TS Phạm Ngọc Khanh TS Trần Thu Hường ThS Vũ Thị Hà ThS Hoàng Thị Ngọc Ánh 1.1.3 Cơ sở vật chất Bộ cất dung môi Bộ chiết tách Bộ cô quay chân không Máy hứng phân đoạn Máy trung áp Máy siêu âm Máy xay Hình 1: Thiết bị phịng Hoạt chất sinh học 1.1.4 Hướng nghiên cứu, đào tạo sản phẩm phịng Hoạt chất sinh học Các nghiên cứu Phịng có quan hệ hợp tác quốc tế lâu với Hàn Quốc nghiên cứu thành phần sinh hóa thuốc, điều tra sàng lọc hoạt chất từ thuốc Hợp tác với Ý thuốc điều trị bệnh tim Hợp tác với Nhật, Mông Cổ, Slovakia Pháp việc xây dựng tiếp thu công nghệ tối ưu để tách chiết chất có hoạt tính từ thiên nhiên, tạo chế phẩm sinh học sử dụng Y, Dược, Nông nghiệp, Công nghiệp thực phẩm Phòng phát triển nghiên cứu lĩnh vực sàng lọc ảo nghiên cứu (docking) phương pháp tính toán khác để nghiên cứu chế tác dụng hoạt chất có tiềm ứng dụng nghiên cứu phát triển thuốc Đã thu định danh 350 lồi thực vật Việt Nam Phịng đặc biệt nghiên cứu sâu thuốc chữa bệnh gan, tim mạch ung thư Đã thực 15 đề tài, dự án nghiên cứu thuốc Đã công bố hàng trăm báo tạp chí nước quốc tế, Cục sở hữu trí tuệ cấp 10 phát minh sáng chế, giải pháp hữu ích, biên soạn xuất 01 sách chuyên khảo Công tác đào tạo: Phịng Hoạt chất sinh học ln trọng công tác đào tạo, nâng cao nghiệp vụ cho cán đơn vị, đồng thời tích cực tham gia công tác đào tạo cán cho đơn vị liên kết với phòng Hiện tại, phòng Hoạt chất sinh học có 07 nghiên cứu sinh làm luận án theo hướng nghiên cứu phịng (trong có 02 NCS cán phòng, 05 NCS cán sở đào tạo khác), 10 học viên cao học 1.2 Tìm hiểu Sen 1.2.1 Cây sen (Nelumbo nucifera) a) Mơ tả [2] Sen (Nelumbo nucifera GAERTN) lồi thực vật có hoa nước thuộc họ nelumbonaceae có tên khoa học Nelumbo nucifera Loại lâu năm biết đến với nhiều tên thông dụng khác như: sen thiêng, sen Ấn Độ, hoa súng Trung Quốc Lồi tìm thấy chủ yếu nước Châu Á Thái Lan, Trung Quốc, Sri Lanka, Ấn Độ, Nepal, New Guinea Nhật Bản Hơn nữa, Sen trồng Úc Nga du nhập vào Tây Âu Châu Mỹ từ lâu Cây công nhận rộng rãi vẻ đẹp hoa coi biểu tượng tinh thần cho Phật giáo, Ấn Độ giáo Ai Cập từ thời cổ đại Hoa sen người theo đạo Hindu coi linh thiêng, toàn lại coi linh thiêng theo tín đồ Phật giáo Vì vẻ đẹp mà hoa quốc hoa Ấn Độ Việt Nam Ngồi đặc điểm trên, Sen cịn sử dụng nguồn nguyên liệu cho ăn thành phần quan trọng thuốc cổ truyền thuốc thảo dược Do đó, tổng quan tơi giới thiệu thành phần hóa học, tác dụng sinh học ứng dụng thực tế hoa sen Hình 2: Cây sen b, Đặc điểm thực vật, sinh thái sen Về mặt thực vật học, Nelumbo nucifera (Gaertn,) đơi cịn gọi theo danh pháp cũ Nelumbium speciosum (Willd.) hay Nymphaea nelumbo Đây loại thủy sinh sống lâu năm Trong thời kỳ cổ đại loại mọc phổ biến dọc