Phương pháp điện di đề xác định khôi lượng phân tử các phân đoạn nọc bò cạp

GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh LỜI CẢM ƠN Qua thời gian làm luận văn phịng Hương Liệu Và Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học thuộc viện Khoa Học Vật Liệu Ứng Dụng, em học hỏi kiến thức kĩ nghiên cứu khoa học vận dụng kiến thức học nhà trường vào thực tế để làm giàu thêm vốn kiến thức Tuy thời gian làm luận văn không nhiều với hướng dẫn giúp đỡ tận tình thầy hướng dẫn anh chị phòng giúp em hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TSKH Hồng Ngọc Anh, thầy Ths Võ Đỗ Minh Hồng tận tình hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành luận văn này, chị Phạm Nguyễn Đông Yên, cô Đỗ Thị Tuyến giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian làm luận văn viện Khoa Học Vật Liệu Ứng Dụng viện Sinh Học Nhiệt Đới Em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Khoa Học ứng Dụng trường đại học Tôn Đức Thắng tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian học tập trường Sinh viên thực Nguyễn Văn Hùng SVTH: Nguyễn Văn Hùng GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hồng Ngọc Anh MỤC LỤC Lời nói đầu Chương I: TỔNG QUAN I.1 Tổng quan lồi bị cạp I.1.1 Giới thiệu chung lồi bị cạp I.1.2 Đặc điểm giải phẫu học bò cạp I.1.3 Nọc độc bò cạp I.1.4 Sinh sản phát triển bò cạp I.1.5 Đời sống loài bò cạp I.1.6 Một số lồi bị cạp nước ta I.1.7 Giới thiệu lồi bị cạp Heterometrus laoticus 10 I.2 Cơ sở lí thuyết phương pháp phân tích 11 I.2.1 Nguyên tắc phương pháp định lượng protein hòa tan 11 I.2.2 Phương pháp sắc kí lọc gel 12 I.2.3 Phương pháp điện di để xác định khối lượng phân tử phân đoạn nọc bò cạp 19 I.2.4 Phương pháp sắc kí lỏng cao áp 23 Chương II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 II.1 Quá trình thu bảo quản nọc bò cạp Heterometrus laoticus 28 II.1.1 Thiết bị thu nọc bò cạp 28 II.1.2 Phương pháp thu bảo quản nọc bò cạp 28 II.2 Định lượng protein nọc bò cạp theo phương pháp Biure 29 II.2.1 Hóa chất sử dụng phương pháp Biure 29 II.2.2 Xây dựng đường chuẩn 29 II.2.3 Chuẩn bị mẫu 30 II.3 Sắc kí lọc gel gel sephadex G-50 nọc bị cạp 30 II.3.1 Hóa chất, dung mơi sử dụng sắc kí lọc gel 30 II.3.2 Quá trình chuẩn bị đệm 31 SVTH: Nguyễn Văn Hùng GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hồng; TSKH Hồng Ngọc Anh II.3.3 Q trình chuẩn bị gel sephadex G-50 31 II.3.4 Q trình chuẩn bị mẫu chạy sắc kí 31 II.3.5 Quá trình chuẩn bị cột nhồi cột 31 II.3.6 Tiến hành chạy sắc kí 32 II.3.7 Thu mẫu đông khô mẫu 32 II.4 Khảo sát độc tính phân đoạn nọc bị cạp lên chuột 33 II.5 Điện di SDS – page 33 II.5.1 Hóa chất sử dụng điện di 33 II.5.2 Quy trình chuẩn bị gel 34 II.5.3 Chuẩn bị mẫu chạy điện di 35 II.5.4 Nhuộm giải nhuộm gel 35 II.6 Sắc kí lỏng cao áp cột C18 35 II.7 Khảo sát độc tính toxin sau chạy sắc kí lỏng cao áp 36 Chương III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37 III.1 Kết định lượng protein nọc bò cạp theo phương pháp Biure 37 III.2 Kết chạy sắc kí lọc gel gel sephadex G-50 nọc bò cạp 38 III.3 Kết khảo sát độc tính phân đoạn sau chạy sắc kí lọc gel 40 III.4 Kết điện di phân đoạn sau sắc kí lọc gel 43 III.5 Kết chạy sắc kí lỏng cao áp cột C18 phân đoạn 44 III.6 Kết khảo sát độc tính pic sau chạy sắc kí lỏng cao áp 49 Chương IV: KẾT LUẬN 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 SVTH: Nguyễn Văn Hùng GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hồng Ngọc Anh LỜI NĨI ĐẦU Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam có nguồn dược liệu phong phú đa dạng không loài thực vật mà động vật có lồi động vật có nọc độc rắn, ong, bò cạp… Khoảng 30 năm trở lại đây, nọc bò cạp hấp dẫn nghiên cứu nhà khoa học chứa polypeptide toxin tác dụng