Bài viết trình bày những nghiên cứu về protein có khả năng kháng tế bào ung thư tách từ phân đoạn 3 nọc rắn cạp nong Vĩnh Sơn (Vĩnh Phúc) nhằm tìm kiếm những ứng dụng mới của nó trong y dược.
TẠP CHÍ HĨA HỌC 57(2e1,2) 95-99 THÁNG NĂM 2019 Tách protein có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus phân bố Vĩnh Phúc Trần Vũ Thiên1,2, Phạm Đình Chương3, Phùng Văn Trung4, Nguyễn Cửu Khoa1,5, Utkin Yuri Nicolaevich6, Hoàng Ngọc Anh1,5* Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (VAST), Việt Nam Trường Đại học Trà Vinh, Việt Nam Đại học Tôn Đức Thắng, Việt Nam Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (VAST) Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, VAST, Việt Nam Viện Sinh hóa hữu Shemyakin-Ovchinnikov, Viện Hàn lâm Khoa học Nga Đến Tòa soạn 31-01-2019; Chấp nhận đăng 15-3-2019 Abstract The crude venom of Bungarus fasciatus was separated into five fractions by column chromatography on Superdex HR 75 column Physiological characterization showed that at the dose 10 µg/mL after 24 h, 48 h and 72 h, crude venom and, fraction have cytotoxicity effect (MCF7 and A549 cell lines) The fraction was then separated into sub-fractions (3.1; 3.2; 3.3; 3.4) by RP-HPLC on C18 column The cytotoxicity of crude venom, fraction 3, and sub-fractions (3.1; 3.2; 3.3; 3.4) were tested using two cell lines: breast cancer (MCF7) and lung cancer (A549) cell lines The results indicated that crude venom, fraction 3, and subfractions 3.3 have cytotoxicity at dose 10 µg/mL, especially cytotoxicity effect of them clearly at dose 50 µg/mL and 100 µg/mL Further study showed that the protein (PLA2) isolated from subfractions 3.3.1 possessed a molecular mass 13090 Da Keywords Snake venom, Bungarus fasciatus, Chromatography, Cytotoxicity effect, Mass-spectrometry MỞ ĐẦU Từ nghiên cứu cho thấy tiềm chống ung thư nọc rắn cạp nong B fasciatus lớn Điều có ý nghĩa việc điều trị ung thư hợp chất tự nhiên Những hợp chất có hiệu cao phương pháp xạ trị đem lại hy vọng cho bệnh nhân ung thư Tiếp theo nghiên cứu nọc rắn cạp nong B fasciatus Việt Nam, báo chúng tơi trình bày nghiên cứu protein có khả kháng tế bào ung thư tách từ phân đoạn nọc rắn cạp nong Vĩnh Sơn (Vĩnh Phúc) nhằm tìm kiếm ứng dụng y dược.[5] Hiện nay, xu nghiên cứu độc tố từ loài động vật, nọc rắn để điều trị ung thư phát triển Trên giới có nhiều nghiên cứu khả kháng ung thư nọc rắn Bungarus fasciatus như: Một loại L-amino acid từ nọc rắn cạp nong tỉnh Quảng Tây - Trung Quốc có tên gọi BFLAAO, chúng gây độc tế bào ung thư phổi người (A549) mơ hình in vitro [1] BF-CT1, protein phân lập nọc rắn cạp nong, chúng gây độc tế bào (cytotoxicity) mơ hình thí nghiệm in vitro in vivo Ở mơ hình thử nghiệm in vivo tế bào ung thư cổ tử cung chuột (EAC), BF-CT1 làm giảm tế bào ung thư đáng kể thơng qua q trình đào thải tế bào chết apoptosis so với nhóm chứng khơng điều trị [2] Cathelicidin-BF (BF-30) loại peptide kháng khuẩn phân lập từ nọc rắn cạp nong B fasciatus, có khả kháng tế bào ung thư, chống lại di hình thành mạch máu ni dưỡng khối u ác tính.