QUY TRÌNH sản XUẤT và TINH SẠCH LYASES PECTIN từ b PUMILUS

MỤC LỤC Chương 1 TỔNG QUAN 3 1 1 KHÁI NIỆM 3 1 2 CÁC PHẢN ỨNG ENZYME LYASES 4 1 3 PHÂN LOẠI 5 Chương 2 NGUỒN NGUYÊN LIỆU 7 Các nguồn thu nhận alginate lyase 7 2 1 Alginate lyase từ rong biển 7 2 2 Alg[.]

MỤC LỤC Chương TỔNG QUAN .3 1.1 KHÁI NIỆM 1.2 CÁC PHẢN ỨNG ENZYME LYASES 1.3 PHÂN LOẠI Chương NGUỒN NGUYÊN LIỆU Các nguồn thu nhận alginate lyase 2.1 Alginate lyase từ rong biển 2.2 Alginate lyase từ động vật thân mềm biển 2.3 Alginate lyase từ vi sinh vật Chương QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ TINH SẠCH LYASES PECTIN TỪ B.PUMILUS 10 3.1 Phân lập vi khuẩn 10 3.2 Sản xuất enzyme pectin với trình lên men nuôi cấy rắn 10 3.3 Tinh Enzyme Pectin lyase .11 3.4 Kết luận 12 Chương ỨNG DỤNG 13 Chương TỔNG QUAN 1.1 KHÁI NIỆM Lyases enzym xúc tác phân cắt liên kết CC, CO, CN phương pháp khác cách thủy phân oxy hóa Các liên kết bị phân cắt trình loại bỏ sản phẩm tạo hình thành liên kết đơi vịng Loại enzym khác với enzym khác chỗ hai chất tham gia vào hướng phản ứng, chất tham gia vào hướng phản ứng khác Để tạo liên kết đơi vịng mới, enzyme tác động lên chất đơn phân tử bị loại bỏ Lyases nhìn thấy phản ứng chu trình axit citric (chu trình Krebs) trình đường phân Trong trình đường phân, lyase gọi aldolase xúc tác trình phân tách dễ dàng thuận nghịch fructose 1,6-bisphosphate (F-1,6 BP), thành sản phẩm glyceraldehyde phosphate (GAP) dihydroxyacetone phosphate (DHAP) Đây ví dụ lyase giúp phân cắt liên kết cacbon-cacbon Lyase enzym hỗ trợ phá vỡ liên kết, sau thường dẫn đến việc hình thành liên kết đơi cấu trúc mạch vòng đường xúc tác Những loại phản ứng yêu cầu phân tử phản ứng thuận, cần hai phân tử cho phản ứng nghịch Một ví dụ phản ứng hóa học xúc tác Iyase bước trình đường phân: hình thành phosphoenolpyruvate từ phosphoglycerate, q trình khử nước tham gia để hình thành liên kết đôi (tham khảo sơ đồ Bell trang 427) Phản ứng, ATP> cAMP + PPi xúc tác enzyme lyase 1.2 CÁC PHẢN ỨNG ENZYME LYASES Lớp enzyme lyase Lớp enzyme gồm lớp phụ, xúc tác cho việc phân giải tách khỏi chất nhóm với việc tạo thành liên kết đôi kết hợp với nối đôi Có thể biểu thị sau: Lớp có enzyme tác động vào liên kết C - C, C-O, C-N, C-S, C-Halogen Pyruvat decarboxylase xúc tác cho phản ứng loại CO2 khỏi phân tử Pyruvic acid, tạo thành aldehyde tương ứng acetaldehyde Coenzyme thiamine pyrophosphase Enzyme có mối quan hệ chặt chẽ với pyruvat dehydrogenase Fumarathydratase xúc tác cho phản ứng tách thuận nghịch phân tử H2O khỏi malic acid, tạo thành fumaric acid (có nối đơi) 1.3 PHÂN LOẠI Lyase phân loại EC phân loại số EC enzym Lyases phân loại thành bảy lớp con: EC 4.1: Lyases carbon carbon Bao gồm dung dịch kiềm phân cắt liên kết carbon-carbon, chẳng hạn decarboxylase (EC 4.1.1), aldehyde lyases (EC 4.1.2), dung dịch axit oxo (EC 4.1.3) loại khác (EC 4.1.99) Trong kiểu phân tách này, hợp chất sở hữu decarboxylase (aldehyde lyase), xúc tác phản ứng ngưng tụ aldol ngược lại Do đó, lyase oxy axit xúc tác sau phân cắt axit hydroxy EC 4.2: Lyases carbon-oxy Bao gồm dung dịch kiềm phân cắt liên kết cacbon-oxy, chẳng hạn chất khử nước Trong trường hợp (EC 4.2.1): Hydrolyases ,điều cách loại bỏ nước ; phân lớp phụ (EC 4.2.2): Hoạt động Polysaccharid, (EC 4.2.3): Hoạt động phốt phát, (EC 4.2.99): Các khí carbon-oxy khác.Trong kiểu phân cắt này, liên kết carbon-oxy bị phân cắt Bằng cách