với receptor kênh ion màng tế bào bị kích thích Nọc bị cạp ứng dụng để chế nhiều loại thuốc chữa bệnh hiểm nghèo ung thư, parkingson, bệnh huyết áp cao, alzheimer, điều trị bệnh tự miễn dịch chống loại bỏ trình ghép quan Bò cạp phân bố nhiều vùng Nam Đơng Nam Á Với điều kiện tự nhiên khí hậu vơ thuận lợi, bị cạp Việt Nam phát triển mạnh mẽ với nhiều loài Lychas mucronatus fabricius, Isometrus sp, Heterometrus sp, Heterometrus laoticus… Trước y học cổ truyền nước ta sử dụng bò cạp phối hợp với vị khác thuốc Nam để chữa bệnh thần kinh, kinh phong, uốn ván… Tuy nhiên việc sử dụng bò cạp làm thuốc dựa kinh nghiệm dân gian, nghiên cứu nọc độc bò cạp Việt Nam bắt đầu thời gian gần Để đóng góp vào q trình nghiên cứu ứng dụng nọc bò cạp Việt Nam y dược Trong luận văn xin trình bày khảo sát chất có hoạt tính sinh học nọc bò cạp đen (Heterometrus laoticus) để phục vụ cho nghiên cứu sâu ứng dụng y dược SVTH: Nguyễn Văn Hùng GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh Chương I: TỔNG QUAN I.1 Tổng quan lồi bị cạp I.1.1 Giới thiệu chung lồi bị cạp Bị cạp – loài động vật chân khớp – giống động vật không xương sống, tám chân thuộc lớp Arachnida (động vật hình nhện) Chúng động vật cổ đất (khoảng 450 triệu năm tiến hóa) [21] Có khoảng 1500 lồi bị cạp, phân bố rộng rãi vùng phía nam vĩ tuyến 45 Bắc ngoại trừ Tân Tây Lan Nam Cực Hình thái bị cạp khơng thay đổi theo thời gian tiến hóa [6] Trong nhiều lồi bị cạp có số lồi độc người, loài thuộc họ Buthidae Họ gồm 500 loài khác phân bố chủ yếu Châu Phi, Trung Cận Đông, Ấn Độ, Đông Nam Á, Trung Mỹ [32] I.1.2 Đặc điểm giải phẫu học bò cạp Thân bò cạp chia làm phần: phần đầu ngực (đốt thân trước hay prosoma) phần bụng (vùng thân sau hay opisthosoma) Phần bụng bao gồm phần bụng (mesosoma) (metasoma) [2;32] Hình I.1 Các phận bò cạp SVTH: Nguyễn Văn Hùng GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh Phần đầu ngực (prosoma): phần đầu bò cạp bao gồm lớp giáp, mắt, chân kìm (một phần miệng), chân kìm sờ chân Bộ giáp bò cạp dày giúp bảo vệ chống lại kẻ thù Bò cạp có mắt đỉnh đầu từ đến đơi mắt khác dọc theo góc trước đầu [32] Phần bụng (mesosoma): chia làm đoạn Đoạn chứa quan sinh dục dấu vết phận phụ bị tiêu giảm gọi nắp sinh dục Đoạn thứ cặp quan cảm giác giống chất pectin Bốn đoạn lại bao gồm phổi Phần bụng bọc giáp chất sừng [32] Phần đuôi (metasoma): gồm đốt (đốt đốt bụng cuối cùng) Hậu mơn bị cạp nằm đốt cuối cùng, đồng thời đốt mang nọc độc Đốt cuối phận chích (telson) gồm túi chứa, cặp tuyến độc mũi tiêm nọc độc [2;32] Giáp: bao quanh thể, số chỗ có lơng làm quan cân Một lớp phủ giáp vốn suốt biến thành màu xanh lục huỳnh quang tia tử ngoại Những bị cạp lột xác khơng phát sáng lớp giáp cứng cáp Lớp phủ khơng bị sứt mẻ hóa thạch suốt hàng trăm triệu năm [2;32] I.1.3 Nọc độc bò cạp Tất lồi bị cạp có nọc độc Nọc bị cạp có chứa polypeptide toxin tác dụng với receptor kênh ion màng tế bào bị kích thích Ngồi toxin nọc bị cạp cịn có chứa thành phần hoạt tính sinh học khác như: enzyme, nucleotide, lipides, mucoproteins, biogenicamines thành phần chưa biết [21] Những hoạt chất nghiên cứu nhiều nọc bò cạp neurotoxin, chúng tác dụng lên receptor kênh ion màng tế bào bị kích thích Phụ thuộc vào tác dụng toxin với kênh ion, người ta chia chúng làm loại, toxin tác dụng với kênh ion: kênh Na+, kênh K+, kênh Cl-, kênh Ca2+ [4] Tất toxin tác dụng với kênh Na+ cấu tạo từ 60 – 76 gốc axit amin cấu trúc chúng ổn định cầu nối disulfide [1;10] Trong toxin tác dụng với kênh K+ thường cấu tạo từ SVTH: Nguyễn Văn Hùng GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh 31 – 39 gốc axit amin cấu trúc chúng ổn định nhờ cầu disulfide [17;18;20] Có peptide khác nọc bò cạp tác dụng với dụng với kênh Ca2+, chúng thay đổi