[3,4] NGUN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Nọc rắn Nọc rắn cạp nong thu mua từ Vĩnh Sơn (Vĩnh 95 Hoàng Ngọc Anh cộng TCHH, 57(2e1,2), 2019 Phúc) bài.[5] Nọc đông khô bảo quản -20 oC tiến hành nghiên cứu Mẫu thử nghiệm phân đoạn nọc thô từ rắn cạp nong Vĩnh Sơn Sau sắc kí đơng khơ chứa tube 1,5 mL Pha nọc rắn với mL PBS 1X tủ cấy vô trùng, lắc lọc qua màng lọc Nọc rắn trước sau hòa tan bảo quản tủ lạnh oC Khi thí nghiệm, pha mẫu với eDMEM bổ sung 2% FBS + 1% PS thử nghiệm giếng cấy sẵn tế bào Ủ đĩa tủ nuôi cấy, thực khảo nghiệm MTT (3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide sau 24 h, 48 h 72 h 2.1.2 Tế bào ung thư Tế bào ung thư sử dụng dòng tế bào ung thư vú (MCF7) tế bào ung thư phổi (A549) mua từ ngân hàng tế bào Mỹ (American Type Culture Collection) vận chuyển bảo quản với nhiệt độ -96 oC nitrogen lỏng phịng thí nghiệm trường Đại học Quốc tế - Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Bảng 1: Tên phân đoạn nồng độ cần thử nghiệm 2.2 Phương pháp tách khảo sát tác động kháng tế bào ung thư phân đoạn thứ cấp từ phân đoạn Tên phân đoạn 2.2.1 Phương pháp tách phân đoạn thứ cấp từ phân đoạn BF1_VS - BF5_VS Nọc thô BF_VS Để thu phân đoạn thứ cấp từ phân đoạn 3, tiến hành sắc ký lỏng cao áp pha đảo phân đoạn cột phân tích Jupiter C18 (4,6 x 250 mm) Cột rửa gradient tuyến tính dung dịch sau: A 0,1 % TFA nước B 0,1 %TFA acetonitril Tốc độ rửa cột ml/phút Thời gian rửa cột từ 15 % đến 45 % B 60 phút, kết thu phân đoạn Sự có mặt polypeptid protein phân đoạn sắc ký xác định theo mật độ quang bước sóng 254 nm Các phân đoạn thứ cấp thu đem đông khô dùng để khảo sát tác dụng kháng tế bào ung thư chúng BF_3.1_VS - BF_3.4_VS Nồng độ cần thử nghiệm µg/mL 10 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL µg/mL 10 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL 2.2.4 Phương pháp khảo nghiệm MTT Thực thao tác vô trùng Cho đĩa 96 giếng vào tủ cấy vô trùng, cho 10 µL thuốc thử MTT (nồng độ ban đầu mg/mL) vào giếng theo thứ tự từ trái sang phải ủ tủ nuôi tế bào h Sau h, tiến hành hút tồn mơi trường giếng micropipette Hút 100 µL DMSO vào giếng, trộn để hòa tan tinh thể formazan mẫu đọc kết bước sóng 595 nm Thực lặp lại khảo nghiệm lần cho loại tế bào 2.2.2 Quy trình cấy tế bào vào đĩa 96 giếng Thực thao tác vơ trùng Cho bình ni tế bào vào tủ cấy vơ trùng, hút bỏ tồn mơi trường cũ Sau đó, rửa bề mặt ni cấy mL PBS 1X cắt tế bào khỏi bề mặt nuôi cấy 1,5 mL TE 1X từ 3-5 phút tủ ấm Khi tế bào hoàn tồn khỏi bề mặt ni cấy, trung hịa TE cách hút mL eDMEM bổ sung 10 % FBS + 1% PS vào bình, tráng Hút tồn vào falcon 15 mL, ghi nhãn dán parafilm thực ly tâm 1300 vòng/phút phút Kết thúc ly tâm, lau cồn 70 % trước đem falcon vào tủ hút, đổ dịch nổi, vuốt nhẹ để phần tế bào đáy bong Tái huyền phù với mL eDMEM bổ sung 10% FBS + 1% PS Tiến hành đếm tính số lượng tế bào cần thí nghiệm buồng đếm hồng cầu