Đánh giá biểu hiện Phenoloxidase của tôm khi nhiễm vi khuẩn Vibrio Campbellii.pdf

ĐẠI HOC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ BIẺU HIỆN PHENOLOXIDASE CỦA TÔM KHI NHIỄM VI KHUẲN VIBRIO CAMPBELLII Sinh viên thực : Nguyền Anh Kiệt Mã số sinh viên : 1311519025 GVHD : ThS Nguyền Trung Hiếu ThS Lê Thị Thùy Trang TP HCM, 2019 ĐẠI HOC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ BIẺU HIỆN PHENOLOXIDASE CỦA TÔM KHI NHIỄM VI KHUẲN VIBRIO CAMPBELLII Sinh viên thực : Nguyễn Anh Kiệt Mã số sinh viên : 1311519025 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Trung Hiếu ThS Lê Thị Thùy Trang TP HCM, 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỀN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CỘNG HÒA XÀ HÒI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc - -oOo - NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Họ tên: Nguyền Anh Kiệt MSSV: 1311519025 Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Lóp: 13DSH02 Đầu đề luận văn: Đánh giá biểu phenoloxidase tôm nhiễm vi khuan phenoloxidase Mục tiêu So sánh mức độ biểu phenoloxidase tôm sú tôm thẻ chân trắng Nội dung: - Khảo sát độc lực chủng vi khuẩn V campbeỉlỉi tôm sú tôm thẻ chân trăng - Xác định yêu tố anh hưởng đến hoạt tính enzyme phenoloxidase - Khảo sát tỷ lệ biểu gen ProPO2 tôm sú tôm thẻ chân trắng Thời gian thực hiện: tháng 04/2019 đến tháng 09/2019 Người hướng dẫn chính: ThS Nguyễn Trung Hiếu Người hướng dần phụ: ThS Lê Thị Thùy Trang Nội dung yêu cầu KLTN thông qua Bộ môn TP HCM, ngày thảng năm 2019 Bộ MÔN (Ký ghi rõ họ tên) CÁN Bộ HƯỚNG DẲN (Ký ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Th.s Nguyễn Trung Hiếu tận tính hướng dần truyền đạt cho em kiến thức quý báu giúp em thực hoàn thành luận văn Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến anh chị đặc biệt Th.s Lê Thị Thùy Trang phịng Vi sinh - Mơi trường thuộc Trạm thủy sản An Nghĩa, cần Giờ tạo điều kiện cho em thực hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn tất quí thầy cô Khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Nguyễn Tất Thành đă tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em kiến thức quí báu suốt thời gian theo học trường Con xin cảm ơn bố mẹ - người sinh thành, nuôi nấng, ùng hộ động viên cho suốt trình học tập Anh cảm ơn em, người bên cạnh chia sẻ, động viên anh vượt qua khó khăn sống (Sinh viên ký tên) Nguyễn Anh Kiệt Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii TÓM TẮT V SUMMARY vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG BIẾU viiỉ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix ĐẶT VẤN ĐỀ X CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh Vibrio campbelli tôm 1.1.1 Bệnh đốm trắng White Spotsyndrome Virus (WSSV) 1.1.2 Bệnh phân trắng (WSD) 1.1.3 Hội chứng chết sớm tôm 1.2 Tổng quan hệ thống Prophenoloxidase tôm 1.2.1 Hệ thống Prophenoloxidase 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Phenoloxidase tôm CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nơi thực 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nuôi tôm điều kiện nuôi .7 2.3.2 Nuôi vi khuân 