liên kết ryanodine với kênh Ca2+ Một số peptide cấu tạo từ 33 gốc axit amin, toxin tăng liên kết với ryanodine, toxin khác heterodimer peptide cấu tạo từ 104 27 gốc axit amin, ức chế liên kết với ryanodine [22;23] Chlorotoxin tác dụng với kênh Cl- peptide cấu tạo từ 36 gốc axit amin với cầu disulfide [3;11] Bò cạp dùng nọc độc để giết làm tê liệt mồi, hành động nhanh hiệu Nọc độc đa số lồi bị cạp vơ hại người, nhiên gây phản ứng khác đau, tê cứng hay sưng phồng Một vài lồi bị cạp chủ yếu họ Buthidae gây nguy hiểm tới người Những lồi bị cạp nguy hiểm Leuirus quinquestriatus – có nọc độc mạnh họ Buthidae, loài chi Parabuthus, Tityus, Centruroides, đặc biệt Androctonus – có nọc độc mạnh [34] Bị cạp nói chung nhút nhát vơ hại, chúng chích bắt mồi hay tự vệ Bị cạp có khả điều chỉnh lượng nọc chích, thơng thường 0,1 – 0,6 mg Bị cạp có loại nọc: loại nhẹ làm đối phương choáng váng loại mạnh đủ để giết chết kẻ thù [32] I.1.4 Sinh sản phát triển bò cạp a) Sinh sản Bò cạp sinh sản cách chuyển bào tinh từ đực qua Bị cạp đực đặt túi bào tinh vào nơi thích hợp hướng dẫn giữ lấy Con đưa túi bào tinh vào nắp sinh dục mình, bào tinh vỡ đưa tinh trùng vào người Việc giao cấu từ đến 25 tùy thuộc vào khả bị cạp đực tìm thấy nơi đặt túi tinh nhanh hay chậm Khi giao cấu xong đực rút lui thật nhanh chóng để tránh trường hợp bị bạn tình ăn thịt [2] Bị cạp sinh bám lưng mẹ chúng trải qua kỳ lột xác [2] SVTH: Nguyễn Văn Hùng GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hồng; TSKH Hồng Ngọc Anh Hình I.2 Bò cạp sống lưng bò cạp mẹ b) Sự phát triển bị cạp Trước kì lột xác lần bị cạp khơng thể sống sót khơng phụ thuộc vào mẹ chúng Bị cạp giống cha mẹ chúng, chúng lớn lên cách lột xác Sau đến lần lột xác bò cạp trưởng thành [2] Việc lột xác bắt đầu lớp xương trong, lớp giáp mép đốt thân trước bị nứt Những chân kìm sờ chân chúng lột xác đầu tiên, sau phần bụng Khi lột xác xong, lớp giáp chúng mềm bị tổn thương có cơng, sau thời gian lớp giáp trở nên cứng cáp Quá trình làm cứng lại lớp giáp gọi xơ cứng [2] I.1.5 Đời sống lồi bị cạp Bị cạp loài động vật hoạt động đêm hay đào bới, chúng đào hang suốt ngày để tìm nơi trú ẩn mát mẻ, chúng thường trú ẩn khơ hay tảng đá đến đêm ngồi săn mồi Chúng thích sống nơi có nhiệt độ khoảng 240C đến 320C độ ẩm khoảng 78 – 82% [32] Bò cạp động vật ăn thịt, thức ăn chúng đa dạng, từ loại côn trùng như: nhện, ruồi, dán, bướm, cào cào, châu chấu, kiến, rết… đến động vật nhỏ thằn lằn, rắn, chuột sinh, Chúng bắt mồi cách dùng để kẹp mồi, tùy vào lượng nọc độc kích cỡ mà bị cạp chích độc hay SVTH: Nguyễn Văn Hùng GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh dùng để kẹp mồi Cách làm tê liệt hay giết chết mồi để sau bị cạp ăn mồi [2] Hình I.3 Bị cạp bắt mồi I.1.6 Một số lồi bị cạp nước ta Bị cạp Việt Nam có họ: Buthidae (có lồi) Scorpionidae (có lồi) [27] a) Các lồi bị cạp thuộc họ Buthidae  Lychas mucronatus Fabricius: phân bố tỉnh miền Trung miền Nam, phát triển mạnh cá thể Đồng Phú (Bình Phước)  Isometrus basilicus Karch: phân bố Nghệ An, Quảng Trị, Bình Định, Khánh Hịa, Bình Phước  Isometrus sp: tập trung chủ yếu Vinh (Nghệ An) [27] b) Các lồi bị cạp thuộc họ Scorpionidae  Heterometrus spinifer: phân bố chủ yếu Bù Đốp, Bù Gia Mập, Đồng Phú thuộc tỉnh Bình Phước  Heterometrus petersii: phân bố thành phố Hồ Chí Minh, Bình Thuận, Khánh Hịa, Gia Lai, Lâm Đồng, Quảng Ninh SVTH: Nguyễn Văn Hùng GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh  Heterometrus laoticus Couzijn: phân bố chủ yếu thành phố Hồ Chí Minh, Tây Ninh, Đồng Nai, An Giang  Heterometrus cyaneus: chủ yếu Thừa Thiên Huế, Quảng Trị  Heterometrus sp: phân bố chủ yếu Mộc Châu (Sơn La), Ba Vì (Hà Tây) [27] I.1.7 Giới thiệu lồi bị cạp Heterometrus laoticus Hình