Xác định hợp chất polyphenol toàn phần có trong một số loại rau quả có tác dụng làm mịn da bằng phương pháp folin-ciocalteu

Nội dung bài viết với mục tiêu xác định hàm lượng polyphenol toàn phần có trong các loại rau củ quả: Cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua và ớt chuông có trong bài thuốc làm đẹp da phổ biến trong dân gian hiện nay.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT POLYPHENOL TỒN PHẦN CĨ TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU QUẢ CÓ TÁC DỤNG LÀM MỊN DA BẰNG PHƯƠNG PHÁP FOLIN-CIOCALTEU Giang Thị Phương Anh*, Phan Thanh Dũng*, Võ Thị Bạch Huệ* TĨM TẮT Mục đích: Xác định hàm lượng polyphenol tồn phần có loại rau củ quả: cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua ớt chng có thuốc làm đẹp da phổ biến dân gian Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Các loại rau, củ, cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua ớt chuông khảo sát sơ thành phần hóa thực vật; định lượng polyphenol tồn phần phương pháp FolinCiocalteu Kết bàn luận: Kết khảo sát cho thấy: Có nhiều carotenoid cà chua cà rốt Trong dịch chiết nước dịch chiết cồn có diện hợp chất polyphenol Trong dịch chiết cồn ngồi diện proanthocyanidin có flavonoid.Đã khảo sát điều kiện tối ưu để chiết xuất xây dựng phương pháp xác định hàm lượng polyphenol toàn phần, cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua ớt chuông Kết thẩm định qui trình cho thấy phương pháp định lượng có độ lặp lại xác cao (RSD < 4%); tỉ lệ phục hồi nằm giới hạn cho phép (85% - 110%) Kết luận: Đã xây dựng thành công qui trình định lượng polyphenol tồn phần có số loại rau củ phương pháp Folin Ciocalteu Qui trình định lượng thẩm định áp dụng thành công số loại rau củ cà chua, khổ qua, ớt chng, cần tây Từ khóa: Folin Ciocalteu, ớt chuông, cà rốt, cà chua, khổ qua, cần tây ABSTRACT DETERMINATION OF TOTAL POLYPHENOL IN SOME VEGETABLES, TUBERS AND FRUITS FOLIN-CIOCALTEU METHOD Giang Thị Phương Anh, Phan Thanh Dung, Vo Thi Bach Hue * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 193 - 197 Objective: To determination of total polyphenol components of some vegetables, tubers and fruits: tomato, carrot, celery, green pepper and bitter melon in a popular skin-care medication Materials and methods: Some vegetables, tubers and fruits such as tomato, carrot, celery, bitter melon and green pepper were characterized for chemical components and quantification of the total polyphenol compounds by Folin-Ciocalteu method Results and disscussion: Preliminary study of plant chemistry found the presence carotenoids in tomato and carrot The aqueous and ethanol extracts contain polyphenol The ethanol extrac contains proanthrocyanidine and also flavonoid The optimized conditions for extracting and quantity determination of total polyphenol compound have been investigated Validation results showed that the quantification method has good repeatability and accuracy with (RSD < 4%); recovery range from (85-110%) which is within acceptable limit Conclusion: The quantification procedure for determination of total polyphenol in some vegetables, tubers * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh ĐT: 0983 957158 Tác giả liên lạc: TS Phan Thanh Dũng Chuyên Đề Dược Học Email: dungpharm@yahoo.com 193 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học and fruits by Folin Ciocalteu method has been established The procedure has been validated and succesfully applied for tomato, bitter melon, green pepper and celery Key word: Folin Ciocalteu, green peppers, carrot, tomato, bitter melon, celery ĐẶT VẤN ĐỀ Trang thiết bị Để giữ gìn tuổi trẻ sắc đẹp việc ăn uống đầy đủ dinh dưỡng, xu hướng đa số chị em sử dụng sản phẩm dưỡng da, chống lão hóa Trên thị trường sản phẩm làm đẹp đa dạng chủ yếu sản phẩm ngoại nhập Rất khó phân biệt sản phẩm thật, sản phẩm giả khó biết rõ tác dụng phụ chúng đến đâu Chính vậy, xu hướng làm đẹp da sản phẩm từ thiên nhiên thịnh hành Có nhiều thuốc dân gian làm đẹp da từ số rau, củ, phổ biến dễ tìm, dễ chế biến như: dưa leo, cà chua, cà rốt, sữa chua, mật ong, trà xanh.v.v…Bài thuốc làm đẹp da phổ biến gồm hỗn hợp loại rau, củ, quả: cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua ớt chng Đề tài góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học loại rau củ có thuốc Máy quang phổ UV-Vis Shimadzu 2550 với phần mềm UVProbe V 1,11 (Japan) Phương pháp nghiên cứu Khảo sát sơ thành phần hóa thực vật : Chiết chất có nguyên liệu thực vật thành phân đoạn có độ phân cực tăng dần với dung môi: ether ethylic, ethanol (hay methanol) nước Xác định nhóm hợp chất dịch chiết phản ứng đặc trưng ( , ) Định lượng hợp chất phenol toàn phần phương pháp Folin-Ciocalteu(1,5,6,7,10): dựa khử tungstat/molybdat thuốc thử Folin-Ciocalteu hợp chất phenol/mơi trường kiềm tạo sản phẩm có màu, đo độ hấp thu bước sóng cực đại sản phẩm thu (phương pháp quang phổ) Thăm dò điều kiện tối ưu để định lượng: tiến hành xác định độ ổn định thuốc thử Folin Ciocalteu 1/10 dung dịch natri carbonat 7,5% Xác định bước sóng hấp thu cực đại dung dịch thử nghiệm Xác định độ ổn định hấp thu quang dung dịch thử nghiệm Khảo sát chiết xuất nhiệt độ phòng 40 oC Xác định thời gian siêu âm để chiết hoàn toàn hợp chất polyphenol mẫu thử VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng Dịch chiết cồn từ loại rau, củ, quả: cà chua, cà rốt, cần tây, ớt chuông khổ qua thu mua Đà Lạt Chất đối chiếu: Pyrogallol 98,00%, Fluka, lot 1273740, Vitamin C 99,56%, SanofiSynthelabo VN (chuẩn làm việc, số kiểm soát: 100256-WS), Acid gallic 99,00%, Trung Quốc Xây dựng qui trình, thẩm định quy trình phân tích(2,4) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Khảo sát sơ thành phần hóa thực vật(3,9) Bảng 1: Khảo sát sơ thành phần hóa thực vật Hợp chất xác định Dịch chiết ether Carotenoid (TT H2SO4 đđ) Dịch chiết cồn Cà chua Ớt chuông +++ - Flavonoid γ-pyron