loại bỏ, phân tử nước từ hydrolyase hoàn thành Điều thực cách loại bỏ rượu nhóm phốt phát EC 4.3: Lyases cacbon-nito Bao gồm dung dịch kiềm phân cắt liên kết cacbon- nito, chẳng hạn (EC 4.3): Lyases cacbon-nito, (EC 4.3.1): Amoniac-Lyases, (EC 4.3.2): Amidine-Lyases, (EC 4.3.3): Amine-Lyases, (EC 4.3.99): Các khí cacbon-nitơ khác.Trong loại enzym này, amoniac giải phóng để đồng thời tiếp tục tạo thành vịng liên kết đơi Một vài loại enzym xúc tác cách loại bỏ amit nhóm amin, ví dụ : -CH-CH(-NH-R) ->C=CH- + NH2-R EC 4.4: Lyases cacbon-lưu huỳnh Bao gồm dung dịch kiềm phân cắt liên kết cacbon-lưu huỳnh.Trong loại enzym này, trình loại bỏ thay dihydrogen sulfide diễn EC 4.5: Lyases carbon Halide Bao gồm lyaza phân cắt liên kết cacbon -halogenua.Trong enzyme này, có chế sử dụng HCI loại bỏ khỏi dichloro-diphenyl trichloroethane, loại thuốc trừ sâu tổng hợp EC 4.6: Phospho-oxy Lyases Bao gồm dung dịch kiềm phân cắt liên kết phốt pho-oxy, chẳng hạn adenylate cyclase guanylate cyclase.Trong loại này, enzyme loại bỏ nhóm diphosphate khỏi ATP EC 4.99: Bao gồm lyase khác, chẳng hạn ferrochelatase Chương NGUỒN NGUYÊN LIỆU Các nguồn thu nhận alginate lyase Hình: Các nguồn thu nhận alginate lyase khác 2.1 Alginate lyase từ rong biển Ở rong biển, năm 1973 tác giả Madgwich cs phát dịch chiết rong Laminaria digitata có chứa enzyme alginate lyase Tiếp năm 1978 tác giả tìm alginate lyase có rong Pelvetia canaliculata Một nghiên cứu alginate lyase rong Undaria pinnatifida công bố hai tác giả Watanabe Nisizawa vào năm 1982 Tác giả Shiraiwa cs công bố hoạt tính enzyme alginate lyase lồi rong khác Các tác giả nhận thấy hoạt tính enzyme khác tùy theo mùa tùy theo phần rong lấy mẫu Ở mô tế bào rong già cho hoạt tính enzyme cao tế bào rong non ngồi hoạt tính cao mùa rong phóng bào tử Alginate lyase từ rong biển đóng vai trị q trình chuyển hóa alginate vách tế bào rong Mặc dù cơng bố alginate lyase từ rong biển cịn nhƣng dẫn chứng khoa học chứng tỏ vài loài rong biển có chứa alginate lyase với mức độ khác 2.2 Alginate lyase từ động vật thân mềm biển Alginate lyase có nguồn gốc từ động vật thân mềm biển đƣợc phát nhiều loài Trong dịch tiêu hóa động vật khơng xương sống biển bào ngư, sị điệp, nhím biển … có chứa nhiều loại enzyme phân cắt polysaccharide có rong biển thuộc chế độ ăn chúng nhƣ cellulose, alginate, mannan, laminarin … giúp cho việc tiêu hóa chất dinh dưỡng rong dễ dàng Các oligosaccharide monosaccharide tạo từ trình phân cắt hấp thụ trực tiếp động vật thân mềm gián tiếp thơng qua q trình lên men vi khuẩn đường ruột, cung cấp nguồn cacbon lượng cho động vật thân mềm biển Alginate lyase giới động vật thân mềm biển phát vào năm 1968 từ gan tụy hai loài bào ngư Haliotis rufescens H corrugate Một số loài bào ngư khác nhiều tác giả cơng bố có chứa alginate lyase dịch tiêu hóa H tuberculata H.discus hannai H iris Bên cạnh bào ngư, ốc thỏ biển đối tượng có khả sinh tổng hợp alginate lyase phong phú loài Dolabella auricular, Aplysia depilans, A californica A.kurodai Nhiều loài ốc biển có kích thước nhỏ lồi Littorina sp, Omphalius rusticus Littorina brevicula nghiên cứu có chứa alginate lyase Ngồi lớp hai mảnh vỏ, hoạt tính enzyme alginate lyase cịn phát có sợi thủy tinh thể lồi Choromytilus meridionalis, Perna perna, Spisula solidissima 2.3 Alginate lyase từ vi sinh vật Vi khuẩn biển, vi khuẩn đất nấm cơng bố có chứa alginate lyase Agarivorans