ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu là những bệnh nhân UTPKPTBN giai đoạn IV có chỉ định xét nghiệm đột biến gen EGFR tại Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai năm 2017 đáp ứng các tiêu chuẩn chọn lựa và tiêu chuẩn loại trừ
Bệnh nhân có đầy đủ thông tin hành chính, giai đoạn bệnh, kết quả mô bệnh học và một số xét nghiệm cận lâm sàng khác nhƣ CEA, Cyfra 21-1,
Bệnh nhân đã đƣợc chẩn đoán xác định UTPKPTBN dựa trên kết quả mô bệnh học theo tiêu chuẩn của WHO 2004, UTPKPTBN bao gồm: ung thƣ biểu mô vảy; ung thƣ biểu mô tuyến; ung thƣ biểu mô tuyến vảy; ung thƣ biểu mô tế bào lớn, ung thƣ biểu mô tế bào sáng; ung thƣ biểu mô tế bào khổng lồ [48]
Bệnh nhân UTPKPTBN giai đoạn IV theo tiêu chuẩn của AJCC 2010 : T bất kỳ, N bất kỳ, M1 [26]
Bệnh nhân đồng ý cung cấp thông tin cho nghiên cứu
Bệnh nhân không đáp ứng tiêu chuẩn chọn lựa
Hồ sơ bệnh án không đủ thông tin phục vụ nghiên cứu
Bệnh nhân chƣa đƣợc chẩn đoán xác định và chẩn đoán giai đoạn UTPKTBN.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang
Tất cả bệnh nhân đáp ứng tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ nhƣ miêu tả trên
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
2.2.3 Các biến số, chỉ số trong nghiên cứu
Thông tin chung của đối tƣợng nghiên cứu:
Tuổi, giới, địa chỉ, lý do vào viện; tiền sử hút thuốc lá, tiền sử bệnh lý ung thư của bệnh nhân và gia đình bệnh nhân, các phương pháp điều trị trước khi làm xét nghiệm đột biến gen EGFR
Kết quả xét nghiệm các marker ung thƣ nhƣ CEA, Cyfra21-1, kết quả chẩn đoán hình ảnh, PET/CT…cho thấy vị trí tổn thương ung thư nguyên phát và di căn
Kết quả xét nghiệm đột biến gen EGFR
Vị trí lấy mẫu xét nghiệm, kỹ thuật lấy mẫu
Kết quả có hay không có đột biến, loại đột biến, vị trí đột biến
Từ tháng 1 năm 2017 đến tháng 12 năm 2017.
2.2.5 Địa điểm nghiên cứu Đơn vị Gen – Tế bào gốc, Trung tâm Y học Hạt Nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu:
Thu thập thông tin nghiên cứu
Tuổi, giới, tiền sử hút thuốc, tiền sử bệnh lý bản thân, gia đình…
Lý do vào viện, chẩn đoán giai đoạn, chẩn đoán mô bệnh học, di căn, các phương pháp đã điều trị
Xét nghiệm chất chỉ điểm khối u (CEA, Cyfra 21-1), kết quả chẩn đoán hình ảnh (chụp CT phổi, PET/CT, MRI…)
Xét nghiệm đột biến gen EGFR
Vị trí lấy mẫu (u nguyên phát, hạch, tổ chức di căn cơ quan, dịch màng phổi/màng tim…)
Phương pháp lấy mẫu (sinh thiết, phẫu thuật, chọc dịch màng phổi/màng tim)
Tình trạng đột biến gen (phát hiện đột biến hay không phát hiện đột biến)
Lựa chọn bệnh nhân đáp ứng
+ Tiêu chuẩn lựa chọn + Tiêu chuẩn loại trừ
Kết luận 1 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và đột biến gen EGFR ở bệnh nhân UTPKPTBN giai đoạn IV
Một số yếu tố liên quan của đột biến gen EGFR với các đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng
Nhập số liệu vào Epidata 3.1 Phân tích số liệu bằng Stata 12.0
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
2.2.6.1 Thu thập thông tin bệnh nhân
Các thông tin chung của bệnh nhân, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, mô bệnh học, giai đoạn bệnh … đƣợc thu thập theo mẫu thống nhất bằng cách phỏng vấn kết hợp khai thác hồ sơ bệnh án
2.2.6.2 Quy trình xét nghiệm đột biến EGFR
Tách DNA (theo kit PureLink Genomic DNA Mini Kit – Invitrogen)
Thu mẫu: Dùng dao mổ cắt mẫu bệnh phẩm (mẫu sinh thiết/phẫu thuật/khối tế bào vùi paraffin), chuyển vào ống ly tâm 1,7 ml
Loại paraffin: Thêm 160–320 μl Deparaffinization Solution, trộn đều và ủ
Ly giải tế bào: Thêm 180 μl Digestion Buffer, bổ sung 20 μl Proteinase K, trộn đều Ủ 56 o C trong 1 giờ hoặc đến khi tế bào bị ly giải hoàn toàn, ủ tiếp
Cố định DNA lên cột và loại tạp chất: Thêm 200 μl Lysis/Binding Buffer, bổ sung 200 μl ethanol 96–100% và trộn đều Chuyển toàn bộ dịch ly giải tế bào lên cột thu DNA, ly tâm 6.000 ×g trong 1 phút, loại dịch
Rửa cột: Thêm 500 μl đệm rửa, đậy nắp và ly tâm 6.000 ×g trong 1 phút, loại dịch Lặp lại bước rửa trên Ly tâm 20.000 ×g trong 3 phút để làm khô màng của cột
Thu DNA: Chuyển cột lên ống ly tâm 1,7 ml sạch, thêm 50–100 μl Elution Buffer vào chính giữa màng, ủ 1-5 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 20.000 ×g trong 1 phút
Định lượng DNA: Định lượng DNA theo phương pháp huỳnh quang sử dụng Qubit dsDNA HS Assay Kit Imvitrogen trên máy Qubit® 3.0 Fluorometer
Khuếch đại gen bằng PCR (theo kit EGFR StripAssay® – ViennaLab)
Chuẩn bị enzyme Taq DNA Polymerase: Pha Taq DNA Polymerase trong Taq Dilution Buffer theo tỷ lệ thể tích tương ứng là 1:25
Chuẩn bị phản ứng: Chuẩn bị ống PCR cho mỗi phản ứng, đặt lên đá, lấy hoá chất cho mỗi phản ứng khuếch đại:
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
5 μl Taq DNA polymerase vừa chuẩn bị
5 μl DNA khuụn tổng hợp (1–10 ng/àl)
Chuyển ống vào máy PCR và chạy theo chế độ sau:
Trước chu kỳ đầu tiên: 37 o C – 10 phút
94 o C – 2 phút Chu kỳ nhiệt (33 chu kỳ): 94 o C – 15 giây
58 o C – 90 giây Sau chu kỳ cuối cùng: 60 o C – 3 phút Giữ trên đá hoặc ở 2–8 o C để sử dụng lâu dài
Lai với đầu dò đặc hiệu (theo kit EGFR StripAssay® – ViennaLab)
Biến tính sản phẩm PCR: Trộn 10 μl DNAT với 10 μl sản phẩm PCR trong giếng trên Typing Tray, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng
Lai với đầu dò trên Teststrip: Thêm 1ml Hybridization Bufer, đƣa Teststrip vào giếng, ủ 30 phút ở 45 o C, loại dịch Rửa qua Wash Solution A, ủ lắc cùng 1ml Wash Solution A ở 45 o C trong 15 phút, loại dịch (x2 lần)
Phản ứng enzyme: Thêm 1ml Conjugate Solution, ủ lắc ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, loại dịch Rửa qua Wash Solution B, ủ lắc cùng 1ml Wash