theo bờ sông Nin Ai Cập với loài hoa súng có quan hệ họ hàng gần gũi có tên gọi dài dịng hoa sen xanh linh thiêng sơng Nin (Nymphaea caerulea) Dạng thân thảo mọc nước, sống dai nhờ thân rễ (ngó sen) Ngó sen màu trắng, tiết diện gần trịn, có khía dọc màu nâu, có mang chồi hình chóp nhọn Thân rễ phình to thành củ, màu vàng nâu, hình dùi trống, gồm nhiều đoạn, thắt lại giữa, có nhiều khuyết rộng Lá hình lọng có thùy sâu đối xứng nhau, dài 30-55 cm, rộng 20-30 cm, mép uốn lượn, mặt xanh đậm, nhẵn bóng; mặt xanh nhạt, nhám Gân tỏa tròn, rõ mặt Cuống màu xanh, hình trụ, dài 1-1,5m, rám, có nhiều gai Hoa đơn độc, to, màu hồng hay trắng Cuống hoa màu xanh, dài 1,3-1,5 m, già chuyển sang màu nâu, có nhiều gai nhọn Cuống cuống hoa có nhiều khoang rỗng bên Đế hoa lồi dạng hình nón ngược, mép lồi lõm, xốp, non màu vàng, già màu xanh, dài 5-7 cm, đường kính 6-8 cm, chứa nhiều sen Bao hoa gồm 12- 16 phiến xếp xoắn ốc không phân biệt rõ đài cánh hoa, bên 3-5 phiến màu xanh hồng, dài 3-6 cm; bên phiến thuôn dài hình thuyền, dài 9-16 cm, rộng 4-9 cm, màu trắng hồng, đậm bìa cánh hoa, nhiều gân dọc rõ mặt dưới; móng ngắn, màu trắng, hình chữ nhật loe Bộ nhị: nhiều, rời, đều, đính xoắn ốc, nhị màu trắng, hình sợi, dài 7-9 mm, nhẵn; chung đới màu trắng, hình sợi, dài 1,2-1,3 cm, đầu chung đới kéo dài thành hình chùy (gạo sen), màu trắng, dài 4-5 mm; bao phấn ô, màu vàng, thuôn dài, nứt dọc, hướng ngoại, đính đáy, hạt phấn hình bầu dục hay hình trứng, màu vàng, dài 57-75 µm, có rãnh Bộ nhụy nhiều nỗn rời đính thành nhiều vịng vùi sâu đế hoa, bầu màu vàng nhạt, hình bầu dục dài 6-11 mm, rộng 3-4 mm, có nỗn đính Vịi nhụy ngắn, đầu nhụy hình trịn, lõm Quả bế màu xanh, nhẵn, hình bầu dục, dài 1,7-2,5 cm, đường kính 0,6-1,2 cm, Hạt màu trắng, dài 1,3-1,5 m, đường kính 5-6 mm, mầm dày mập màu trắng bên có tâm sen màu xanh Tâm sen gồm rễ mầm, thân mầm, chồi mầm đầu tiên; rễ mầm không rõ; thân mầm màu xanh, dài 3-4 mm, tiết diện bầu dục, nhẵn bóng; đầu tiên, to, nhỏ, cuống mầm màu xanh, hình móc câu, tiết diện đa giác, dài 1,8-2 cm, phiến mầm hai mép cuộn vào tạo thành đoạn dài 6-7 mm Nelumbo lutea loài sen thứ hai có màu trắng thấy phổ biến Bắc Mỹ Thế giới có chi lồi, phân bố nhiệt đới cận nhiệt đới châu Á, châu Úc, Bắc Mỹ Ở Việt Nam có lồi c) Thành phần hóa học Lá có nhiều alkaloid phân lập xác định cấu trúc: nuciferin(1), anonain(2), roemerin(3), coclaurin(7), Pronuciferin(4), 4-methyl N-nornuciferin(5), -N-methylcoclaurin(8), O-nornuciferin(6), nepherin(9), N-methyl- liriodenin(10), dehydroroemerin(11), armepavin(12), dehydronuciferin(13), dehydroanonain(14), N7 methylisococlaurin(15), Nuciferin thành phần chính, ngồi alkaloid sen cịn có