sp, Pseudomonas fluorescens, Streptomyces sp,Vibrio sp, Alginovibrio aquatilis, Alteromonas sp, Azotobacter vinelandii,Bacillus circulans, Dendryphiella salina, Enterobactercloacae, Flavobacterium multivorum, Klebsiella aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa Ochrobactrum sp, ….Hầu hết vi sinh vật có khả sử dụng monomer đơn vị mannuronate guluronate từ trình phân giải alginate nguồn cacbon nguồn lượng Vi sinh vật biển vi sinh vật đất có chứa nhiều loại alginate lyase cho việc phân giải alginate có cấu trúc phức tạp Đặc biệt vài loài Pseudomonas Azotobacter vừa sinh enzyme alginate lyase, vừa tổng hợp alginate Việc xác định phân bố alginate lyase sinh giới tiếp diễn Đến có 50 enzyme alginate lyase đặc hiệu với chất đa dạng tách chiết từ nhiều nguồn khác Chương QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ TINH SẠCH LYASES PECTIN TỪ B.PUMILUS 3.1 Phân lập vi khuẩn Trong nghiên cứu này, cà chua từ chợ địa phương sử dụng để phân lập vi sinh vật 10 g / mL mẫu thực từ mẫu làm việc điều kiện vơ trùng, đồng với dung dịch pha loãng thu hồi tối đa 90 mL cách sử dụng thiết bị đồng hóa Stomacher Các dung dịch pha loãng nối tiếp từ 10^-1 đến 10^-8 chuẩn bị cách sử dụng dung dịch pha loãng thu hồi tối đa chuẩn bị Thạch dinh dưỡng rải từ độ pha lỗng sau ủ 34 ° C 48 Môi trường thạch dinh dưỡng lấy từ khuẩn lạc điển hình phát triển sau ủ, việc lập biểu đồ thực cách vẽ pha Điều tiếp tục thu khuẩn lạc tinh khiết Sau đó, khuẩn lạc tinh chế chuyển vào môi trường dinh dưỡng có chứa dung dịch glycerol 20% Sau đó, bảo quản - 80 ° C môi trường nuôi cấy dự trữ 3.2 Sản xuất enzyme pectin với q trình lên men ni cấy rắn Để sản xuất enzyme vi sinh vật, phương pháp lên men nuôi cấy rắn sử dụng Môi trường riêng biệt chuẩn bị cách thêm lượng pectin khác vào 250 mL bình (pectin ED 85% -93%) gam cám 10 ml dung dịch ((0,14% (NH4) 2SO4 0,2% KH2PO4 0,02% MgSO4) Sau đó, mơi trường chuẩn bị khử trùng nồi hấp 121 ° C 20 phút Vi khuẩn cấy vào môi trường sau khử trùng ủ ngày nhiệt độ 34 ° C Sau ủ, thêm 60 ml nước khử ion với 0,9% NaCl vào môi trường trộn máy khuấy từ để enzyme PL chuyển sang pha dung dịch Phần phía (mơi trường tăng trưởng) chất kết tủa (cám + vi sinh vật) tách cách ly tâm 10.000 x g (20 phút ° C) Hoạt tính PL xác định protein thực (chiết xuất tinh khiết) bề mặt 3.3 Tinh Enzyme Pectin lyase Được tinh chế phương pháp TPP ba bước từ B pumilus thời gian Trong bước đầu tiên, giá trị hoạt động tối đa enzyme pectin lyase xác định theo tỷ lệ 1: 0,5 (chiết xuất: n-butanol) Trong bước thứ hai, nồng độ n-butanol tối ưu, độ bão hòa amoni sulfat thứ thực từ 20% đến 80% Hoạt động cao thu 60% Trong bước thứ ba Độ bão hòa amoni sulfat lần thực tỷ lệ n-butanol tối ưu 1: 0,5 nồng độ amoni sulfat 65-75%, hoạt độ cao xác định tỷ lệ 75% amoni sulfat Việc lọc thực điều kiện Sử dụng phương pháp TPP, enzyme PL từ vi khuẩn B pumilus tinh với suất 78,2% 191,8 lần Trong nghiên cứu khác, Pectin lyases kiềm tính thu từ vi khuẩn Aspergillus flavus MTCC 7589 cách sử dụng phương pháp sắc ký truyền thống (sắc ký lọc gel Sephadex G-100) báo cáo tinh 58,01 lần Pectin lyases ngoại bào enzyme tạo vi khuẩn B pumilus (P9) q trình lên men ni cấy rắn báo cáo tinh 36,36 lần cách sử dụng sắc ký cột trao đổi anion DEAE-cellulose Pectin Lyases ngoại bào vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus Ah22 tạo môi trường lên men nuôi cấy rắn tinh 40,8 