I.4 Lồi Heterometrus laoticus Bị cạp Heterometrus laoticus lồi bị cạp thuộc họ Scorpionidae phân bố chủ yếu vùng Nam Đông Nam Á Ở Việt Nam có nhiều bị cạp Heterometrus, lồi bị cạp đen hay bị cạp rừng, bị cạp lồi Heterometrus laoticus tìm thấy nhiều vùng Nam Bộ [25] Độc tính chúng thay đổi thành phần nọc độc chúng bắt đầu khảo sát [25] SVTH: Nguyễn Văn Hùng 10 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh Theo kết thử độc tính chúng tơi xác định phân đoạn có độc tính gây chết chuột, từ chúng tơi tiếp tục tiến hành phân tích phân đoạn với phương pháp sắc kí lỏng cao áp III.4 Kết chạy điện di phân đoạn sau sắc kí lọc gel Để khảo sát thành phần protein phân đoạn tách ra, tiến hành điện di phân đoạn thu kết sau: kDa M1 pđ pđ pđ pđ pđ 170 130 100 70 55 40 35 25 15 10 Hình III.2 Kết điện di phân đoạn tách từ nọc bị cạp Chú thích: M- Marker chuẩn (hãng Fermentas), pđ - mẫu protein từ phân đoạn – Kết điện di cho thấy phân đoạn độc chứa protein sau: phân đoạn chứa protein nằm chủ yếu vùng có khối lượng phân tử – 20 kDa, độc tố phân đoạn có lẽ phospholipase (13 – 14 kDa) neurotoxin (3 – kDa) gây Phân đoạn chứa protein nằm chủ yếu vùng có khối lượng phân tử – 12 kDa, độc tố phân đoạn có lẽ neurotoxin (3 – kDa) nọc bò cạp gây Cịn phân đoạn khơng độc 1, Trong đó, phân SVTH: Nguyễn Văn Hùng 43 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh đoạn chứa protein nằm vùng 10 – 14 kDa 20 – 120 kDa, phân đoạn chứa protein nằm vùng – 17 kDa 25 – 32 kDa Phân đoạn chứa protein nằm vùng – kDa, phân đoạn có chứa protein nằm vùng tương đối giống với phân đoạn khơng có độc tính, chúng protein có khối lượng nằm vùng tương đương với neurotoxin chất chúng khác Phương pháp điện di cho biết khối lượng phân tử protein phần đánh giá tinh phân đoạn sau tách từ sắc kí lọc gel Do đó, cần kết hợp điện di với phương pháp thử hoạt tính sinh học khác để định hướng tách chất ta cần quan tâm Kết hợp điện di với thử độc tính lên chuột cho thấy nọc bò cạp Heterometrus laoticus gây chết chuột neurotoxin gây Qua phương pháp điện di chúng tơi thấy sắc kí lọc gel gel sephadex G-50 bước q trình phân tách tinh nọc bị cạp III.5 Kết chạy sắc kí lỏng cao áp cột C18 phân đoạn Sau thử độc tính xác định phân đoạn phân đoạn có độc tính gây chết chuột, chúng tơi tiến hành tách toxin phân đoạn phương pháp sắc kí lỏng cao áp đảo pha cột C18 Ban đầu chúng tơi chạy sắc kí lỏng cao áp cột phân tích sử dụng đầu dị UV bước sóng 210 nm, 254 nm, 280 nm, 320 nm để xác định bước sóng cho kết phân tách tốt Kết chạy sắc kí lỏng cao áp sử dụng đầu dị UV bước sóng thể qua hình III.3, III.4, III.5, III.6 SVTH: Nguyễn Văn Hùng 44 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh MWD1 D, Sig=210,4 Ref=off (HOANG BC\071010000013.D) mAU 250 200 150 100 50 -50 -100 10 20 30 40 50 60 70 Hình III.3 Sắc kí lỏng cao áp cột phân tích sử dụng đầu dị UV bước sóng 210 nm MWD1 A, Sig=254,4 Ref=off (HOANG BC\071010000013.D) mAU 15 10 10 20 30 40 50 60 70 Hình III.4 Sắc kí lỏng cao áp cột phân tích sử dụng đầu dị UV bước sóng 254 nm SVTH: Nguyễn Văn Hùng 45 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh MWD1 C, Sig=280,4 Ref=off (HOANG BC\071010000013.D) mAU 15 12.5 10 7.5 2.5 -2.5 10 20 30 40 50 60 70 Hình III.5 Sắc kí lỏng cao áp cột phân tích sử dụng đầu dị UV bước sóng 280 nm MWD1 B, Sig=320,4 Ref=off (HOANG BC\071010000011.D) mAU -1 -2 -3 10 20 30 40 50 60 70 Hình III.6 Sắc kí lỏng cao áp cột phân tích sử dụng đầu dị UV bước sóng 320 nm SVTH: Nguyễn Văn Hùng 46 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh Sau chạy sắc kí lỏng cao áp cột phân tích với bước sóng chúng tơi xác định bước sóng 280 nm cho kết nhận biết tốt Từ chúng tơi tiến hành chạy mẫu cột bán điều chế sử dụng đầu dị UV với