Solution B ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, loại dịch (x2 lần)
Phát triển màu: Thêm 1ml Color Deverloper, ủ lắc 15 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối Rửa Test strip vài lần bằng nước sạch, để khô trong bóng tối
Sau quá trình lai, các test strip đƣợc so sánh với thang chuẩn để đánh giá kết quả thông qua phần mềm StripAssay Evaluator ® đƣợc cung cấp bởi ViennaLab
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bảng 2.1 Các đột biến EGFR được phát hiện theo kit EGFR XL StripAssay
STT Exon Trình tự nucleotide Trình tự acid amin
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
2.2.6.3 Nhập và phân tích số liệu
Số liệu đƣợc mã hóa và nhập bằng phần mềm Epidata 3.1
Dữ liệu đƣợc phân tích bằng phần mềm Stata 12.0 với các test thống kê y học: Chi bình phương, T – test…các yếu tố liên quan đến đột biến gen EGFR có ý nghĩa khi giá trị p0,05)
3.3.3 Mối liên quan giữa đột biến EGFR với tình trạng bệnh
Bảng 3.7 Mối liên quan giữa đột biến EGFR với tình trạng bệnh Đặc điểm Phát hiện đột biến p
Phân loại mô bệnh học
Ung thƣ biểu mô tuyến 40,3%
0,730 Ung thƣ biểu mô vảy 33,3%
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Định lƣợng CEA
Tăng (≥4,3 ng/mL) 37,9% Định lƣợng Cyfra 21-1
Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ đột biến gen theo mô bệnh học, giá trị SUV max và định lƣợng các marker ung thƣ nhƣ CEA hay Cyfra 21-1 (p>0,05)
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
BÀN LUẬN
ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Trong 177 đối tƣợng nghiên cứu, độ tuổi trung bình là 61,0 ± 1,3
Trong đó, độ tuổi trên 60 tuổi chiếm 57,1% Đây là lứa tuổi nguy cơ tiếp xúc và thời gian tích lũy với các yếu tố bệnh sinh kéo dài hơn so với nhóm tuổi thấp hơn Kết quả này cũng tương đương với nghiên cứu của Vũ Văn Thịnh
(2014) và Nguyễn Thị Lan Anh (2017) lần lƣợt là 61,6 ± 11,1 và 59,6 ± 9,9
Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy, tỷ lệ nam chiếm 71,2%, gấp gần 2,5 lần nữ Tỷ lệ này tương đương so cứu của Nguyễn Thị Lan Anh
(2017) tỷ lệ nam/nữ là 2,53 [2] Tuy nhiên, nghiên cứu khác của Vũ Văn Thịnh (2014) và Trần Minh Thông (2013) cho tỷ lệ ung thƣ phổi biểu mô tuyến ở nữ có xu hướng gia tăng, tỷ lệ nam/ nữ lần lượt là 2 và 1,8 [14-15]
Kết quả khác cho thấy bệnh nhân có tỷ lệ hút thuốc lá cao (chiếm 63,3%) Điều này cũng phù hợp với khẳng định thuốc lá là một yếu tố bệnh sinh trong bệnh ung thƣ phổi và nam giới có tỷ lệ mắc ung thƣ phổi cao hơn nữ Mặt khác, có một tỷ lệ không nhỏ khoảng 20,1% bệnh nhân có tiền sử gia đình có người mắc ung thư phổi hoặc các loại ung thư khác