flavonoid: quercetin, isoquercitrin, leucocyanidin, leucodelphinidin Bảng 2: Cấu trúc nuciferin (1) Nuciferin(1) N-Nornuciferin(5) O-Nornuciferin(6) Anonain(2) Roemerin(3) O O Liriodenin(10) RO N-R2 R1O HO Bảng 3: Công thức cấu tạo số chất có sen Arm N-met N-methyl Tâm sen có alkaloid sau biết: liensinin(16), isoliensinin(17), methylcorypallin(18), neferin(19), lotusin(20), 1(p-hydroxybenzyl) 6,7-dihydroxy-1,2,3,4tetra-hydroisoquinolin(21), Gương sen có quercetin(22), 4,9% chất đạm, 0,6% chất béo, 9% carbohydrat lượng nhỏ vitamin C 0,017% HO + - N (CH3)2 CH3O H HO Lotusin(20) CH3-N OCH3 CH3O H N-CH3 OR OR1 O H R2O Bảng 4: Công thức cấu tạo số chất có tâm sen Liensinin(16) Isoliensinin(17) Neferin(19) Hạt Sen chứa nhiều tinh bột (60%), đường raffinose, 1% chất đạm, 2% chất béo có số chất khác canxi 0,089%, phosphor 0,285%, sắt 0,0064%, với chất lotusine, demethyl coclaurine, liensinine, isoliensinine Tua nhị Sen có tannin Ngó Sen chứa 70% tinh bột, 8% asparagin, arginin, trigonellin, tyrosinglucose, vitamin C, A, B, PP, tinh bột tannin 1.2.2 Tình hình nghiên cứu 1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu giới a, Nghiên cứu ankaloid -Năm 1898 Greshoff năm 1899 Boorsma tách alkaloid “nelumbin” từ tâm sen [3] Nelumbin chất màu trắng có vị đắng, thể cứng dịn 40-45 oC, 65oC chất sển sệt, dễ tan rượu, chloroform, ether-ethylic, aceton, acid loãng cồn amylic, gần không tan ether dầu hỏa, cho kết tủa với thuốc thử alkaloid b, Nghiên cứu flavonold - Năm 1961 từ sen tươi T Nakaoki tách 0,1% nelumbosid Qucreetinglycosid (Monoglucocuronid isoqucjcirin) [3] 10 - Năm 1962 W Rahman cho biết Kacmpferol-3-galactorhamnosid flavonoid hoa sen, kết trình bày bảng 1: Bảng 1: Các flavonold có phận khác sen STT Tê Qu Iso Lu Gl Le leu Năm 1988 Ishida Hitoshi cộng tách nhận dạng flavonoid quercelin từ gương sen N nucifera Gaertn [4] c, Nghiên cứu hương thơm hoa sen [N nucifera Gertn, N lutea (Willd) Pers] Năm 1989 Omatu Akihiko cộng cho biết hợp chất thơm dễ bay hoa sen nghiên cứu Hương thơm nhị hoa giống hương thơm hoa sen, nhị hoa dùng để nghiên cứu Kết cho thấy thành phần 1,4-dimethoxybenzen tìm thấy hoa lồi N lutea cao loài N nucifera Thành phần dường tăng thêm hàng ngày suốt thời gian hoa nở Từ nhị hoa N nucifera phân tích 61 thành phần thành phần hydrocacbon mạch thẳng, thành phần chiếm 73% 1,4-dimeloxybenzen, limonen, linalool terpinon-4-ol thành phần có ý nghĩa để phát mùi thơm sen [5], [6], [7] d, Thành phần protein amino acid hạt sen Năm 1996 Liu Jianqiu cộng cho biết thành phần phấn hoa sen gồm có: Tổng số nitrogen 3,25%, protenin 20,32%, muối đường 22,28%, acid amin 26,41%, ngun tố vơ vitamin có nhiều phấn hoa [8] e, Hợp