lần sắc ký cột trao đổi anion DEAE-cellulose Trong thí nghiệm, tert-butanol thêm vào mơi trường có mặt amoni sulfat, kỹ thuật phân vùng ba pha (TPP) sử dụng để tinh 10 chế enzym pectinase từ Aspergillus niger cà chua, Theo kết nghiên cứu Hiệu suất 76%, lọc gấp 10 lần suất 183%, lần tinh đạt từ nấm Aspergillus niger cà chua Phân tích SDS-PAGE thực để xác định số lượng tiểu đơn vị enzyme PL tinh chế từ B pumilus, dải đơn mức 32,88 kDa quan sát Trọng lượng phân tử enzyme PL tinh khiết kiểm sốt sắc ký lọc gel (Hình 3) Enzyme Pectin lyase từ vi khuẩn B pumilux (P9), Aspergillus flavus MTCC 7589, Penicillum chrysogenum sản xuất tinh kỹ thuật sắc ký trao đổi ion, theo kết SDS-PAGE; trọng lượng phân tử enzym xác định 25 kDa, 38 kDa 31 kDa 3.4 Kết luận Enzyme vi sinh vật sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp khác sản lượng cao, tính ổn định cao lợi kinh tế Enzyme pectin lyase, nằm nhóm enzyme hydrolase thương mại chiếm 70% thị phần công nghiệp, sử dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm Trong nghiên cứu này, gen 16S-RRNA vùng đệm liên gen 16S-23S rRNA (ISR) xác định phương pháp phân tích trình tự 11 phân lập từ rau cà chua, người ta xác định vi khuẩn thuộc loài B pumilus phát có độ giống 99% Việc sản xuất ngoại bào enzyme PL đạt môi trường nuôi cấy rắn với vi khuẩn B pumilus, lần enzyme PL tinh chế cách sử dụng kỹ thuật TPP với suất cao Trong trình cố định isoenzyme PL tinh khiết, lần hNF-PL tổng hợp đặc trưng phương pháp gel hóa ionotropic Trong giai đoạn cuối nghiên cứu, sử dụng enzyme hNF-PL tự hNF-PL, số loại nước trái làm rõ, enzyme PL lai phát có hiệu quả, làm tăng suất so với enzyme PL tự Tính ổn định hiệu cao hNF-PL cho diện tích bề mặt cấu trúc lớn Về mặt này, cấu trúc hNF-PL coi phù hợp để sử dụng hệ thống enzyme khác nhau, lĩnh vực công nghiệp khác nhau, đặc biệt ngành cơng nghiệp thực phẩm, mà khơng có ức chế Chương ỨNG DỤNG Enzyme sử dụng để xúc tác trình biến đổi sinh học thay cho axit bazơ gây hại cho môi trường Một lĩnh vực mà chúng sử dụng chiết xuất pectin từ chất thải, vỏ cam, chanh chanh sau chiết xuất nước trái cây; nguồn giàu pectin, sản phẩm có giá trị cao - Nếu đọc nhãn sản phẩm, thấy pectin chất tạo gel thực phẩm, sản phẩm chăm sóc sức khỏe mỹ phẩm Pectin lyases ứng dụng Chế biến rau quả: Được sử dụng enzyme nghiền để tăng suất nước trái cây, giảm độ nhớt nước ép nước trái để dễ dàng chế 12 biến sau; làm giảm độ nhớt bột nhuyễn tránh vấn đề tạo bọt q trình đặc Chiết xuất thực vật: Phân hủy tế bào thực vật để giải phóng thành phần đích vận hành trơn tru trình chiết xuất tinh chế, đồng thời cải thiện tính ổn định chế phẩm chiết xuất thực vật dạng lỏng Rượu vang rượu táo: Cải thiện sản lượng nước trái màu sắc ổn định thời hạn sử dụng sản phẩm 13 ... Chương QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ TINH SẠCH LYASES PECTIN TỪ B. PUMILUS 3.1 Phân lập vi khuẩn Trong nghiên cứu này, cà chua từ chợ địa phương sử dụng để phân lập vi sinh vật 10 g / mL mẫu thực từ mẫu... thực (chiết xuất tinh khiết) b? ?? mặt 3.3 Tinh Enzyme Pectin lyase Được tinh chế phương pháp TPP ba b? ?ớc từ B pumilus thời gian Trong b? ?ớc đầu tiên, giá trị hoạt động tối đa enzyme pectin lyase... số EC enzym Lyases phân loại thành b? ??y lớp con: EC 4.1: Lyases carbon carbon Bao gồm dung dịch kiềm phân cắt liên kết carbon-carbon, chẳng hạn decarboxylase (EC 4.1.1), aldehyde lyases (EC 4.1.2),