Hình 3.1 cho thấy bệnh nhân UTPKPTBN vào viện với các triệu chứng lâm sàng đa dạng, chủ yếu là các triệu chứng của cơ quan hô hấp nhƣ ho khan hoặc ho ra máu, khó thở, đau tức ngực chiếm 67,2% Tiếp sau là các triệu chứng của cơ quan di căn chiếm 39,0%, bao gồm: di căn hạch (6,2%), di căn cơ quan (tràn dịch màng phổi, màng tim, đau xương khớp, đau đầu, chóng mặt hoặc có các dấu hiệu thần kinh khu trú…, tỷ lệ 32,8%) Ngoài ra, ở bệnh nhân ung thƣ phổi giai đoạn IV, triệu chứng toàn thân với biểu hiện mệt mỏi, sốt không rõ nguyên nhân hay chán ăn, sút cân… cũng thường thấy với tỷ lệ khoảng 10,7% Kết quả trên tương đồng so với nghiên cứu trên 152 bệnh nhân ung thƣ biểu mô tuyến của tác giả Nguyễn Thị Lan Anh năm 2017, các triệu chứng hô hấp là thường gặp nhất chiếm 65,0%, triệu chứng di căn tại
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU chỗ và di căn xa đứng thứ 2 với 36,2%, các biểu hiện toàn thân có ở 11,8% bệnh nhân [2] Tuy nhiên, nghiên cứu cũng cho thấy có một tỷ lệ nhỏ khoảng 8,5% bệnh nhân ở giai đoạn IV, đã di căn xa nhƣng không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt, tình cờ phát hiện khối u phổi khi khám sức khỏe định kỳ Tỷ lệ này cao hơn so với nghiên cứu của Bùi Chí Viết tại TP Hồ Chí Minh năm
2010 cho thấy có 6,56% bệnh nhân tình cờ phát hiện u phổi khi khám định kỳ
[17] Do đó, cần chủ động khám sàng lọc cho những đối tƣợng có yếu tố nguy cơ cao giúp phát hiện bệnh ở những giai đoạn sớm, tiên lƣợng điều trị tốt hơn
Nhƣ vậy, các triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân UTPKPTBN đa dạng và phức tạp Khi bệnh đã ở giai đoạn muộn, các triệu chứng xuất hiện càng nhiều, biểu hiện di căn nhiều cơ quan, tiên lƣợng nặng
4.1.2 Đặc điểm cận lâm sàng
Dựa trên các kết quả chẩn đoán hình ảnh nhƣ chụp cắt lớp vi tính lồng ngực, PET/CT, nội soi phế quản tổn thương u phổi có kích thước trung bình 3,9cm, gặp ở một bên là chủ yếu chiếm 76,3%, các trường hợp khối u xuất hiện ở 2 phổi là biểu hiện của di căn phổi đối bên Khối u bên phải hay gặp hơn bên trái (55,6% so với 44,4%), phù hợp với các nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Anh (2017); Vũ Văn Thịnh (2014) và Nguyễn Thị Lựu (2013) [2, 12,
14] Điều này đƣợc giải thích do phế quản bên phải thẳng và ngắn hơn phế quản bên trái nên các tác nhân ung thư xâm nhập từ môi trường như khói bụi, thuốc lá, khí độc… theo đường hô hấp vào phổi phải dễ dàng hơn
Di căn hạch phát hiện được ở 87,6% trường hợp Di căn cơ quan khác hay gặp nhất là phổi cùng bên hoặc đối bên (chiếm 45,3% trường hợp), tiếp đó là di căn xương, màng phổi và não với tỷ lệ lần lượt là 31,6%; 30,5% và 26,6% Di căn phổi đối bên thường gặp nhất cũng là một nhận định trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Anh (2017) chiếm 47,1% trường hợp, tiếp đến là xương 38,7%; màng phổi 37,8% và não 24,4% [2] Nghiên cứu của Riihimaki và cộng sự khảo sát trên 21.169 bệnh nhân ung thƣ phổi cho thấy kết quả: tỷ lệ di căn cơ quan lần lượt là di căn não 39%, xương 34%, gan 20%, hệ hô hấp nhƣ phổi đối bên, màng phổi là 18% [34] Sự khác biệt này có thể do cỡ mẫu nghiên cứu và tiêu chuẩn lựa chọn đối tƣợng nghiên cứu khác