bước sóng 280 nm để tinh phân đoạn Kết cho thấy phương pháp sắc kí lỏng cao áp đảo pha cột C18 sử dụng đầu dị UV bước sóng 280 nm phân tách từ phân đoạn 25 pic kết thể qua sắc kí đồ hình III.7 Hình III.7 Sắc kí lỏng cao áp cột C18 bò cạp Heterometrus laoticus * : độc tính gây chết chuột ** : độc tính làm chuột co giật mạnh Bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp cột C18, từ phân đoạn chúng tơi thu 25 pic với tính chất khác Từ kết phân tách phân đoạn tiến hành đông khô pic thử độc tính pic lên chuột để xác định toxin chứa phân đoạn Dựa vào sắc kí đồ, pic chúng tơi thu tay vào ống nghiệm khoảng thời gian trình bày bảng III.7 SVTH: Nguyễn Văn Hùng 47 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh Bảng III.7 Thời gian thu pic HPLC Số pic Thời gian bắt đầu thu mẫu (phút) 6,1 7,8 9,8 12,7 13,5 33,1 36,9 42,9 45,5 10 52,4 11 54,5 12 57,9 13 60,4 14 62,1 15 63,9 16 65,3 17 71,7 18 74,3 19 75,9 20 82,3 21 87,3 22 93,0 23 102,4 24 104,4 25 109,9 SVTH: Nguyễn Văn Hùng 48 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh Như với phương pháp sắc kí lỏng cao áp đảo pha cột C18 phân tách phân đoạn làm 25 pic khác nhau, thời gian pic rửa khỏi cột khoảng thời gian từ phút thứ đến phút thứ 110 III.6 Kết khảo sát độc tính pic sau chạy sắc kí lỏng cao áp Để tiến hành xác định toxin có phân đoạn chúng tơi tiến hành thử độc tính lên chuột 25 pic tách phương pháp sắc kí lỏng cao áp Sau khảo sát độc tính 25 pic lên chuột cho thấy có pic có độc tính gây chết chuột pic làm cho chuột run, tai đỏ co lại, co chân trước lại, thăng bằng, co giật mạnh chết sau 45 phút Độc tính pic pic làm cho chuột có biểu giống với chuột sau tiêm pic 6, thời gian chuột phục hồi sau tiêm pic pic lâu so với pic 5, 11 15 Các pic 5, 11, 15 có độc tính gây co giật mạnh chuột với biểu làm cho chuột hoạt động mạnh, run, gãi mõm, co người chân trước lại, co giật mạnh sau phục hồi lại Các pic 2, 10, 19 có độc tính làm cho chuột ngủ say Các pic lại sau tiêm lên chuột làm cho chuột có số biểu sốc thuốc hoạt động mạnh, gãi mõm sau hoạt động bình thường trở lại Kết thử độc tính trình bày qua bảng III.8 SVTH: Nguyễn Văn Hùng 49 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh Bảng III.8 Thử độc tính pic tách HPLC Số pic Quan sát chuột sau tiêm Chuột hoạt động mạnh, run, co người, gãi nhiều sau nằm im phục hồi sau 30 phút Chuột nằm im, co người, xù lông, ngủ say phục hồi sau 15 phút Nhận xét Không độc Độc nhẹ Chuột hoạt động mạnh, run, xù lông, gãi mõm, co chân trước đứng chân sau, tiết nước bọt nhiều, co giật mạnh kéo dài, tai đỏ, Độc sau nằm im, chân yếu vận động phục hồi sau 45 phút Chuột gãi mõm, thở mạnh, co giật nhẹ hoạt động bình thường sau 40 phút Chuột xù lông, co người, run, tiết nước bọt, co giật nhiều lần kéo dài phục hồi sau Không độc Độc Chuột xù lông, run, gãi mõm, tiết nhiều nước bọt, tai đỏ co lại, chân trước co lại đứng chân sau thăng bằng, co giật mạnh kéo dài Độc gây chết chết sau 45 phút Chuột run, tiết nhiều nước bọt, tai đỏ, lại thăng bằng, thường đứng chân sau, chân trước co lại, yếu dần nằm im phục hồi Độc dần sau 10 11 Chuột vận động nhiều sau nằm im hoạt động bình thường sau 30 phút Chuột xù lông, gãi người, co giật nhẹ kéo dài sau nằm im phục hồi sau 30 phút Chuột nằm im, xù lông, co người, ngủ say phục hồi sau 20 phút Chuột xù lông, co người, gãi người, run, hoạt SVTH: Nguyễn Văn Hùng Không độc Không độc Độc nhẹ Độc 50 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh động mạnh, co giật mạnh phục hồi sau 30 phút 12 13 14 15 16 17 18 19 Chuột hoạt động mạnh, gãi người, chạy nhiều, co giật phục hồi sau 30 phút Chuột hoạt động nhiều, co giật nhẹ, gãi người phục hồi sau Chuột xù lông, gãi người, co giật nhẹ, hoạt động mạnh kéo dài phục