2.3.3 Tiêm thu máu tôm 2.3.4 Xác định hàm lượng protein ii 2.3.5 Xác định hoạt tính enzyme phenoloxidase 10 2.3.6 Ly trích bảo quản mRNA 10 2.3.7 Tổng hợp cDNA 11 2.3.8 Khuếch đại cDNA PCR 12 2.3.9 Định luợng tương đối phenoloxidase bang realtime - PCR SYBR Green 13 2.4 Bố trí thí nghiệm 16 2.4.1 Kiểm tra độc lực chủng vi khuẩn V campbellii 16 2.4.2 Tối ưu hóa phương pháp xác định hoạt tính enzyme phenoloxidase 16 2.4.3 Đánh giá mức độ biếu gen mã hóa phenoloxidase 16 2.4.3.1 Đánh giá mức độ biểu prophenoloxidase tôm sú 16 2.4.3.2 Đánh giá mức độ biểu prophenoloxidase tôm thẻ 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Kết kiểm tra độc lực chùng vi khuẩn V campbeỉlii 18 3.1.1 Kết kiểm tra độc lực V campbellii tôm sú 18 3.1.2 Ket kiểm tra độc lực V campbellii tôm thẻ chân trắng 19 3.2 Ket xác định hoạt tính enzyme phenoloxidase 20 3.2.1 Đánh giá ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzym phenoloxidase với L - DOPA 2,0 mM 20 3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng nồng độ L - DOPA lên hoạt tính enzym phenoloxidase pH = 7,0 21 3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng thời gian lên hoạt tính cùa enzym phenoloxidase sau 24 48 pH = 7,0 nồng độ L - DOPA = 2,0 22 3.3 Ket khảo sát nhiệt độ lai 23 3.3.1 Kết tổng hợp cDNA 23 3.3.2 Hiệu khuếch đại primer EF - la, PO2 - LV PO2 - PM nhiệt độ lai 60°C 24 3.4 Ket đánh giá tỷ lệ biếu gen ProPO2 25 iii 3.4.1 Kết khảo sát hoạt tính enzyme phenoloxidase thời điểm lấy mầu 30, 60, 90 120 phút tiêm V campbelliỉ (105 CFU/tôm) tôm sú 25 3.4.2 Kết đánh giá tỷ lệ biểu gen ProPO2 tôm sú 25 3.4.3 Kết khảo sát hoạt tính enzyme phenoloxidase thời điểm lấy mẫu 30, 60, 90 120 phút tiêm V campbellii (105 CFU/tôm) tôm thẻ chân trắng 27 3.4.4 Ket tỷ lệ biếu gen ProPO2 tôm thẻ chân trắng 28 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC 32 IV TĨM TẤT Tơm lồi thủy sản ưa chương có giá trị kinh tế cao, nhiên, gia tăng diện tích ni, đa dạng hóa đối tượng ni dẫn đến lây lan dịch bệnh nguy Đe tài “Đánh giá biểu phenoloxidase tôm nhiễm vi khuẩn Vibrio catnpbelliF thực từ thảng 04/2019 đến 09/2019 phịng Vi sinh - Mơi trường thuộc Trạm thủy sản An Nghĩa, cần Giờ với mục tiêu so sánh mức độ biếu phenoloxidase tôm sú tôm thẻ chân trắng Đe tài có ba nội dung: Đánh giá độc lực chủng vi khuẩn Vibrio campbellii lên tôm sú tôm thẻ chân trắng; Tối ưu phương pháp xác định hoạt tính enzym phenoloxidase so sánh mức độ biểu mRNA mã hóa prophenoloxidase hoạt tính phenoloxidase gây nhiễm Vibrio campbellii lên tơm sú tôm thẻ chân trắng Những kết thu thời gian thực đề Tôm sú tơm thẻ chân trắng có the đề kháng tốt với nồng độ Vibrio campbelliỉ 105 CFU Khả kháng bệnh tôm thẻ chân trắng tốt so với tơm sú Hoạt tính enzyme phenoloxidase bị ảnh hưởng yêu tố: thời gian, nồng độ chất L - DOPA pH môi trường Enzyme phenoloxidase sè hoạt động tốt với nong độ chat L - DOPA mM, pH môi trường = 7,0 24 Lượng enzyme phenoloxidase tăng đáng kể thời diem 120 phút tiêm V campbellỉỉ Tỷ lệ biểu gen ProPO2 tôm thẻ chân trắng cao so với tôm sú V SUMMARY Shrimp is a popular and high economic value fishery