Anthocyanosid Proanthocyanidin +++ ++ +++ +++ 194 Dược liệu Cà rốt Cần tây Khổ qua +++ - - + + + Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Hợp chất xác định - Polyphenol Dịch chiết nước Proanthocyanidin - Polyphenol Cà chua ++ Ớt chuông ++ +++ ++ + ++ Nghiên cứu Y học Dược liệu Cà rốt +++ + +++ Cần tây ++ Khổ qua ++ + ++ + ++ Ghi chú: (+): phản ứng có màu nhạt; (++): phản ứng có màu rõ; (+++): phản ứng có màu rõ; (-): phản ứng âm tính Kết khảo sát cho thấy dịch chiết ether có nhiều carotenoid cà chua cà rốt Trong dịch chiết nước dịch chiết cồn có diện hợp chất flavonoid hợp chất polyphenol Trong dịch chiết cồn diện proanthocyanidin dịch chiết nước có flavonoid cấu trúc pyron Tiến hành khảo sát thời gian ổn định phản ứng màu từ 0-120 phút Kết cho thấy, thời gian tối ưu từ 30-40 phút Khảo sát bước sóng hấp thu cực đại Bảng 2: Kết khảo sát bước sóng hấp thu cực đại (λmax /nm) Định lượng hợp chất phenol toàn phầnphương pháp Folin-Ciocalteu (λmax /nm) Acid gallic Pyrogallol 758 752 Cần tây 746 Khổ qua 748 Cà chua 760 Cà rốt 768 Ớt chuông 753 Điều kiện tối ưu để định lượng Tiến hành khảo sát phương pháp chiết xuất, thời gian chiết, nhiệt độ chiết xuất, thời gian ổn định màu phản ứng bước sóng hấp thu cực đại nguyên liệu kết cho thấy điều kiện định lượng tối ưu sau: - Mẫu chiết với dung môi cồn 50% phương pháp siêu âm phút Nhiệt độ chiết xuất: 40 oC Thời gian ổn định phản ứng màu: 30 - 40 phút Đo quang bước sóng hấp thu cực đại: 750 nm Xác định dung môi chiết Qua khảo sát sơ thành phần hóa thực vật dung môi để chiết hợp chất phenol nguyên liệu cồn chiết nhiều hợp chất so với nước Khảo sát nhiệt độ thời gian siêu âm Tiến hành khảo sát thời gian siêu âm từ 5- 60 phút nhiệt độ từ 30 đến 45 0C Kết cho thấy nhiệt độ chiết xuất tối ưu 400 C thời gian siêu âm tối ưu phút Khảo sát thời gian ổn định phản ứng màu Kết thẩm định quy trình Bảng 3: Tương quan tuyến tính nồng độ độ hấp thu Mẫu Nồng độ (mg/ml) Chuẩn gallic Chuẩn pyrogallol Cà chua Cà rốt Cần tây Khổ qua Ớt chuông 0,01 - 0,1 0,01 - 0,1 60 - 600 60 - 600 120 - 1200 60 - 600 20 - 200 Hệ số tương quan (R ≥ 0,99) 0,9998 0,9990 0,9963 0,9930 0,9937 0,9919 0,9974 Phương trình hồi quy Ŷ = 10,3955 X + 0,0108 Ŷ = 13,721 X Ŷ = 1,5083X + 0,066 Ŷ = 0,5049 X + 0,0285 Ŷ = 0,5936 X + 0,0296 Ŷ = 1,379 X + 0,1545 Ŷ = 0,8697 X + 0,0622 ⇒ Có tương quan chặt chẽ nồng độ độ hấp thu Bảng 4: Kết khảo sát độ Khoảng tin cậy 95% (n=5) Cà chua Cà rốt Cần tây 80% 89,72 94,00 89,74 Chuyên Đề Dược Học Thêm chuẩn gallic 100% 94,53 91,26 89,12 120% 99,66 98,63 92,74 80% 103,71 86,04 92,83 Thêm chuẩn pyrogallol 100% 102,24 89,28 92,79 120% 93,78 91,91 91,37 195 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Khoảng tin cậy 95% (n=5) Khổ qua Ớt chuông 80% 108,51 101,10 Thêm chuẩn gallic 100% 108,50 98,11 120% 108,99 95,84 80% 103,72 94,74 Thêm chuẩn pyrogallol 100% 120% 106,45 102,14 89,27 90,33 Tỉ lệ phục hồi nằm giới hạn cho phép 85% - 110% Bảng 5: Kết khảo sát độ lặp lại RSD% (n=5) Cà chua Cà rốt Cần tây Khổ qua Ớt chuông 80% 1,2 4,1 0,7 2,1 2,4 Thêm chuẩn gallic 100% 2,6 2,4 2,2 0,6 3,1 120% 2,5 3,1 3,2 1,3 3,9 80% 2,2 2,9 2,5 3,7 2,9 Thêm chuẩn pyrogallol 100% 120% 3,5 2,8 3,9 3,4 3,9 3,5 3,2 4,2 3,2 2,9 Độ lặp lại nằm giới hạn cho phép ≤ 4% Bảng 6: Kết độ lặp lại ngày khác ngày Hợp chất phenol toàn phần /100 g nguyên liệu tươi tính theo mg chuẩn gallic pyrogallon (khoảng tin cậy 95%) Chuẩn gallic Chuẩn pyrogallol Nguyên liệu Cùng ngày Khác ngày Cùng ngày Khác ngày Cà chua 27,99 (1,0%) 25,15 (2,4%) 17,61 (1,0%) 15,87 (2,4%) Cà rốt 21,07 (2,8%) 22,58 (3,1%) 13,26 (2,8%) 14,25 (3,1%) Cần tây 9,41 (2,1%) 9,27 (2,0%) 6,00 (2,1%) 5,87 (2,0%) Khổ qua 22,58 (2,5%) 23,71 (1,1%) 14,21(2,5%) 14,96 (1,1%) Ớt chuông 56,51 (1,6%) 51,99 (2,7%) 35,56 (1,6%) 32,81 (2,7%) Phương pháp có độ lặp lại nguyên liệu tốt % RSD ≤ 4% Quy trình định lượng - Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 25 mg acid gallic 25 mg pyrogallol vào bình định mức 50 ml Thêm 30 ml dung dịch cồn 50%, siêu âm để tan hoàn toàn Để nguội, thêm dung dịch cồn 50% đến vạch Đảo đều, dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml (dung dịch S), bảo quản tránh ánh sáng - Dung dịch thử: Cân 15 g (cà chua, cà rốt, khổ qua); 30 g cần tây vào cốc thủy tinh 100 ml, thêm cồn 50% (lần 1-10 ml, lần 2-5 ml) g ớt chuông vào cốc thủy tinh 100 ml, thêm cồn 50% (lần 1-10 ml, lần 2-10 ml) Siêu âm phút 40 oC với cường độ 100% Gạn dịch chiết Gộp tất dịch chiết, để nguội, lọc qua giấy lọc, loại bỏ ml dịch lọc đầu, dung dịch thử (dung dịch T), bảo quản tránh ánh sáng Bảng 7: Bảng thực phản ứng xác định hợp chất phenol toàn phần Dung dịch thêm vào (ml) N Mẫu chuẩn Mẫu thử Mẫu trắng Dung dịch ethanol 50% 0 Dung dịch S 1,0 Dung dịch T 1,0 TT F-C 1/10 5,0 5,0 Lắc rung để đồng hỗn hợp Để yên phút tối nhiệt độ phòng Dung dịch Na2CO3 7,5 % Điền đầy đến vạch 10 ml Đảo Lắc rung để đồng hỗn hợp Để yên tối 30 phút nhiệt độ phòng Đo hấp thu quang 750 nm Cơng thức tính lượng hợp chất phenol toàn 196 1,0 0 5,0 phần/ 100 g nguyên liệu tươi theo chuẩn gallic Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 hay pyrogallol (mg): X= At × mS × CS × f ×100 AS × mt At, AS: độ hấp thu quang thử chuẩn, mS:khối lượng chuẩn (mg), CS: hàm lượng Nghiên cứu Y học chuẩn tinh khiết (số mg chuẩn tinh khiết có 100 mg nguyên liệu) mt: khối lượng thử (g), f: hệ số pha loãng (f = 0,03 cà chua, khổ qua cần tây; f = 0,04 nguyên liệu cà rốt ớt chuông) Kết xác định hợp chất phenol toàn phần nguyên liệu Bảng 8: Kết xác định hợp chất phenol toàn phần (n = 6) Nguyên liệu Cà chua Cà rốt Hợp chất phenol toàn phần/100 g nguyên liệu tươi tính theo mg chuẩn Chuẩn gallic Chuẩn pyrogallol 28,29 ± 0,30 (1,0%) 17,70 ± 0,19 (1,0%) 21,29 ± 0,62 (2,8%) 13,32 ± 0,39 (2,8%) Cần tây 9,41 ± 0,21 (2,1%) 6,00 ± 0,14 (2,1%) Khổ qua Ớt chuông 22,83 ± 0,60 (2,5%) 57,12 ± 0,93 (1,6%) 14,28 ± 0,38 (2,5%) 35,73 ± 0,68 (1,6%) KẾT