hồi sau Chuột xù lông, gãi người, hoạt động mạnh, co giật, co người lại phục hồi sau 30 phút Chuột giật nhẹ sau nằm im hoạt động bình thường sau 20 phút Chuột co người nằm im, xù lông, gãi người gãi mõm nhiều hoạt động bình thường sau Chuột nằm im, gãi mõm, xù lông hoạt động bình thường sau Chuột xù lơng, co người, nằm im ngủ say sau hoạt động mạnh gãi nhiều phục hồi sau Không độc Không độc Không độc Độc Không độc Không độc Không độc Độc nhẹ Chuột hoạt động mạnh, xù lông, co người, gãi 20 21 người nhiều, chạy nhiều bình thường sau Chuột lại nhiều, xù lơng sau nằm im hoạt động bình thường sau Khơng độc Khơng độc 22 Chuột vận động sau hoạt động bình thường Khơng độc 23 Chuột đứng im sau bình thường Khơng độc 24 25 Nước cất Chuột xù lông, run, nằm im hoạt động bình thường sau Chuột lại nhiều, xù lơng sau nằm im hoạt động bình thường sau Khơng độc Khơng độc Chuột hoạt động bình thường SVTH: Nguyễn Văn Hùng 51 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh Như sau thử độc tính 25 pic lên chuột chúng tơi xác định có pic có độc tính chuột pic 2, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 15, 19 Trong pic pic có độc tính mạnh gây chết chuột Các pic pic có độc tính với chuột tương tự pic pic có độc tính gây chết chuột Các pic 5, 11, 15 có độc tính gây co giật mạnh chuột Cịn pic 2, 10, 19 có độc tính nhẹ làm cho chuột ngủ say Dựa vào sắc kí đồ sắc kí lỏng cao áp kết khảo sát độc tính lên chuột cho thấy phân đoạn độc rửa khỏi cột khoảng thời gian chủ yếu từ phút thứ 10 đến phút thứ 64 bao gồm pic 3, 5, 6, 7, 11, 15 Qua kết khảo sát độc tính trên, xác định sơ toxin chứa phân đoạn pic 3, 5, 6, 7, 11 15 Các pic tiến hành tinh tiếp tục phương pháp sắc kí lỏng cao áp để phục vụ cho nghiên cứu toxin nọc bò cạp Heterometrus laoticus SVTH: Nguyễn Văn Hùng 52 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh Chương IV: KẾT LUẬN Qua thời gian tháng thực đề tài, chúng thu kết sau:  Về trình ni thu nọc: Qua thời gian tháng thực đề tài, khảo sát 1000 bò cạp ni phịng thí nghiệm chúng tơi thu 5,8381 g nọc thơ, protein chiếm 64,65% lượng nọc  Về việc khảo sát thành phần protein, xác định khối lượng phân tử xác định phân đoạn có độc tính nọc bị cạp: Sử dụng phương pháp sắc kí lọc gel gel sephadex G-50 với thông số sau:  Tốc độ rửa cột 0,16 ml/phút  Thể tích thu ống ml  Thể tích mẫu đưa lên cột ml mẫu với nồng độ 150 mg/ml  Sự có mặt protein phân đoạn xác định theo mật độ quang bước sóng 280 nm Từ chúng tơi tách nọc bị cạp Heterometrus laoticus làm phân đoạn Thử độc tính phân đoạn lên chuột cho thấy có phân đoạn độc phân đoạn 4, phân đoạn độc gây chết chuột Sau tiến hành chạy điện di xác định khối lượng phân tử phân đoạn này, phân đoạn có khối lượng phân tử nằm khoảng -12 kDa, điều cho thấy độc tính gây chết chuột nọc bị cạp Heterometrus laoticus neurotoxin (3 – kDa) gây  Về việc phân tích thành phần độc tố nọc bò cạp: Tiến hành tách toxin phân đoạn phương pháp sắc kí lỏng cao áp đảo pha cột C18 với điều kiện sau:  Tốc độ dòng ml/phút  Mẫu bơm tự động lên cột với thể tích lần bơm 100 µl mẫu có nồng độ 200 µg/µl SVTH: Nguyễn Văn Hùng 53 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh  Thời gian rửa cột 125 phút với thể tích dung dịch B theo gradient tuyến tính – 40%  Sự có mặt protein phân đoạn sắc kí phát đầu dị UV bước sóng 280 nm Từ chúng tơi thu 25 pic Qua khảo sát độc tính lên chuột 25 pic chúng tơi xác định có pic có độc tính chuột, pic số có độc tính gây chết chuột; pic có độc tính gần giống với độc tính pic pic pic 7; pic có độc tính mạnh làm chuột co giật pic 5, 11, 15 pic có độc tính nhẹ làm chuột ngủ say pic 2, 10, 19  Hướng nghiên cứu tiếp theo: Sau xác định pic có độc tính pic tiếp tục tiến hành tinh phương pháp sắc kí lỏng cao