Nghiên cứu điều khiển ra hoa in vitro cây sống đời (Kalanchoe blossfeldiana) .pdf

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỀN TẤT THÀNH ——oOo BÁO CÁO TÔNG KẾT ĐÈ TÀI CHƯNG TRÌNH SINH VIÊN NCKH NĂM 2017 - 2018 TÊN ĐÈ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐIỀU KHIÈN RA HOA IN VITRO CÂY SỐNG ĐỜI (Kalanchoe blossfeldiana) Mã số đề tài : 2017.02.29 Chủ nhiệm đề tài : NGUYỄN THỊ THƯ NHÃ MSSV : 1411533021 Lớp : 14DSH01 Giảng viên hướng dẫn Khoa : ThS NGUYỄN THỊ NHÃ : CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG TP Hồ Chí Minh, thảng 05 năm 2018 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, sơ Đồ, HÌNH ẢNH iv Chương TỐNG QUAN 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Tạo hoa in vitro ứng dụng .2 1.3.1 Các vấn đề tạo hoa ỉn vitro 1.3.2 Các chế ảnh hưởng .3 1.3.2.1 Ảnh hưởng auxin va cytokinin 1.3.2.3 Ảnh hương khoáng đến cảm ứng hoa 1.3.2.4 Ảnh hưởng nitơ chế cảm ứng hoa 1.3.3 Khả ứng dụng thực tiễn 1.3.4 Tình hình nghiên cứu nước 1.3.5 Tình hình nghiên cứu giới Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 2.2 NỘĨ dung nghiên cứu 2.3 Hóa chất, thiết bị dụng cụ 2.3.1 Hóa chất .7 2.3.3 Dụng cụ 2.4 Phương pháp nghiên cứu bố trí thí nghiệm 2.4.1 Vật liệu nghiên cứu 2.4.2 Phương pháp tạo vật liệu in vitro ban đầu 2.4.3 Thí nghiệm 1: Tạo đa chồi sống đời in vitro i 2-4.4-Thí nghiệm 2: Xác định mơi trường thích hợp cho sinh trưởng chồi sống đời in vitro 2.4.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng khoáng đến cảm ứng hoa Sống đời in vitro 10 2.4.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hương nitơ đến cảm ứng hoa sống đời in vitro 10 2.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm xử lý so liệu 11 2.5.1 Bố trí thí nghiệm 11 2.5.2 Chỉ tiêu theo dõi 11 2.6 Thu thập xử lý số liệu 12 Chương KẾT QUÀ VÀ SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC 13 3.1 Ket tạo nguồn sống đời in vitro 13 3.1.1 Tạo đa chồi sống đời in vitro 13 3.1.2 Khảo sát mơi trường thích họp cho sinh trưởng phát triển chồi sống đời in vitro 15 3.2 Ket khảo sát môi trường, điều kiện hoa sống đời in vitro 18 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng khoáng cảm ứng hoa sống đời in vitro 18 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nitơ đến hình thành hoa sống đời in vitro 20 Chương KẾT LUẬN 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 PHỤ LỤC 28 ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT NAA a-Naphtyl acetic acid BA Benzyl adenyl MS Murashige & Skoog atm atmosphere 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid IBA IndoleButyric Acid IAA 3-IndoleAcetic Acid ga3 Gibberellic Acid TDZ 1,2,3 Thiadiazol-5-yl iii DANH MỤC CÁC BẢNG BIÉU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH Hình 3.1 Hình thái mầu tạo từ đoạn thân in vitro mơi trường thí nghiệm điều hòa sinh trưởng 17 Hình 3.2 Hình thái mẫu tạo từ in vitro mơi trường thí nghiệm chất điều hịa sinh trưởng 17 Hình 3.3 Hình thái sống đời môi trường nuôi cấy bổ sung chất hữu 20 Hình 3.4 Kích thước sống đời in vitro môi trường nuôi cấybố sung chất hữu 20 Hình 3.5 Mầu sống đời có nguồn gốc từ mơi trường nhân chồi BA NAA mơi trường có hàm lượng khoáng thay đối sau 10 tuần 22 Hình 3.6 Mầu sống đời có nguồn gốc từ mơi trường nhân chồi BA mơi trường có hàm lượng khống thay đổi sau 10 tuần 23 Hình 3.7 Mầu sống đời có nguồn gốc từ mơi trường nhân chồi BA NAA môi trường MS thay