Sau đó, pha lỗng mật độ cấy tế bào vào đĩa 96 giếng với 7000 tế bào/100 µL/giếng 2.3 Phương pháp xác định khối lượng phân tử protein phân đoạn thứ cấp Khối lượng phân tử protein tách xác định máy khối phổ MALDI-TOF MS (Bruker Daltonik, Đức) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Làm phân đoạn thứ cấp từ phân đoạn Từ phân đoạn tiến hành sắc ký lỏng cao áp pha đảo cột phân tích Jupiter C18 (4.6 x 250 mm) Kết phân đoạn tách phân đoạn thứ cấp có hàm lượng khảo sát (hình 1A) 2.2.3 Quy trình pha thử mẫu 96 Tách protein có hoạt tính kháng… TCHH, 57(2e1,2), 2019 Các phân đoạn thu lại, đông khô khảo sát hoạt tính khảo sát nồng độ 100 µg/mL, phần trăm tế bào sống phân đoạn BF3_VS nọc thơ BF_VS giảm đáng kể cịn 19,85 % 18,17 % tương ứng Ở nồng độ µg/mL, phần trăm tế bào sống tương đương so với mẫu chứng (mẫu có tế bào ung thư MCF7) (100 %) Sau 72 giờ, phân đoạn cịn lại khơng nhận thấy khả kháng ung thư tế bào ung thư vú MCF7 Như vậy, tăng sinh tế bào ung thư MCF7 bị ức chế hoạt tính mẫu khả kháng ung thư phân đoạn BF3_VS, nọc thô BF_VS từ rắn cạp nong Vĩnh Sơn phụ thuộc vào nồng độ khảo sát Ngoài ra, khả chống lại tế bào ung thư làm giảm khả di nọc rắn cạp nong thành phần trực tiếp gây độc tế bào phospholipase A2 (PLA2), phân đoạn có khả chống lại tăng sinh (anti proliferation) tế bào ung thư (A) 3.3.1 (B) 3.3.2 3.2.2 Kết khảo sát khả kháng ung thư vú phân đoạn thứ cấp tách từ phân đoạn (BF3_VS) nọc rắn cạp nong Hình 1: Sắc ký lỏng cao áp pha đảo để thu phân đoạn thứ cấp từ phân đoạn (A) toxin 3.3.1 từ phân đoạn thứ cấp 3.3 (B) Khảo sát hoạt tính kháng ung thư phân đoạn thứ cấp (BF_3.1_VS – BF_3.4_VS) tách từ phân đoạn (BF3_VS) nọc rắn cạp nong Vĩnh Sơn lên tế bào ung thư vú MCF7 sau 72 Kết thí nghiệm cho thấy, phân đoạn BF_3.3_VS có khả kháng ung thư tế bào ung thư vú MCF7 (hình 3) Cụ thể, phần trăm tế bào ung thư vú MCF7 sống sau thử nghiệm với BF_3.3_VS 82 % nồng độ 10 µg/mL, 73% (50 µg/mL), 56,7 % (100 µg/mL) Ở nồng độ µg/mL, phần trăm tế bào sống tương đương với mẫu chứng (mẫu có tế bào ung thư MCF7) (100 %) Ở mốc thời gian 72 h, phân đoạn cịn lại khơng nhận thấy khả kháng ung thư tế bào ung thư vú MCF7 Như vậy, tăng sinh tế bào ung thư vú MCF7 bị ức chế hoạt tính mẫu hiệu phân đoạn BF_3.3_VS tác dụng lên tế bào ung thư vú MCF7 tăng theo nồng độ, thể rõ nét mốc nồng độ 50 µg/mL, 100 µg/mL 3.2 Kết khảo sát khả kháng ung thư lên tế bào ung thư vú MCF7 3.2.1 Kết khảo sát khả kháng ung thư vú nọc thô phân đoạn nọc rắn cạp nong Lượng tế bào sống (%) Chứng Nồng độ (µg/mL) *р < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 (p: sai số thống kê) Chứng Lượng tế bào sống (%) Hình 2: Kết khảo sát khả kháng ung thư nọc thô phân đoạn lên tế bào ung thư vú MCF7 sau 72 h Khảo sát hoạt tính kháng ung thư nọc thơ phân đoạn từ nọc rắn cạp nong Vĩnh Sơn lên tế bào ung thư vú MCF7 sau 72 h Kết thí nghiệm cho thấy, khả kháng ung thư nọc thô phân đoạn từ nọc rắn cạp nong Vĩnh Sơn phụ thuộc vào nồng độ (hình 2) Cụ thể, nồng độ 10 µg/mL phần trăm tế bào sống thử nghiệm với phân đoạn BF3_VS nọc thô BF_VS mức cao 82,9 % 81,23 % Ở nồng độ 50 µg/mL, phần trăm tế bào sống giảm đạt 52,18 % 61,2 % Khi Nồng độ (µg/mL) *р < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 Hình 3: Kết khảo sát khả kháng ung thư phân đoạn thứ cấp tách từ phân đoạn (BF3_VS) lên tế bào ung thư vú MCF7 sau 72 h 97 Hoàng Ngọc Anh cộng TCHH, 57(2e1,2), 2019 µg/mL), 57 % (100 µg/mL) Ở nồng độ µg/mL, phần trăm tế bào sống tương đương với mẫu chứng (mẫu có tế bào ung thư A549) (100%) Ở mốc thời gian sau 72 h, phân đoạn cịn lại khơng nhận thấy khả kháng ung thư tế bào ung thư phổi A549 Như vậy, hiệu kháng ung thư phân đoạn BF_3.3_VS tế bào ung thư phổi A549 tăng theo nồng độ, thể rõ nét mốc nồng độ 50 µg/mL, 100 µg/mL 3.3 Kết khảo sát khả kháng ung thư lên tế bào ung thư phổi A549 3.3.1 Kết khảo sát khả kháng ung thư phổi nọc thô phân đoạn nọc rắn cạp nong Khảo sát hoạt tính kháng ung thư nọc thô phân đoạn từ nọc rắn cạp nong Vĩnh Sơn lên tế bào ung thư phổi A549 sau 72 h (hình 4) Kết thí nghiệm cho thấy, khả kháng ung thư phân đoạn BF3_VS nọc thô BF_VS phụ thuộc vào nồng độ khảo sát Cụ thể, nồng độ 10 µg/mL phần trăm tế bào sống thử nghiệm với phân đoạn BF3_VS nọc thô BF_VS mức cao 71 % 78,12 % Ở nồng độ 50 µg/mL, phần trăm tế bào sống giảm đạt 49,18 % 51,6 % Khi khảo sát nồng độ 100 µg/mL, phần trăm tế bào sống giảm đáng kể 16 % 18 % Ở nồng độ µg/mL, phần trăm tế bào sống tương đương so với mẫu chứng (mẫu có tế bào ung thư A549) (100 %) Ở mốc thời gian sau 72 h, phân đoạn cịn lại khơng nhận thấy khả kháng ung thư tế bào ung thư phổi A549 Như vậy, tăng sinh tế bào ung thư phổi A549 bị ức chế hoạt tính mẫu khả kháng ung thư phân đoạn BF3_VS nọc thô BF_VS phụ thuộc vào nồng độ khảo sát Lượng tế bào sống (%) Chứng Nồng độ (µg/mL) *р < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 Hình 5: Kết khảo sát khả kháng ung thư phân đoạn thứ cấp tách từ phân đoạn (BF3_VS) lên tế bào ung thư phổi A549 sau 72 h 3.4 Xác định khối lượng phân tử protein tách Phân đoạn 3.3 làm lại phương pháp sắc ký lỏng cao áp pha đảo thu protein 3.3.1 (hình 1B) Bằng phương pháp khối phổ MALDI-TOF MS xác định khối lượng phân tử protein 3.3.1 13090 Da, phospholipase A2 So với protein khác tách từ nọc rắn cạp nong B fasciatus khối lượng phân tử (KLPT) toxin 3.3.1 khác so với BF-LAAO (70 kDa), BF-CT1 (13 kDa), BF-30 (3637 Da) So sánh với ngân hàng liệu protein chưa có protein có KLPT 3.3.1, hy vọng protein 3.3.1 protein Cấu trúc bậc toxin 3.3.1 xác định nghiên cứu Lượng tế bào sống (%) Chứng Nồng độ (µg/mL) *р < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 Hình 4: Kết khảo sát khả kháng ung thư nọc thô phân đoạn lên tế bào ung thư phổi A549 sau 72 h 3.3.2 Kết khảo sát khả kháng ung thư phổi phân đoạn thứ cấp tách từ phân đoạn (BF3_VS) nọc rắn cạp nong KẾT LUẬN Từ phân đoạn (thu sắc ký lọc gel nọc cạp nong Bungarus fasciatus), phương pháp sắc ký lỏng cao áp pha đảo tách phân