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU nhau Tuy nhiên, kết quả đều cho thấy khả năng di căn và xâm lấn của tế bào ung thư phổi rất đa dạng và khó lường
Bảng 3.2 cũng cho thấy loại mô bệnh học chủ yếu là ung thƣ biểu mô tuyến, chiếm 96,6 % Nghiên cứu của Mai Trọng Khoa và cộng sự (2016) cho kết quả tương tự, tỷ lệ ung thư biểu mô tuyến là 93,9% [10] Tuy nhiên, so với nhiều nghiên cứu khác tỷ lệ này thấp hơn: nghiên cứu của Lê Hoàn (2010) và Nguyễn Minh Hải (2010) thì tỷ lệ ung thƣ biểu mô tuyến lần lƣợt là 65,2% và 53,0% [6, 8] Nghiên cứu của Lê Tuấn Anh (2012) thấy tỷ lệ này là 55,4%
[3] Năm 2015, Phạm Văn Thái nghiên cứu trên 81 bệnh nhân UTPKPTBN cho thấy tỷ lệ ung thƣ phổi biểu mô tuyến là 76,6% [13] Sự khác biệt ở tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu, nhưng cũng có thể cho thấy xu hướng gia tăng tỷ lệ ung thƣ biểu mô tuyến ở Việt Nam trong những năm gần đây
Có 59 trong tổng số 177 bệnh nhân đƣợc chụp PET/CT, kết quả SUV max trung bình ở khối u nguyên phát tại phổi 10,6 ± 6,2, tại hạch là 9,1 ± 5,5 và tại các tổ chức di căn xa là 7,9 ± 4,9 Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Anh (2017) chỉ số SUV max tại u nguyên phát, tại hạch và tổ chức di căn lần lƣợt là 10,1 ± 5,4; 7,6 ± 5,3 và 7,3 ± 5,8 [2] Tuy nhiên, nghiên cứu của Mai Trọng Khoa và cộng sự ở 82 bệnh nhân ung thƣ phổi cho thấy kết quả thấp hơn, SUV max trung bình ở khối u nguyên phát là 7,91, các tổn thương di căn hạch dao động trung bình khoảng 5,83 – 5,96, tổn thương di căn xa như não 13,72; xương 9,21; gan 6,36…[10] Sự khác biệt này do nghiên cứu của chúng tôi chỉ tập trung vào bệnh nhân UTPKPTBN giai đoạn IV, khi bệnh ở giai đoạn muộn, bệnh tiến triển với kích thước u lớn hơn, độ thâm nhiễm và di căn xa nhiều hơn dẫn đến mức độ hấp thu FDG cao hơn so với giai đoạn sớm
Các chất chỉ điểm khối u là các chất đƣợc tổng hợp từ tế bào ung thƣ hoặc từ các tế bào tham gia vào quá trình đáp ứng của cơ thể với khối u
KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN EGFR
Kết quả xét nghiệm cho thấy có 71/177 (chiếm 40,1%) trường hợp phát hiện đột biến gen EGFR Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu trước đây: nghiên cứu của Hoàng Anh Vũ (2014), tỷ lệ là 40,7%; hay nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Anh (2017) tỷ lệ đột biến là 39,5% [2, 19] Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi lại thấp hơn một số nước trong khu vực Châu Á: nghiên cứu của Kosaka (2009), tỷ lệ đột biến gen EGFR trên bệnh nhân Nhật Bản là 49% [32]; nghiên cứu của Wu (2011), tỷ lệ đột biến gen EGFR trên bệnh nhân Đài Loan là 52,0% [50]; nghiên cứu PIONEER (2014) ở Việt Nam (64,2%), Trung Quốc (50,2%), Philippines (52,3%), Đài Loan (62,1%), Thái Lan (53,8%), Hồng Kong (47,2%) [43] Theo Nguyễn Minh Hà (2014), tỷ lệ đột biến gen EGFR ở UTPKPTBN là 58,6% [5] Sự khác biệt này là do tiêu chuẩn chọn lựa bệnh nhân trong các nghiên cứu trên và nghiên cứu của chúng tôi không đồng nhất Ngoài ra, phương pháp xét nghiệm đột biến gen khác nhau (giải trình tự gen, Real time PCR, PCR kết hợp lai đầu dò, …) cũng ảnh hưởng đến kết quả phân tích
