Phân lập phân đoạn có tính kháng khuẩn từ xạ khuẩn.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH ĐINH THỊ LAN LINH PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN CĨ TÍNH KHÁNG KHN TỪ XẠ KHN Chun ngành: Quản lý cung ứng thuốc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược ĐẠI HỌC Hướng dẫn khoa học: ThS Nguyễn Thị Ngọc Yen TP.HCM - NĂM 2019 LỜI CẢM ƠN Đe khóa luận đạt kết tốt đẹp, em nhận nhiều hồ trợ, giúp đỡ từ nhà trường, giảng viên bạn bè Với tất chân thành, cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất người tạo điều kiện giúp đờ em khoảng thời gian nghiên cứu đề tài Đặc biệt gửi lời cám ơn tới ThS Nguyễn Thị Ngọc Yen, hướng dẫn giúp em có hội học hỏi nhiều kiến thức bổ ích Cũng quan tâm tận tình ln chia sẻ chân thành giúp em hồn thiện thân nhiều Xin cảm ơn Trường Đại học Nguyễn Tất Thành môn Vi sinh - Ký sinh trùng tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian qua Cũng xin chân thành gửi lời cám ơn đến thầy ThS Phan Cảnh Trình thầy Dương Đình Chung giúp đỡ em suốt trình thực khóa luận Khơng the khơng nhắc tới gia đình người bạn tiếp thêm động lực cho em khoảng thời gian để em hoàn thành đe tài tốt Với điều kiện thời gian kinh nghiệm hạn chế sinh viên, khóa luận khơng the tránh thiếu sót Rất mong nhận bảo, đóng góp ý kiến thầy để em bổ sung, nâng cao kiến thức mình, phục vụ tốt công tác thực tế sau Xin chân thành cám ơn! LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác SINH VIÊN sv ĐINH THỊ LAN LINH MỤC LỤC Trang LỜI CAM ƠN LỜI CAM ĐOA MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH V DANH MỤC BẢNG vi TÓM TẮT vii ĐẶT VÁN ĐÈ CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỐNG QUAN XẠ KHUÂN 1.2 PHÂN LOẠI XẠ KHUẦN 1.3 VAI TRÒ CỦA XẠ KHUÁN 1.3.1 Vai trò xạ khuẩn tự nhiên 1.3.2 Vai trò xạ khuẩn công nghiệp ngành dược 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN cứu XẠ KHUẨN 1.4.1 Ngoài nước 1.4.2 Trong nước 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT 1.5.1 Phương pháp đường vạch đối kháng 1.5.2 Phương pháp thỏi thạch 1.5.3 Phương pháp giếng khuếch tán 1.6 XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIÊM HÌNH THÁI, SINH LÝ VÀ SINH HĨA CỦA XẠ KHƯÁN 10 1.6.1 Đặc điểm hình thái 10 1.6.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa 10 1.7 LÊN MEN THU KHÁNG SINH 14 1.7.1 Môi trường lên men 14 1.7.2 Khảo sát thời điểm thu hoạch dịch lên men 14 1.7.3 Tách chiết phân đoạn có hoạt tính 15 1.7.4 Hiện hình sinh học dịch chiết có hoạt tính 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 17 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ NGUYÊN LIỆU 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Vi sinh vật thử nghiệm 17 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 17 2.1.4 Hóa chất mơi trường 18 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 18 2.2.1 Xác định đặc điếm hình thái, sinh lý sinh hóa 19 2.2.2 Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật 22 2.2.3 Giải trình tự gen 16S rDNA 22 2.2.4 Khảo sát môi trường lên men thu kháng sinh 23 2.2.5 Xác định thời điếm thu dịch nuôi cấy 23 2.2.6 Khảo sát dung môi chiết chất kháng sinh 23 2.2.7 Khảo sát phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn 24 2.2.8 Phân lập phân đoạn có hoạt tính sinh học từ dịch ni cấy 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 ii 3.1 KẾT QUẢ 26 3.1.1 Xác định đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa 26 3.1.2 Sàng lọc chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh 33 3.1.3 Định danh giải trình tự gen 16S rDNA 35 3.1.4 Khảo sát môi trường lên men thu kháng sinh 37 3.1.5 Khảo sát dung môi chiết chất kháng sinh 38 3.1.6 Khảo sát phân đoạn có hoạt tính kháng vi sinh vật 39 3.1.7 Phân lập phân đoạn có hoạt tính sinh học từ dịch ni cấy 41 3.2 BÀN LUẬN 44 3.2.1 Đặc diem hình thái, sinh lý sinh hóa xạ khuân 44 3.2.2 Sàng lọc chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn 45 3.2.3 Khảo sát điều kiện chiết chất kháng khuẩn 45 3.2.4 Phân lập chất có hoạt tính sinh học từ dịch nuôi cấy .45 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 4.1 KẾT LUẬN 47 4.2 ĐỀ NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHAO Phụ lục Thành phần môi trường PL1 Phụ lục Đặc điểm hình thái môi trường PL2 Phụ lục Hoạt tính kháng khuẩn mơi trường ISP PL3 Phụ lục Hoạt tính kháng khuẩn mơi trường YIM 61 PL4 Phụ lục Hoạt tính kháng khuẩn chủng ST03 môi trường ISP2 PL5 Phụ lục Kết kiểm tra độ tinh khiết HPLC F6 PL6 Phụ lục Bài báo nghiên cứu khoa học PL7 iii DANH MỤC CÁC CHỮ VII T TÁT Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt STT Từ viết tắt ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic ATCC American type culture collection BMVKST EA ISP KTCC Khuẩn ty chất KTKS Khuẩn ty khí sinh MHA 10 MIC 11 MRSA 12 MSSA 13 Chủng vi sinh vật chuẩn Hoa Kỳ Bộ môn Vi sinh - Ký sinh trùng Ethyl acetate Ethyl acetat International Streptomyces Chương trình phân loại xạ Project khuân Quốc tế Muller Hinton Agar Minimum inhibitory Thạch Muller Hinton Nồng độ ức chế tối thiếu concentration Methicillin resistant Tụ cầu đề kháng Staphylococcus aureus methicillin Methicillin susceptible Tụ cầu nhạy cảm Staphylococcus aureus methicillin PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại gen 14 Pseu Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 15 sc 17 Strep Streptococcus pyogenes 18 TCA Trichloroacetic 19 TSA Tryptic Soy Agar Môi trường tinh bột - Starch casein Agar casein Streptococcus faecalis Thạch TSB iv DANH MỤC HÌNH • Hình 1.1 Đặc điếm hình thái bào tử [30] Hình 1.2 Sự sinh bào tử nang bào tử [30] Hình 1.3 Vịng đời sinh bào tử xạ khuẩn [7] Hình 1.4 Các kháng sinh sản xuất xạ khuẩn [5] Hình 2.1 So đồ bố trí thí nghiệm 19 Hình 3.1 Hình thái hiển vi sau nhuộm Gram chủng CNC05 ST03 29 Hình 3.2 Các phản ứng dương tính chủng CNC05 (ở trên) ST03 (ở dưới) 33 Hình 3.3 Ket sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn chủng CNC05 ST03 số chủng vi khuẩn thử nghiệm 35 Hình 3.4 Đường kính vịng kháng khuẩn loại dịch chiết 39 Hình 3.5 Sắc ký đồ dịch chiết EA cùa chủng CNC05 với hệ dung mơi có NH4OH (bên trái) khơng có NH4OH (bên phải) 40 Hình 3.6 Thử nghiệm hình sinh học vết sắc ký chủng CNC05 40 Hình 3.7 Sac ký đồ dịch chiết EA chủng ST03 với hệ dung môi có NH4OH (bên trái) khơng có NH4OH (bên phải) 41 Hình 3.8 Thử nghiệm hình sinh học vết sắc ký chủng ST03 41 Hình 3.9 Khả kháng khuân cao ethyl acetat phân đoạn F6 có hoạt tính sinh học .42 Hình 3.10 Sắc ký đồ cùa phân đoạn F6 43 Hình 3.11 Phổ 3D phân đoạn F6 44 V DANH MỤC BẢNG • Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật dùng thử nghiệm 17 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn môi trường 27 Bảng 3.3 Khả tạo sắc tố chủng xạ khuẩn 28 Bảng 3.4 