áp để phục vụ cho nghiên cứu toxin nọc loài bò cạp Heterometrus laoticus SVTH: Nguyễn Văn Hùng 54 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh TÀI LIỆU THAM KHẢO Cohen L., Liptein N., Karbat I., Llan N., Gilles N., Kahn R., Gordon D and Gurevitz M - Miniturization of scorpion {beta}-toxin uncovers a putative ancestral surface of interaction with voltage-gate sodium channels - J Biol Chem 2008, 283, 15169 – 15176 Dawn H Gouge, Kirk A Smith, Carl Olson, Paul Baker - Scorpions Cooperative extension, college of agriculture and life sciences, the university of Arizona Debin J.A., Maggio J.E., Strichartz G.R - Purification and characterizion of chlorotoxin, a chloride channel ligand from the venom of the scorpion – Am J Physol., 1993, 264, (cell.physiol 33), C361 – C369 E V Grishin, Yu V Koronkova, S A Kozlov, A V Lipkin, E D Nosyreva, K A Pluzhnikov, S V Sukhanov, T M Volkova - Structure and function of the potassium channel inhibitor from black scorpin venom - Pue & Appl Chem, vol 68, no 11, pp 2105-2109, 1996 Emily Sohn - Scorpion venom tapped as pesticide - Discovery news, Tuesday Jan 19, 2010 Gulberk UCAR, Canan TAS - Cholinesterase inhibitory activities of the scorpion Mesobuthus venom peptides - FABAD J Pharm Sci, 28,61-70, 2003 Hoefer scientific instruments - Electrophoresis Instruments and accessories Techniques and exercises - 1990-1991 John J Reeves - Scorpion envenomation - Clinical toxicology review, Vol 20, No March 1998 John M Walker - Basic protein and peptide protocols - Methods in molecular biology 32, Humana press, Totowa, New Jersey 10 Lebreton F., Delepierre M., Ramirez A.N., Balderas C., Possani L.D - Primary and NMR three-dimensional structure determination of novel crustacean toxin from the venom scorpion Centruroides limpidus Karsch - Biochemistry, 1994, 33, 11135 – 11149 11 Lippens G., Najib J., Wodak S.J., Tarta A - NMR sequential assignments and solution structure of chlorotoxin, a small scorpion toxin that blocks chloride channels - Biochemistry, 1995, 34, 13 – 31 12 Lourival D Possani, Baltazar Becerril, Muriel Delepierre, Jan Tytgat - Scorpion toxins specific for Na+ channels - Eur J Biochem 264, 287-300 (1999) 13 Martha E Ramirez-Dominguez, Timoteo Olamendi-Portugal, Ubaldo Garcia, Consuelo Garcia, Hugo Arechiga, Lourival D Possani - Cn11, the first example of a scorpiontoxin that is a true blocker of Na+ currents in crayfish neurons The Journal of Experimental Biology 205, 869-876, 2002 14 Nunthawun Uawonggul, Arunrat Chaveerach, Sompong Thammasirirak, Tarinee Arkaravichien, Chattong Chuachan, Sakda Daduang - Screening of plants acting against Heterometrus laoticus scopion venom activity on fibroblast cell lysis – Sciencedirect SVTH: Nguyễn Văn Hùng 55 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh 15 P Gopalakrishnakone, J Cheah, M C E Gwee - Black scorpion as a laboratory animal: maintenance of a colony of scorpion for milking of venom for research, using a restraining device - Laboratory animal 29, 456-458, 1995 16 Richard J Lewis, Maria L Garcia - Therapeutic potential of venom peptides Nature reviews, drug discovery, volume 2, 10/2003 17 Rochat H., Kharat R., Sabatier J.M., Mansuelle P., Crest M., Martin-Eauclaire M.F., Sampieri F., Ouqhideni R., Mabrouk K., Jacquet G., Van Riestchoten J., El Ayed M - Maurotoxin, a four disulfide brigdes scorpion toxin acting on K+ channels - Toxicon, 2004, 43, 865 – 875 18 Rodriguez de la Vega R.C., Possani L.D - Current views on scorpion toxins specific for K+- channels - Toxicon, 2004, 43, 865 – 875 19 Scott Bringans, Soren Eriksen, Tulene Kendrick, Rasvinder Kaur, P Gopalkrishnakone, Richard Lipscombe - Proteomic analysis of the venom of Heteromutrus