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy các đột biến gen EGFR đóng vai trò bệnh sinh và đáp ứng hiệu quả của điều trị đích trong ung thƣ phổi biểu mô tuyến, trong đó đột biến xóa đoạn ở exon 19 và đột biến điểm (L858R) ở exon 21 là hai dạng thường gặp nhất (khoảng 85 – 90%), làm tăng hoạt tính tyrosin kinase của EGFR, tăng cường các tín hiệu nội bào liên quan tới tăng sinh, giảm quá trình chết theo chương trình của tế bào [17] Bên cạnh đó, các đột biến kháng thuốc TKI nhƣ đột biến điểm (T790M) và một số đột biến chèn đoạn ở exon 20 gặp với tỷ lệ nhỏ 1 – 2% [35, 50]
Kết quả của chúng tôi tại hình 3.4 cho thấy, trong 78 đột biến phát hiện đƣợc ở 71 bệnh nhân (7 bệnh nhân mang 2 đột biến), đột biến mất đoạn exon
19 chiếm đa số với 52,6% (E746_A750del, L747_A750delinsP,…), tiếp đến là các đột biến điểm trên exon 21 (L858R, L861Q) chiếm 34,6%; các đột biến ở exon 18 (G719X) và 20 (T790M) ít gặp hơn với tỷ lệ lần lƣợt là 5,1% và 7,7% Xét về tính đáp ứng với thuốc TKI, 92,3% đột biến trong nghiên cứu làm tăng tính nhạy cảm của khối u với TKI, chỉ có 6 trường hợp mang đột biến T790M trên exon 20 liên quan đến kháng thuốc TKI thế hệ 1, chiếm 7,7% Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với đa số các nghiên cứu trên thế giới cũng nhƣ tại Việt Nam với đột biến mất đoạn trên exon 19 và đột biến điểm (L858R) trên exon 21 là hai loại đột biến hay gặp nhất (Bảng)
Bảng 3.8 Phân bố đột biến gen EGFR theo một số nghiên cứu
Tác giả Tỷ lệ đột biến
Nghiên cứu của chúng tôi 40,1% 5,1% 52,6% 7,7% 34,6%
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 7/71 bệnh nhân có mang cùng lúc 2 đột biến của gen EGFR (chiếm tỷ lệ 9,9%) Trong đó 6 trường hợp mang đồng thời một loại đột biến gen nhạy cảm với TKI và một đột biến gen kháng TKI Kết quả này cao hơn trong nghiên cứu của Nguyễn Minh Hà (2014) và Nguyễn Thị Lan Anh (2017) có tỷ lệ đột biến kép (trong đó có mang đột biến kháng thuốc) lần lƣợt 2,0% và 1,85% [2, 5] Cùng với tỷ lệ đột biến exon 20 so sánh giữa các nghiên cứu trong Bảng 3.8 có thể nhận định xu hướng gia tăng của tỷ lệ đột biến kháng thuốc TKI
Nhƣ vậy, đột biến EGFR chiếm tỷ lệ không nhỏ ở bệnh nhân
UTPKPTBN giai đoạn IV Việc xét nghiệm đột biến bước đầu sàng lọc nhóm bệnh nhân có khả năng nhạy cảm hoặc kháng TKI là cần thiết để lựa chọn phương án điều trị tối ưu, tăng hiệu quả và giảm gánh nặng chi phí cho bệnh nhân.