Nhiệt độ pH tăng trưởng tối ưu 30 Bảng 3.5 Nồng độ muối tăng trưởng tối ưu 30 Bảng 3.6 Sử dụng nguồn nitơ .31 Bảng 3.7 Phản ứng đơng tụ pepton hóa sữa 32 Bảng 3.8 Thử nghiệm khả sản xuất enzym sản phẩm trao đổi chất 33 Bảng 3.9 Hoạt tính kháng vi sinh vật cùa chủng xạ khuẩn 34 Bảng 3.10 So sánh đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng CNC05 ST03 với số chủng xạ khuấn [4], [41] 36 Bảng 3.11 Đường kính vịng kháng khuẩn ISP2 YIM61 chùng CNC05 37 Bảng 3.12 Đường kính vịng kháng khuẩn ISP2 chủng ST03 38 Bảng 3.13 Chương trình gradient rửa giải cột HPLC 43 VI TÓM TẤT KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC sĩ ĐẠI HỌC - NÀM HỌC 2018 - 2019 Phân lập phân đoạn có tính kháng khuẩn tù’ xạ khuẩn ĐINH THỊ LAN LINH Hướng dẫn khoa học: ThS Nguyễn Thị Ngọc Yen Mở đầu Các vi khuấn nhóm Actinobacteria từ lâu biết đến với khả sản xuất kháng sinh đa dạng Tuy nhiên, nguồn chat co dien từ đất vườn, đất đồng ruộng nghiên cứu nhiều; ngày giới hạn khám phá chủng loài mới, kháng sinh Trong nghiên cứu này, tiến hành mẫu thu thập từ khu vực ô nhiễm quanh khu công nghiệp áp lực chọn lọc biến chủng có tiềm Đối tượng phương pháp nghiên cứu Các chùng xạ khuẩn phân lập từ mẫu đất lấy từ khu vực ô nhiễm Thành phố Hồ Chí Minh Bình Dương (kế thừa kết đề tài trước đó) sàng lọc hoạt tính sinh học phương pháp thịi thạch Xác định đặc điếm hình thái, sinh lý, sinh hóa định danh sinh học phân tử (đoi với chủng hoạt tính cao) Khảo sát yếu tố mơi trường, điều kiện nuôi cấy thời diêm thu hoạch chùng xạ khuẩn hoạt tính cao phương pháp giếng khuếch tán Chiết tách phân đoạn có tính kháng khuẩn phương pháp sắc ký lóp mỏng, tự sinh đồ, sắc ký cột HPLC Kết Đe tài sàng lọc 12 chủng xạ khuẩn khác nhau, xác định đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa, đặc biệt sau sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật phương pháp thỏi thạch tuyển chọn chủng CNC05 ST03 có hoạt tính kháng khuẩn cao nên tiếp tục định danh giải trình tự gen 16S rDNA Xác định yếu tố môi trường, điều kiện nuôi cấy thời điểm thu hoạch chủng CNC05 ST03 phương pháp giếng khuếch tán Chiết tách thu phân đoạn đơn chất từ cao chiết ethyl acetat toàn phần qua sắc ký cột Kiểm tra độ tinh khiết phương pháp HPLC Ket luận Chủng xạ khuẩn CNC05 lên men cho lượng kháng sinh cao môi trường ISP2 Qua khảo sát cho thấy ethyl acetat dung môi chiết tốt chất kháng khuân từ xạ khuẩn Hoạt chất từ phân đoạn xác định qua phương pháp hình sinh học trực tiếp sắc ký lóp mỏng Xác định phân đoạn chứa chất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh từ cao ethyl acetat chủng CNC05, với độ tinh khiết 90% Từ khóa: xạ khuân, hoạt tính khảng khuẩn, lên men, cao chiết etyl acetat, sắc ký cột vii ... trên, tiến hành sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn nghiên cứu tiềm sản xuất chất kháng vi sinh vật từ chủng phân lập Đe tài ? ?Phân lập phân đoạn có tính kháng khuấn từ xạ khuẩn? ?? tiến hành với mục tiêu... xạ khuẩn thành nhóm khác Ví dụ theo mơi trường sống có loại xạ khuẩn ưa nhiệt, xạ khuẩn acid, xạ khuẩn ưa muối, xạ khuẩn nội sinh thực vật, xạ khuẩn cộng sinh, xạ khuẩn nội cộng sinh, xạ khuẩn. .. chiết tốt chất kháng khuân từ xạ khuẩn Hoạt chất từ phân đoạn xác định qua phương pháp hình sinh học trực tiếp sắc ký lóp mỏng Xác định phân đoạn chứa chất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh từ cao ethyl