chất flavor sen (chất tăng mùi vị) 11 Năm 1992 Fu Shuiyu cộng cho biết hợp chất flavor tự nhiên lấy từ sen N nucifera Gaertn nhận dạng là: cis-3-hexenol (40,41%), dephenylamin (8,35%), α-longgilolen (5,6%), hexanol (3,65%), Benzen (3,12%) [9] 1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu nước a, Nghiên cứu alkaloid Năm 1987 Phan Quốc Kinh cộng chiết suất phân lập sắc ký lớp mỏng từ dịch chiến sen (N, nucifera Gaertn), alkaloid Qua đo độ chảy, đo phổ tử ngoại chất thấy phù hợp với nuciferin ghi tài liệu [10] b, Nghiên cứu flavonoid Năm 1980 Bế Thị Thuấn cộng chiết suất phân lập từ sen (N nucifera Gaertn), chất kết tinh màu vàng, điểm chảy 226’’-228’’, đo độ phổ tử ngoại dung dịch trung tính có đỉnh hấp phụ cực đại bảng I 365nm bảng II 257nm Tác giả dự đoán chất phân lập isoquercitrin (quercetin-3-glucosid) quercitrin (quercitrin-3-rhamnosid) [11] 1.2.3.Tác dụng sinh học 1.2.3.1 Tác dụng sinh học alkaloid phân lập từ sen loài N nucifera Gaertn a, Neferin - Tác dụng lên tim mạch Năm 1986 Nishibe Sansci cộng cho biết neferin (1 alkaloid tâm sen) có tác dụng điều trị cao huyết áp [12] - Năm 1988 Li Guirong cộng nghiên cứu tác dụng referin tim thể cô lập Kết cho thấy tác dụng loạn nhịp cua neferin có liên quan đến ức chế vận chuyển qua màng ion Na+ Ca+ [13] b, Liensinin -Tác dụng lên tim mạch Năm 1989 Pan Jingxian cộng cho biết Jiensinin có hoạt tính đối kháng calci, phương pháp định lượng gắn(3H) - diltiazem vào thụ cảm Nòng độ ức chế IC 50 liensinin 2,6 x 10-7mol/L c, Nuciferin 12 -Tác dụng hệ thần kinh trung ương Năm 1978 Bhattacharyra cộng nghiên cứu dược lý tâm thần chế phẩm nuceferin Kết cho thấy nuciferin gây tác dụng ức chế thụ thể dopamin giống clopromazin thuốc giang thần khác Tuy nhiên nuciferin làm tăng tác dụng chống co giật phenylhydanton Đặng Hồng Vân, Phan Quốc Kinh cộng thử sơ tác dụng an thần ankaloid tách từ alkaloid toàn phần sen (nuceferin) chuột nhắt trắng, chuột đực nặng từ 15-18g, với liều 0,1ml dung dịch 1% nuciferin cho (tiêm da bụng) Kết cho thấy nuciferin có tác dụng an thần 1.2.4 Phương pháp chiết Phương pháp chiết bao gồm việc chọn dung môi, dụng cụ cách chiết Một phương pháp chiết thích hợp hoạch định biết rõ thành phần chất cần biết Mỗi loại hợp chất có độ hịa tan khác loại dung mơi Vì khơng thể có phương pháp chiết chung cho tất dược liệu Có hai phương pháp chiết: Phương pháp 1: Phương pháp chiết nhằm mục đích nghiên cứu sơ chưa biết rõ thành phần hóa học dược liệu Phương pháp sử dụng dãy dung môi từ không phân cực đến phân cực mạnh để phân đoạn hợp chất khỏi dược liệu Phương pháp 2: Phương pháp chiết xuất cần thiết cần chiết lấy toàn thành phần dược liệu dung mơi thích hợp methanol