đổi thành phần nitơ sau 10 tuần 25 Hình 3.8 Mầu sống đời có nguồn gốc từ môi trường nhân chồi BA môi trường MS thay đổi thành phần nitơ sau 10 tuần 25 Hình 3.9 Sự hình thành hoa sống đời 26 Bảng 2.1: Danh mục hóa chất sử dụng nghiên cứu 10 Bảng 2.2: Danh mục thiết bị dùng nghiên cứu 11 Bảng 2.3: Danh mục dụng cụ sử dụng nghiên cứu 11 Bảng 3.1: Khảo sát số mơi trường ni cấy có khả tạo đa choi Song đời in vitro 16 Bảng 3.2: Khảo sát mơi trường thích hợp sinh trưởng phát triển chồi sống đời in vitro 19 Bảng 3.3: Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng khoáng cảm ứng hoa sống đời in vitro 22 Bảng 3.4: Khảo sát ảnh hưởng nitơ đen tỷ lệ hoa sống đời in vitro 24 IV Chương TỐNG QUAN 1.1 Tính cấp thiết đề tài Hoa Sống đời rat biến giới với nhiều chủng loại màu sắc khác nhau, chúng có sức sống bền bỉ thích hợp trồng nhiều nơi sống đời văn hóa người Việt loài mang ý nghĩa trường tồn, ben chặt, vừng chãi, không xuất nơi cơng sở, hàng qn bình hoa để bàn trang trí mà chúng cịn lồi hoa thường diện bàn thờ to tiên ngày lề tết với hy vọng năm phồn thịnh, gắn kết, lâu bền tên gọi mà người ta ưu đặt cho chúng Với ưa chuộng người chơi hoa, sống đời mang lại nhiều lợi nhuận cho người trồng thời gian sinh trưởng ngắn, nhân giống dề dàng, tốn cơng sức sâu bệnh Bên cạnh sống đời cịn có giá trị dược liệu vốn sử dụng nhân gian đe chừa nhiều loại bệnh Trên giới, nghiên cứu hoạt tính có tác dụng chữa bệnh, từ lâu sống đời sử dụng loại mơ hình ni cấy mô thực vật Neu tự nhiên trồng dề mắc bệnh, gây nhiều cản trở cho công tác nhân giống, ni cấy mơ, thời gian có the tạo hàng nghìn, hàng triệu vần giữ đặt tính cùa mẹ mà tạo hoàn toàn bệnh, chất lượng đong đều, rút ngắn thời gian chọn, tạo, lai giống Hiện tại, đa số loài phổ biến nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô, nhân giống với số lượng lớn mang lại lợi nhuận cao Ngồi mục đích nhân giống, nhà khoa học ngày ứng dụng phương pháp để chuyển gen, tạo đột biến, nhân sinh khối tách chiết dược liệu Đặc biệt, tìm hiếu chế hoa ỉn vitro lĩnh vực thu hút quan tâm nhà khoa học, nhằm ứng dụng vào thực tiền, tạo xu hướng cho nhu cầu thưởng ngoạn hoa Vì chậu hoa ngồi tự nhiên thường có kích thước lớn, tốn cơng chăm sóc, vệ sinh chậu hoa, hoa giả trang trí khơng có sức sống, cịn với bình hoa in vitro, ta hồn tồn nhìn sống sinh sơi, màu sắc tự nhiên rực rỡ loài hoa bình kín, nhiều người ngạc nhiên thực vật vần hình thành sống mà khơng có liên hệ với mơi trường ngồi Đe góp phần làm sáng tở chế cảm ứng hoa thực vật nói chung sống đời nói riêng, vai trị cùa yếu tố tham gia điều khiến trình hoa in vitro quang chu kỳ, chất điều hòa sinh trưởng, dinh dưỡng, đề tài: “Nghiên cứu điều khiển hoa in vitro Song đời (Kalanchoe blossfeldiana)” tiên hành 1.2 Mục • tiêu đề tài Tạo nguồn sống đời in vitro Khảo sát môi trường, điều kiện hoa sống đời in vitro 1.3 Tạo hoa in vitro ứng dụng 1.3.1 Các vấn đề tạo hoa in vitro Đất nước ngày đà cơng nghiệp hóa, đại hóa dần đến khơng gian sống thu hẹp, diện tích trồng trọt giảm dần, trình thị hóa ngày mở rộng Do thị hiếu người tiêu dùng thích loại hoa cảnh nhỏ làm xanh không gian sống, gần gũi với thiên nhiên mà khơng chiếm nhiều diện tích Các chậu hoa có kích cỡ nhỏ ưa chuộng khơng gian văn phịng, chung cư, hàng qn nhỏ hẹp, q tặng nhiều ý nghía Sự biến đoi khí hậu trái đất năm gần khiến cho thời tiết thất thường, ảnh hưởng đến nguồn cung cấp cho thị trường hoa Một số nghiên