đoạn thứ cấp (3.1; 3.2; 3.3; 3.4) Khảo sát hoạt tính kháng tế bào ung thư cho thấy: nọc thô, phân đoạn phân đoạn thứ cấp 3.3 có hoạt tính kháng tế bào ung thư vú (MCF7) ung thư phổi (A549) nồng độ 10 µg/mL sau 72 giờ, thể rõ rệt nồng độ 50 µg/mL 100 µg/mL Như vậy, hiệu kháng ung thư nọc thô, phân đoạn phân Khảo sát hoạt tính kháng ung thư phân đoạn thứ cấp (BF_3.1_VS – BF_3.4_VS) tách từ phân đoạn (BF3_VS) nọc rắn cạp nong Vĩnh Sơn lên tế bào ung thư phổi A549 sau 72 h (hình 5) Kết thí nghiệm cho thấy, phân đoạn BF_3.3_VS có khả kháng ung thư tế bào ung thư phổi A549 Cụ thể, phần trăm tế bào ung thư phổi A549 sống sau thử nghiệm với phân đoạn BF_3.3_VS 89 % nồng độ 10 µg/mL, 71,2 % (50 98 Tách protein có hoạt tính kháng… TCHH, 57(2e1,2), 2019 acts through apoptosis, modulation of PI3K/AKT, MAPKinase pathway and cell cycle regulation, Toxicon, 2013, 74, 138-150 đoạn thứ cấp 3.3 tăng tăng nồng độ Từ phân đoạn thứ cấp 3.3 thu đươc protein 3.3.1 sạch, khối lượng phân tử protein xác định 13090 Da, phospholipase A2 Lời cảm ơn Nghiên cứu hỗ trợ Quỹ Nghiên cứu Cơ Nga (đề tài mã số 18-54-54006) Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam (đề tài mã số QTRU01.03/18-19) Wang Y., Zhang Z., Chen L., Guang H., Li Z Cathelicidin-BF, a Snake Cathelicidin-Derived Antimicrobial Peptide, Could Be an Excellent Therapeutic Agent for Acne Vulgaris, PLOS ONE, 2011, 6(7), e22120 Yipeng Wang, Jing Hong, Xiuhong Liu, Snake Cathelicidin from Bungarus fasciatus Is a Potent Peptide Antibiotics, PLOS ONE, 2008, 3(9), e3217 Tran Vu Thien, Le Thi Thuy Lien, Nguyen Thi Thuy Trang, Vo Phung Nguyen, Nguyen Duc Tuan, Nguyen Cuu Khoa, Utkin Yuri, Hoang Ngoc Anh, Antinociceptive and anti-inflammatory effects of isolated fractions from venom Bungarus fasciatus distributed in Vinh Phuc, Y Hoc TP Ho Chi Minh, 2017, 21(1), 523-530 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ji-Fu Wei, Hai-Wei Yang, Purification, characterization and biological activities of the Lamino acid oxidase from Bungarus fasciatus snake venom, Toxicon, 2009, 54, 262-271 Bhattacharya, T Das, A Biswas, A cytotoxic protein (BF-CT1) purified from Bungarus fasciatus venom Liên hệ: Hoàng Ngọc Anh Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TL29, Phường Thạnh Lộc, quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh E-mail: hnanh52@yahoo.com Điện thoại: +84- 945875569 99 ... 3.3.1 Kết khảo sát khả kháng ung thư phổi nọc thô phân đoạn nọc rắn cạp nong Khảo sát hoạt tính kháng ung thư nọc thơ phân đoạn từ nọc rắn cạp nong Vĩnh Sơn lên tế bào ung thư phổi A549 sau 72... Lượng tế bào sống (%) Hình 2: Kết khảo sát khả kháng ung thư nọc thô phân đoạn lên tế bào ung thư vú MCF7 sau 72 h Khảo sát hoạt tính kháng ung thư nọc thô phân đoạn từ nọc rắn cạp nong Vĩnh Sơn... hiệu kháng ung thư nọc thô, phân đoạn phân Khảo sát hoạt tính kháng ung thư phân đoạn thứ cấp (BF_3.1_VS – BF_3.4_VS) tách từ phân đoạn (BF3_VS) nọc rắn cạp nong Vĩnh Sơn lên tế bào ung thư phổi