However the increase in farming area and diversification of species lead to the spread of dangerous diseases The study “Assessment of phenoloxidase expression of shrimp when infected with V campbellii” was conducted from April 2019 to September 2019 in the Microbiology laboratory of An Nghia Fisheries Station, Can Gio with the objective of comparing phenoloxidase expression levels in black tiger shrimp and whiteleg shrimp The topic has three contents: Assessing virulence of Vibrio campbellii on black tiger shrimp and whiteleg shrimp; Optimize the method of determining the activity of phenoloxidase enzyme; Comparing the level of expression of mRNA encoding prophenoloxidase and phenoloxidase activity when infecting V campbellii on black tiger shrimp and whiteleg shrimp The results obtained during the implementation of the study: Black tiger shrimp and whiteleg shrimp can be resistant to Vibrio campbellii 105 CFU The resistance of whiteleg shrimp is better than black tiger shrimp Phenoloxidase activity is affected by the following factors: time, substrate concentration of L - DOPA and environmental pH The enzyme phenoloxidase will work best with substrate concentration of L - DOPA mM, environmental pH = 7.0 in 24 hours The amount of enzyme phenoloxidase increased significantly at 120 minutes when injected V campbellii ProPO2 gene expression rate in whiteleg shrimp is higher than that of black tiger shrimp vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Đốm trắng xuất vỏ đầu ức tôm Hình 1.2 Đường ruột tơm bị hư hại Hình 1.3 Gan tơm bình thường (A) gan tơm bị nhiễm bệnh (B) Hình 2.1 Nước xử lý trước cho tôm vào nuôi Hình 2.2 Tơm nuôi be composite Hình 2.3 Vị trí thu máu tơm (A), vị trí tiêm vi khuan (B) Hình 2.4 Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme phenoloxidase cuvette 1,5 mL Hình 3.1 Đồ thị biếu thí nghiệm độc lực V campbellii tơm sú 17 Hình 3.2 Đồ thị biếu thí nghiệm độc lực V campbellii tôm thẻ chân trắng 18 Hình 3.3 Đồ thị kết thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzyme phenoloxidase 19 Hình 3.4 Đồ thị kết thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nồng độ L - DOPA lên hoạt tính enzyme phenoloxidase 20 Hình 3.5 Đồ thị kết thí nghiệm đánh giá thời gian lên hoạt tính enzyme phenoloxidase 21 Hình 3.6 Kết điện di gel agarose 1,5%, 100mA, 25 phút 22 Hình 3.7 Ket khảo sát hoạt tính enzyme phenoloxidase tơm sú 24 Hình 3.8 Ket khảo sát hoạt tính enzyme phenoloxidase tơm thẻ chân trắng 26 vii ... văn: Đánh giá biểu phenoloxidase tôm nhiễm vi khuan phenoloxidase Mục tiêu So sánh mức độ biểu phenoloxidase tôm sú tôm thẻ chân trắng Nội dung: - Khảo sát độc lực chủng vi khuẩn V campbeỉlỉi tôm. .. NGHIỆP ĐÁNH GIÁ BIẺU HIỆN PHENOLOXIDASE CỦA TÔM KHI NHIỄM VI KHUẲN VIBRIO CAMPBELLII Sinh vi? ?n thực : Nguyễn Anh Kiệt Mã số sinh vi? ?n : 1311519025 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giảng vi? ?n hướng... enzyme phenoloxidase 16 2.4.3 Đánh giá mức độ biếu gen mã hóa phenoloxidase 16 2.4.3.1 Đánh giá mức độ biểu prophenoloxidase tôm sú 16 2.4.3.2 Đánh giá mức độ biểu prophenoloxidase tôm