longimanus (Asian black scorpion) - Proceedings of the 4th Intenational Peptide Symposium in conjunction with the 7th Autralian Peptide Conference and the 2nd Asia-Pacific International Peptide Symposium, 2007 20 Vacher H., Romi-Lebrun R., Mourre C., Lebrun B., Kourrich S., Masmejean F., Nakajima T., Legros C., Crest M., Bougis P.E., Martin-Eauclaire M.F - A new class of scorpion toxin binding sites related to A-typed K+ channel: Phamarcological characterization and localization in rat brain - FEBS letters, 2001, 501, 31 – 36 21 Vera L Petricevich - Review arcicle: scorpion venom and the inflammatory respone - Hindawi Publishing corporation, Mediators of inflammation, volume 2010, article ID 903295 22 Zamudio F.Z., Currola G.B., Arevalo C., Srekumar R., Walker J.W., Valdivia H.H., Possani L.D - Primary structure and synthesis of imperatoxin A (Ip Txa), a peptide activator of Ca2+ release channels/reanodine receptors - FEBS lett ,1997, 405, 385 – 389 23 Zamudio F.Z., Conde R., Arevalo C., Becerril B., Martin B.M., Valdivia H.H., Possani L.D - The miechanism of inhibition of ryanodine receptor channels by imperatoxin I, a heterodimeric protein from the scorpion Pandinus imperator – J Biol Chem 1997, 272, 11886 – 11894 24 Hoàng Ngọc Anh, Phạm Nguyên Đông Yên, Nguyễn Thị Mai Hương, Trần Vương Đức Nghĩa, Võ Phùng Nguyên - Nghiên cứu thành phần protein nọc bị cạp Heterometrus Laoticus sau thời gian ni phịng thí nghiệm - Tạp chí hóa học, T.47 (4A), Tr 577 - 581, 2009 25 Hoàng Ngọc Anh, Phạm Nguyên Đông Yên, Nguyễn Thị Mai Hương, Võ Phùng Ngun - Khảo sát chất có hoạt tính sinh học nọc bị cạp Heterometrus Laoticus - Tạp chí hóa học, T.47 (2), Tr 133-137, 2009 26 Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngơ Đại Hiệp - Thực tập lớn sinh hóa Nhà xuất đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh, 2004 27 Lê Xuân Huệ, Phạm Quỳnh Mai, Phạm Đình Sắc, Ngơ Thị Cát - Bị cạp (scorpionides) Việt Nam - Tạp chí sinh học Tr 7-9, 3/1998 28 Nguyễn Kim Phi Phụng - Phương pháp cô lập hợp chất hữu - Nhà xuất đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh SVTH: Nguyễn Văn Hùng 56 GVHD: ThS Võ Đỗ Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh 29 Nguyễn Thị Phương Khuê, Võ Phùng Nguyên, Hoàng Ngọc Anh - Nghiên cứu độc tính cấp tác dụng giảm đau nọc bị cạp nâu bò cạp đen Việt Nam - Y học TP Hồ Chí Minh, tập 12, phụ số 1, 2008 30 Nguyễn Thị Phương Khuê, Võ Phùng Nguyên, Hồng Ngọc Anh - Nghiên cứu độc tính cấp, tác dụng giảm đau, kháng viêm nọc bò cạp đen Tây Ninh Tạp chí dược học, số 389, 9/2008 31 Phạm Thị Ánh Hồng - Kĩ thuật sinh hóa - Nhà xuất đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh 2003 32 Trần Việt Hưng - Bò cạp: thức ăn vị thuốc - Y dược ngày nay, 06/01/2010 33 Võ Phùng Nguyên, Lưu Hoàng Lê Giang, Hoàng Ngọc Anh - Độc tính cấp bán trường diễn tác động giảm đau nọc bò cạp đen An Giang Heterometrus Laoticus - Y học TP Hồ Chí Minh, tập 13, phụ số 1, 2009 34 Vũ Hồng Quang, Vũ Quang Minh, Lê Xuân Huệ - Ảnh hưởng thức ăn đến phát triển bò cạp nâu Lychas Mucromatus Fabr - Tạp chí sinh học 18(3): 44-46, 9-1996 SVTH: Nguyễn Văn Hùng 57 ... đơng tiến hành chạy mẫu Sau phần gel gom đông, ta gỡ bỏ lược khỏi gel đưa kính khỏi khung cố định đặt vào khung chuẩn bị chạy điện di Sau pha 100 ml đệm với 900 ml nước cất đổ vào bể điện di khoảng... Minh Hoàng; TSKH Hoàng Ngọc Anh Chương I: TỔNG QUAN I.1 Tổng quan lồi bị cạp I.1.1 Giới thiệu chung lồi bị cạp Bị cạp – lồi động vật chân khớp – giống động vật không xương sống, tám chân thuộc... loài chi Parabuthus, Tityus, Centruroides, đặc biệt Androctonus – có nọc độc mạnh [34] Bị cạp nói chung nhút nhát vơ hại, chúng chích bắt mồi hay tự vệ Bị cạp có khả điều chỉnh lượng nọc chích, thơng