LUẬN Đề tài khảo sát sơ thành phần hóa học dược liệu cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua ớt chuông Kết khảo sát cho thấy Có nhiều carotenoid cà chua cà rốt Trong dịch chiết nước dịch chiết cồn có diện hợp chất flavonoid hợp chất polyphenol Trong dịch chiết cồn diện proanthocyanidin có flavonoid - Đã khảo sát điều kiện tối ưu để chiết xuất xây dựng phương pháp xác định hàm lượng hợp chất phenol toàn phần, cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua ớt chng Kết thẩm định qui trình cho thấy phương pháp định lượng có độ lặp lại xác cao; tỉ lệ phục hồi nằm giới hạn cho phép 85% - 110% Áp dụng qui trình thẩm định xác định hàm lượng hợp chất polyphenol toàn phần, cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua ớt chuông TÀI LIỆU THAM KHẢO Doss A, Pugalenthi M, Rajendrakumaran D and Vadivel V (2010), Phenols, flavonoids and antioxidant activity of under- Chuyên Đề Dược Học 10 utilized legume seeds, Asian J.Exp SCI 1(3): 700-705 AOAC Guidelines for Single Laboratory (2002), Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals, pp 13-22 Bộ môn Dược Liệu (2008), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dược TP HCM, 26-42 Ermer J, McB Miller JH (2004), Method Validation in Pharmaceutical Analysis, A Guide to best Practice, WileyVCH p 418 Antolovich M et al (2002), “Methods for testing antioxidant activity”, Analyst 127 (1): 183-198 Turkmen T et al (2007),“Effect of extraction conditions on measured Total Polyphenol contents and Antioxidant and antibacterial activities of Black tea”, Molecules 12: 484-496 Pham Thanh Quan, Tong Van Hang, Nguyen Hai Ha, Nguyen Xuan De, Truong Ngoc Tuyen (2006), “Microwaveassisted extraction of polyphenols from fresh tea shoot”, tạp chí phát triển KH&CN 9:70 Burda S and Oleszek W (2001), “Antioxidant and antiradical activities of flavonoids”, J Agric Food Chem 49 (6):2774-2779 Trương Văn Thiện (2008), Tổng hợp khảo sát tác dụng chống oxy hoá in vitro dẫn chất Chrysin, luận văn Dược sỹ đại học, Khoa Dược - Đại học Y Dược Tp HCM Zhang Z, Jin J, Shi L (2008), Antioxidant activities of the derivaties of polysaccharide extracted from a Chinese medical herb (Ramulus mori), Food Sci.Technol 14: 160-168 Ngày nhận báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 24.12.2013 Ngày báo đăng: 10.03.2014 197 ... nước Xác định nhóm hợp chất dịch chiết phản ứng đặc trưng ( , ) Định lượng hợp chất phenol toàn phần phương pháp Folin-Ciocalteu( 1,5,6,7,10): dựa khử tungstat/molybdat thuốc thử Folin-Ciocalteu hợp. .. định qui trình cho thấy phương pháp định lượng có độ lặp lại xác cao; tỉ lệ phục hồi nằm giới hạn cho phép 85% - 110% Áp dụng qui trình thẩm định xác định hàm lượng hợp chất polyphenol toàn phần, ... flavonoid hợp chất polyphenol Trong dịch chiết cồn diện proanthocyanidin có flavonoid - Đã khảo sát điều kiện tối ưu để chiết xuất xây dựng phương pháp xác định hàm lượng hợp chất phenol toàn phần, cà