etanol (80%) Nhất methanol xem dung môi vạn năng, hịa tan chất khơng phân cực thời có khả tạo dây nối hydro với nhóm phân cực khác Dịch chiết với methanol thu được, đem loại hết dung môi thu cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất dược liệu Khi cần tách phân đoạn hợp chất cao sử dụng dung mơi khơng hịa lẫn với nước có độ phân cực từ yếu đến mạnh Cách chiết có cách chiết: Chiết nhiệt độ thường: Cách chiết thông thường ngấm kiệt ngâm phân đoạn Chiết nóng: Nếu dung mơi chất bay áp dụng cách chiết liên tục hồi 13 lưu, dung mơi nước sắc đặc hãm phân đoạn Để thu hồi dung môi, sử dụng máy cô quay chân không áp suất giảm để đạt hiệu cao 14 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Nguyên liệu, hóa chất dụng cụ Nguyên liệu: Lá sen thu mua Hưng Yên mẫu sen lưu giữ phịng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên Người giám định mẫu sen: Nguyễn Quốc Bình bảo tàng thiên nhiên Việt Nam Hình 2.1: Mẫu sen Hóa chất Methanol n-hexan Diclometan Etylaxetat Dụng cụ Bình tam giác Bộ quay Cân phân tích Máy xay Bình chiết Vải lọc 2.2 Thực nghiệm kết 2.2.1 Chiết phân đoạn n- Hexan, diclometan, etyaxetat, butanol từ cao Sen Cân lượng cao sen nồi là: 950g nồi: chiết Đã phân đoạn nHexan Sen - H1 15 - Đã chiết phân đoạn Diclometan Sen - D1 - Đã chiết phân đoạn Etylaxetat Sen - E1 - Đã chiết phân đoạn BuOH thu Sen- B1 - Đã chiết phân đoạn Nước N1 Quá trình chiết phân bố cao tổng ethanol từ Sen trình bày hình 2.2: Hình 2.2: Sơ đồ chiết phân bố Cao tổng Ethanol từ Lá Sen Bước 1: Xử lí bột sen Lá sen thu mua Hưng Yên cắt thành miếng nhỏ Dùng máy nghiền sen thành bột thu 5kg bột sen khô Ngâm với ethanol để qua đêm, nhiệt độ phòng Lọc qua lớp vải thu dịch chiết, gom dịch chiết Sau cô quay chân không áp suất thấp để loại bỏ dung môi, thu 400g cao Sen Bước 2: Chiết phân bố cao tổng ethanol Đem hòa tan 400g cao ethanol với 400ml nước Sau đem chiết phân bố dung mơi có độ phân cực tăng dần với tỉ lệ mẫu: dung môi (1:2), cô quay dịch thu 2,265g cao hexan, 23,7550g CH2Cl2, 7,9633g etyl axetat, 24,88g Butanol 25,1708g nước 16 ... khác), 10 học viên cao học 1.2 Tìm hiểu Sen 1.2.1 Cây sen (Nelumbo nucifera) a) Mô tả [2] Sen (Nelumbo nucifera GAERTN) lồi thực vật có hoa nước thuộc họ nelumbonaceae có tên khoa học Nelumbo nucifera. .. đoạn Etylaxetat Sen - E1 - Đã chiết phân đoạn BuOH thu Sen- B1 - Đã chiết phân đoạn Nước N1 Quá trình chiết phân bố cao tổng ethanol từ Sen trình bày hình 2.2: Hình 2.2: Sơ đồ chiết phân bố Cao. .. Chiết phân đoạn n- Hexan, diclometan, etyaxetat, butanol từ cao Sen Cân lượng cao sen nồi là: 950g nồi: chiết Đã phân đoạn nHexan Sen - H1 15 - Đã chiết phân đoạn Diclometan Sen - D1 - Đã chiết phân