cứu điều khiển hoa in vitro tiến hành nhằm khắc phục phụ thuộc với yếu tố thời tiết Một bình hoa in vitro giải pháp bù đắp số khuyết điểm hoa ngồi tự nhiên, q trình sản xuất người tự điều khiển mơi trường sống hoa theo ý muốn tránh sâu bệnh hại Các nghiên cứu tiến hành ngồi nước chửng minh hoa in vitro hình thành yếu tố tác động vào bên thực vật như: chất điều hòa sinh trưởng, hàm lượng dinh dưỡng hai yếu tố ngoại cảnh nghiên cứu đầy đủ nhiệt độ quang chu kì Đây trình phức tạp, yếu tố di truyền bên nhân tố quan trọng định hình thành hoa Bổ sung nguồn carbonhydrate môi trường nuôi cay in vitro cho kết tích cực đến kích thích, cảm ứng hình thành hoa số như: Momordica charantia [1], Wahlenbergia stricta [2] Trên đối tượng sống đời, Học viện Nông nghiệp Việt Nam thành công việc cảm ứng hoa in vitro nhờ tác động đến hàm lượng dinh dưỡng mật độ nuôi cấy [3] Đặc biệt, việc điều khiển hoa theo phương pháp sè cung cấp vật liệu thí nghiệm cho nghiên cứu thụ phấn in vitro, góp phần đánh giá sớm đặc tính hoa, rút ngắn chu kỳ sinh sản loài cảm ứng hoa dài hạn lan, chủ động trình chọn tạo, lai giống hình thành hạt D Chao Praya Smile [4] D Madame Thong-In [5] Tuy nhiên, sản phẩm chưa phổ biến, số lượng nghiên cứu cịn chưa làm rõ chế hoa mồi lồi hoa có chế cảm ứng khác nhau, phải kết họp nhiều yếu tố đe có the điều khiến hoa in vitro 1.3.2 Các chế ảnh hưởng 1.3.2.1 Anh hưởng auxin va cytokinin Auxin: có vai trị kích thích tăng trưởng kéo dài tế bào, khởi đầu phân chia tế bào nên sử dụng kết hợp với cytokinin đe tạo mơ sẹo, bên cạnh auxin cịn kích thích phân tán tế bào tạo dịch huyền phù phát sinh phôi Cytokinin: cần thiết cho phân chia tế bào chúng điều hịa sinh tồng hợp protein tế bào Nên auxin có tác động làm giảm tượng ưu the tạo chồi bất định, tăng sinh chồi bên 1.3.2.2 Anh hưởng môi trường bo sung chất hữu Đe chuyển sang giai đoạn hoa phải trưởng thành tích lũy đủ dường chất nên cần thời gian môi trường giàu dinh dưỡng thích họp cho phát triển Các nghiên cứu cho thấy, bổ sung họp chất hữu vào môi trường nuôi cấy, tỷ lệ tái sinh cây, hệ số nhân chồi cao hẳn môi trường không bổ sung chất [21] [22] 1.3.2.3 Anh hưởng khoảng đến cám ứng hoa Khoáng đa lượng nguyên tố quan trọng cấu tạo nên chất hữu không the thiếu tế bào Nitơ, lưu huỳnh, photpho đóng vai trị cấu tạo amino acid, protein, enzyme vận chuyển lượng, cấu trúc màng Kali có vai trị điều hịa pH áp suất thấm thấu mơi trường nội bào, magie cần thiết cho sinh tổng họp diệp lục tố Các chất cung cấp đầy đủ môi trường MS giàu dinh dường, lượng khoáng giảm, với việc tăng mật độ dẫn đến cạnh tranh chất dinh dưỡng, nước, ánh sáng tương tự điều kiện in vivo [22, 23] nguyên nhân gây stress chết cho Các stress phi sinh học chứng minh ảnh hưởng đến hoa số cây, tác động có tính đặc thù cho lồi Một vài nghiên cứu sinh thái quần thể sống điều kiện khắc nghiệt hoa sớm (Aronson cs, 1992) [3] 1.3.2.4 Anh hưởng nitơ che cảm ứng hoa Nitơ thành phần quan trọng sinh tổng hợp chất DNA, diệp lục, protein, ATP nguyên liệu cho phân chia tế bào Neu thiếu, giảm nguồn nitơ cần thiết, bị stress Biểu chồi đỉnh, nơi thường xuyên xảy q trình khử nitrat thành nitrit để hấp thụ 1.3.3 Khả ứng dụng thực tiễn - Úng dụng nhân giong in vitro - Tạo bình hoa in vitro có giá trị thương mại khắc phục điểm yếu chậu hoa tự nhiên 1.3.4 Tình hình nghiên cứu nước Đen thời điếm tại, Việt Nam có lồi đưa vào nghiên cứu hoa in vitro thành