Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết Xác định khối lượng phân tử của một số thành phần trong nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus bằng phương pháp khối phổ phân giải cao trình bày các nội dung chính sau: Tách các phân đoạn của nọc rắn bằng phương pháp sắc ký trên cột Superdex HR75 Khối lượng phân tử của các phân đoạn tách ra dựa trên khối phổ phân giải cao;...
ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 9(118).2017 - Quyển 109 XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ THÀNH PHẦN TRONG NỌC RẮN CẠP NONG BUNGARUS FASCIATUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ PHÂN GIẢI CAO DETERMINATION OF MOLECULAR WEIGHT OF SOME COMPONENTS IN BUNGARUS FASCIATUS SNAKE VENOM BY HIGH RESOLUTION MASS SPECTROMETRY Trần Vũ Thiên1,2, Hoàng Ngọc Anh1, Nguyễn Văn Minh Khôi3, Lê Ngọc Hùng3, Phùng Văn Trung4, Lê Minh Hà5* Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng; 2Học viện Khoa học Công nghệ; Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao công nghệ; 4Viện Công nghệ Hóa học; Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; halm2vn@gmail.com Tóm tắt - Nọc rắn gồm kết hợp nhiều thành phần khác protein, peptide, enzyme độc tố Ở Việt Nam, nọc rắn B fasciatus chứa phospholipase A2 thành phần (71%), sau oxidase L-amino acids (8%), acetylcholinesterase (5%), metalloproteinase (4%) độc tố ba ngón tay (1%) Trong nghiên cứu này, từ nọc độc loài rắn B fasciatus, nhóm tác giả tiến hành phân tách thành phân đoạn phương pháp sắc ký cột Superdex HR 75 Khối lượng phân tử protein phân đoạn (3, 5) xác định phương pháp phổ khối lượng phân giải cao (HRMS) Kết cho thấy, khối lượng phân tử phân đoạn (BF3) chủ yếu vùng 13 kDa (13 007, 13 155, 13 241), phân đoạn (BF4) khoảng 6,8 - 7,4 kDa (6812, 6998, 7048, 7271, 7470) 13 kDa, phân đoạn (BF5) vùng 6,6 - 6,8 kDa (6668, 6796, 6859), 7,4 - 7,6 kDa (7445, 7655) 13 kDa Đây phân đoạn có chứa toxin quan trọng có hoạt tính chống đông máu nọc rắn cạp nong Abstract - Snake venoms are cocktails comprising combinations of different proteins, peptides, enzymes and toxins B fasciatus venom in Vietnam shows that phospholipase A2 is the main component (71%), followed by oxidase of L-amino acids (8%), acetylcholinesterase (5%), metalloproteinases (4%) and three finger toxins (1%) In this study, we separate the crude venom of Vietnam Bungarus fasciatus, into five fractions by column chromatography on Superdex HR 75 The molecular mass of three fractions (3, and 5) is identified by High Resolution Mass Spectrometry (HRMS) Molecular mass of fraction (BF3) is mainly in the region of 13 kDa (13 007, 13 155, 13 241), fraction (BF4) is in the region of 6.8 – 7.4 kDa (6812, 6998, 7048, 7271, 7470) and 13 kDa, while fraction (BF5) is in the region of 6.6 – 6.8 kDa (6668, 6796, 6859), 7.4 – 7.6 kDa (7445, 7655) and 13 kDa These fractions contain the important toxin that has anti-coagulant activity in the snake venoms Từ khóa - nọc rắn; Bungarus fasciatus; sắc ký; phổ khối phân giải cao; khối lượng phân tử Key words - snake venom; Bungarus fasciatus; protein; High Resolution Mass Spectrometry (HRMS); molecular mass Đặt vấn đề Rắn cạp nong có tên khoa học Bungarus fasciatus, loại rắn độc thuộc họ Elapidae Loài rắn thường phân bố vùng Đông Dương, bán đảo quần đảo Malaysia miền Nam, Trung Quốc [1] Tại Việt Nam, rắn cạp nong Bungarus fasciatus phổ biến khắp nơi, từ đồng bằng, trung du đến miền núi Nọc rắn cạp nong có độc tính hệ thần kinh hiệu lực cao nhiều lần so với nọc rắn hổ mang [2] Nọc chúng thường gây tình trạng suy hơ hấp nạn nhân dẫn đến tử vong Từ nọc rắn cạp nong, người ta phân lập neurotoxin khác có alfa-neurotoxin alfa-bungarotoxin, kbungarotoxin beta-bungarotoxin [3] Hai loại toxin đầu thuộc họ toxin ba ngón tay, cịn loại cuối thuộc họ heterodimer phospholipaza A2 Một số toxin tách có tính kháng viêm giảm đau [4] Ngồi người ta cịn tách loạt protein có hoạt tính enzyme khác Tiếp theo nghiên cứu nọc rắn cạp nong B fasciatus, báo nhóm tác giả trình bày việc khảo sát xác định khối lượng phân tử (KLPT) số phân đoạn protein tách từ nọc rắn cạp nong phân bố miền Nam (Đồng Tâm, Tiền Giang), dựa phương pháp khối phổ phân giải cao Thực nghiệm phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu Nọc rắn cạp nong (B fasciatus) thu từ trại rắn Đồng Tâm, Tiền Giang, Việt Nam Nọc rắn lấy cách để rắn cắn vào đĩa petri, dùng tay xoa bóp nhẹ vào hai tuyến nọc sau tai, nọc chảy vào đĩa Sau đó, nọc đem đơng khơ giữ -20°C tiến hành nghiên cứu 2.2 Phương pháp tách phân đoạn nọc rắn cạp nong sắc ký cột Superdex HR75 Nọc rắn cạp nong (B fasciatus) phân tách phương pháp lọc gel máy HPLC 1050, đầu dò UV nhiệt độ phòng với cột Superdex HR75 (1 x 50 cm) Cột cân trước đệm amonium axetat 0,1 M (pH 6,2) Lượng nọc chạy lần 30 mg, tốc độ rửa cột 0,5 ml/phút Sự có mặt protein phân đoạn xác định mật độ quang bước sóng 280 nm 2.3 Khảo sát khối lượng phân tử phân đoạn nọc rắn cạp nong phương pháp khối phổ phân giải cao Các protein nhận diện phương pháp khối phổ phân giải cao với mảnh ion khối phổ đo cao m/z 3.000 hệ thống Q Exactive Focus Orbitrap MS (Thermo Scientific), sử dụng nguồn ion hóa H-ESI (heated Trần Vũ Thiên,, Hồng Ngọc Anh, Nguyễn Văn Minh Khôi, Lê Ngọc Hùng, Phùng Văn Trung, Lê Minh Hà 110 electrospray ionization), phương pháp quét FS-ddMS2 (Full Scan + Data-dependent MS/MS), độ phân giải FS: 70.000 FWHM, dãy quét m/z 650 tới 3.000 Kết hợp xử lý số liệu với phần mềm MestReNova 11.0 Kết nghiên cứu bình luận 3.1 Tách phân đoạn nọc rắn phương pháp sắc ký cột Superdex HR75 Nọc rắn toàn phần tiến hành phân tách sắc ký lọc gel cột Superdex HR75 Kết cho thấy, nọc toàn phần tách làm phân đoạn rõ ràng riêng biệt từ BF1 (peak 1) đến BF5 (peak 5) (Hình 1) Các phân đoạn thu lại, đông khô dùng để khảo sát tác động giảm đau, kháng viêm chúng lên chuột Kết phân tách cho thấy việc lựa chọn cột điều kiện phân tích nhóm tác giả hồn tồn phù hợp DAD1 D, Sig=280,20 Ref=550,100 (THIEN\BF000022.D) mAU 1000 800 13026,4622 13007,5069 10318,7966 10082,0160 9080,2425 8320,2454 7945,6841 7655,6557 7642,0074 7470,8554 7445,2107 7271,3482 7271,0146 7253,9354 7249,8503 7048,5882 7032,9683 7025,0892 6998,6610 6965,3176 6859,4760 6814,1336 600 6812,4484 6796,6756 6767,9150 6748,7103 6668,0479 400 200 20 40 60 80 100 Hình Sắc ký nọc rắn cạp nong Tiền Giang cột lọc gel Superdex HR75 (BF1 đến BF5) 3.2 Khối lượng phân tử phân đoạn tách dựa khối phổ phân giải cao Sau xử lý liệu phổ đồ với phần mềm MestReNova, kết cho thấy, khối lượng phân tử protein tập trung chủ yếu phân đoạn BF3, BF4, BF5 Kết trình bày Bảng Hình 2, 3, 4, đây: Full Scan (BF3): (m/z 2603 - 2621) Bảng Khối lượng phân tử phân đoạn BF3, BF4, BF5 BF3 13241,3334 MW (Da) BF4 BF5 Hình Khối phổ (Orbitrap MS) phân đoạn BF3 13218,3273 13155,8075 13153,9353 13150,5956 13109,5553 13103,3581 13100,7398 13100,8075 13079,7553 13078,1768 13075,1530 13068,7749 13045,7376 13034,6175 13032,8996 Hình Khối phổ phân giải cao phân đoạn BF3 ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 9(118).2017 - Quyển 111 AAPYNLANFG IDKEKHCQ (BF-IV-8) KNRPTFCNLL PETGRCNALI PAFYYNSHLH KCQKFNYGGC GGNANNFKTI DECQRTCAAK YGRSS (BF-V-4) [6] Những kết thu giúp nhóm tác giả định hướng việc tách toxin có hoạt tính giảm đau từ nọc B fasciatus Hình Khối phổ (Orbitrap MS) phân đoạn BF4 Kết luận Nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus tách làm phân đoạn phương pháp sắc ký cột với Superdex HR 75 Nhóm tác giả áp dụng thành công phương pháp khối phổ phân giải cao (với mảnh ion khối phổ đo cao m/z 3.000 thường cung cấp nước ta để nghiên cứu hợp chất có phân tử lượng thấp) để xác định khối lượng phân tử protein nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus Kết cho thấy, khối lượng phân tử protein phân đoạn chủ yếu nằm khoảng 13kDa Các protein phân đoạn nằm chủ yếu khoảng 7kDa 13kDa Các protein phân đoạn nằm chủ yếu khoảng 6,6 kDa, kDa 13 kDa Đây phân đoạn có chứa toxin quan trọng có hoạt tính chống đơng máu nọc rắn cạp nong Kết giúp định hướng cho việc phân tách có hiệu toxin từ loài rắn cạp nong B fasciatus Việt Nam Lời cảm ơn: Cảm ơn Dự án Đầu tư xây dựng phịng thí nghiệm chun ngành Hóa dược tài trợ kinh phí để thực báo Hình Khối phổ (Orbitrap MS) phân đoạn BF5 Kết phân tích theo Bảng cho thấy: Phân đoạn (BF3) chứa chủ yếu protein có khối lượng phân tử nằm vùng 13 kDa Các protein có khối lượng phân tử tương đương với khối lượng phân tử phospholipase A2 (PLA2) 13-14 kDa Phân đoạn (BF4) (BF5) ngồi phospholipase A2 cịn chứa neurotoxin nọc rắn (cấu trúc dạng ba ngón tay) (khoảng từ 6,6 kDa đến 10,0 kDa) So sánh kết nhóm tác giả với kết nghiên cứu nọc B fasciatus tác giả khác công bố, đến Việt Nam có nhóm tác giả Hoàng Ngọc Anh, từ B fasciatus tách 17 neurotoxin có khối lượng phân tử nằm khoảng – kDa [5] Các neurotoxin tương tác mạnh với thụ thể nicotinic acetylcholine loại số cịn tương tác với thụ thể nicotinic acetylcholine loại alfa7 Ngoài ra, từ nọc rắn cạp nong người ta tách xác định trình tự acid amin toxin là: BF-IV-8 có KLPT 13,127 Da, BF-V-4 có KLPT 6,957 Da, toxin có hoạt tính chống đơng máu, cụ thể, phương pháp MALDI-TOF-MS BFIV-8 BF-V-4 chứa 118 65 acid amin, trình tự acid amin NLYQFKNMIE CAGTRTWLAY VKYGCYCGPG DNAKKFGNCI KGSCGRNVCD GTGTPLDELD PYLKTYVYTC RCCQTHDHCY NKPDITCTGA CDRAAAICFA TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Smith Malcolm A, The fauna of British India, Ceylon and Burma including the whole of the Indo-Chinese Sub-region”, Reptiles and Amphibian, Vol III-Serpents, Taylor and Francis, London, 1943, pp 411-413 [2] Wei J.F., Yang H.W., Wei X.L., Qiao L.Y., Wang W.Y., He S.H “Purification, characterization and biological activities of the Lamino acid oxidase from Bungarus fasciatus snake venom”, Toxicon, 54, 2009, pp 262-271 [3] Rusmili M.R., Yee T.T, Mustafa M.R., Hodgson W.C., Othman I, “Proteomic characterizetion and comparison of Malaysian Bungarus candidus and Bungarus fasciatus venom”, J Proteomics, Vol 110C, 2014, pp 129-144 [4] Wang Y., Zhang Z., Chen L., Guang H., Li Z., Yang H., Li J., You D., Yu H., Lai R., “Cathelicidin–BF, a snake cathelicidin-derived antimicrobial peptide, could be an excellent therepeuctic agent for acne vulgaris”, J.Pone, Vol 6, 2011, pp e22120 [5] Hồng Ngọc Anh, Phạm Ngun Đơng Yên, Lưu Huỳnh Ngọc Dũng, Pavel Zemsky, Yuri Utkin, “Nghiên cứu thành phần toxin nọc rắn cạp nong Việt Nam (Bungarus fasciatus)”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 51 (1B), 2013, trang 345-352 [6] Yu N Utkin, E A Gantsova, T V Andreeva, V G.Starkov, R H Ziganshin, Hoang Ngoc Anh, Nguyen Thi Thanh Thao, Nguyen Cuu Khoa, and Corresponding Member of the RAS V.I.Tsetlin, “Venoms of Kraits Bungarus multicinctus and Bungarus fasciatus Contain Anticoagulant Proteins”, Doklady Biochemistry and Biophysics, Vol 460, 2015, pp 53-58 (BBT nhận bài: 25/7/2017, hoàn tất thủ tục phản biện: 23/8/2017) ... dụng thành công phương pháp khối phổ phân giải cao (với mảnh ion khối phổ đo cao m/z 3.000 thường cung cấp nước ta để nghiên cứu hợp chất có phân tử lượng thấp) để xác định khối lượng phân tử protein... 100 Hình Sắc ký nọc rắn cạp nong Tiền Giang cột lọc gel Superdex HR75 (BF1 đến BF5) 3.2 Khối lượng phân tử phân đoạn tách dựa khối phổ phân giải cao Sau xử lý liệu phổ đồ với phần mềm MestReNova,... tác giả định hướng việc tách toxin có hoạt tính giảm đau từ nọc B fasciatus Hình Khối phổ (Orbitrap MS) phân đoạn BF4 Kết luận Nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus tách làm phân đoạn phương pháp