công, với điều kiện cảm ứng hoa khác Năm 2015, Nguyền Thị Phương Thảo nghiên cứu nhân nhanh cảm ứng hoa in vito hồng cơm sử dụng yếu tố AgNƠ3, C0CI2 Ket cho thấy hoa nở ống nghiệm với tỷ lệ 50% 20% [6] Dương Tấn Nhựt thử nghiệm với hai yếu tố hàm lượng dinh dưỡng quang chu kì hai đối tượng sống đời Torenia fournieri, dần đến hình thành hoa ỉn vitro Trong nghiên cứu Dương Tấn Nhựt, chồi Torenia fournieri nuôi cấy môi trường */4 MS bổ sung thêm 60 g/1 succrose, g/1 than hoạt tính, khơng có chất điều hịa sinh trưởng, với chu kì chiếu sáng 10/14 chiếu sáng cho tỷ lệ hoa cao 87,18% với 2,8 nụ hoa/mẫu cấy [7], Qua nghiên cứu cho thấy điều kiện hoa in vitro loài hoa khác Nghiên cứu Nguyền Thanh Hải cho thấy, loài khác màu sắc hình thái hoa (giống), điều kiện cảm ứng hoa hồn tồn khác [3] Điều khẳng định yếu tố di truyền có vai trị quan trọng việc cảm ứng hoa 1.3.5 Tình hình nghiên cứu giới Trên giới, nghiên cứu hoa in vitro vấn đề khoa học quan tâm từ sớm Từ năm 1973, nhà khoa học Marie Tran Thanh Van có nghiên cứu yếu tố cảm ứng hoa in vitro, trở thành tiền đề sở cho nghiên cứu sau [8] Yeu tố gây cảm ứng hoa thường sử dụng chất điều hịa sinh trưởng bên cạnh có kết hợp với yếu tố khác như: Nhiệt độ, ánh sáng, đường, pH, chất hữu Các yếu tố loài khác gây ảnh hưởng khác việc cảm ứng hoa ỉn vitro Sử dụng môi tường MS bô sung 2,22 pM BA + 2,32 pM kinetin + 0,54 pM NAA nồng độ 2,22 pM BA + 4,65 pM kinetin 12h chiếu sáng/ngày cảm ứng hoa thành cơng lồi Rauvolfia serpentina [9] Lồi N Tabacum hoa in vitro tốt điều kiện có IBA/kinetin, 3% succrose, ánh sáng [8, 10] Với loài Dendrobỉutn moniliforme, nụ hoa tạo thành MS bổ sung 0,05 mg/1 TDZ 0,04 mg/1 PBZ + 1,0 mg/1 ABA 90 ngày, sau chuyển sang mơi trường MS bổ sung 1,0 mg/1 PBZ + 0,1 mg/1 TDZ để hoa nở với nhiệt độ 25 °C, 12 chiếu sáng, tỷ lệ hoa 93,3% [11] Đe hoa in vitro lồi Rosa hybrida, mơi trường thích hợp có tổ họp chất điều hịa sinh trưởng 3,0 mg/1 BA 0,1 mg/1 NAA 50 g/1 succrose Tăng tỷ lệ KNƠ3, NH4NO3 tăng KH2PO4 môi trường MS, hay tạo biên độ nhiệt ngày/đêm 28/20 °C ảnh hưởng đến cảm ứng hoa [12] Bên cạnh có nhừng lồi cảm ứng hoa khơng cần chất điều hịa sinh trưởng lồi Cichoriitm intybus cần điều kiện tối [13]; loài Heỉianthus annuus hoa điều kiện ánh sáng dài ngày [14]; cường độ ánh sáng ni cấy thấp kích thích tạo hoa với loài Odontoglossum sp., Odontonia sp [10], Riêng với Sống đời, nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoa in vitro nghiên cứu chất điều hòa sinh trưởng, hàm lượng dinh dường, quang chu kì [15, 16], hay phối hợp quang chu kì, nhiệt độ, mật độ thông lượng photon, yếu tố giống [17], Cây sống đời ngắn ngày nên việc cảm ứng hoa phụ thuộc nhiều vào thời gian chiếu sáng, có nhiều nghiên cứu điều khiển hoa loại môi trường in vitro [15, 17] in vivo [18, 19] cho thấy có hình ... chu kỳ, chất điều hòa sinh trưởng, dinh dưỡng, đề tài: ? ?Nghiên cứu điều khiển hoa in vitro Song đời (Kalanchoe blossfeldiana)? ?? tiên hành 1.2 Mục • tiêu đề tài Tạo nguồn sống đời in vitro Khảo sát... trường, điều kiện hoa sống đời in vitro 18 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng khoáng cảm ứng hoa sống đời in vitro 18 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nitơ đến hình thành hoa sống đời in vitro. .. 3.1 Ket tạo nguồn sống đời in vitro 13 3.1.1 Tạo đa chồi sống đời in vitro 13 3.1.2 Khảo sát mơi trường thích họp cho sinh trưởng phát triển chồi sống đời in vitro