Công nghệ sinh học & Giống trồng PHÂN LẬP Phytophthora capsici VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU BỆNH CHẾT NHANH CỦA MỘT SỐ GIỐNG HỒ TIÊU TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM Mai Hải Châu, Trần Thị Hương Trường Đại học Lâm nghiệp - Phân hiệu Đồng Nai https://doi.Org/10.55250/jo.vnuf.2022.4.003-011 TÓM TẮT Hồ tiêu (Piper nigrum L.) trồng xuất quan trọng Việt Nam Các mặt hàng hạt tiêu Việt Nam xuất chiếm 58% sản lượng tiêu xuất giới Tuy nhiên, sản lượng tiêu Việt Nam phải đối phó với vấn đề dịch bệnh, đặc biệt bệnh chết nhanh Phytophthora capsici gây Từ 50 mẫu đất vùng rễ hồ tiêu có biêu bệnh chêt nhanh thu thập huyện Câm Mỹ, Vĩnh Cửu tỉnh Đông Nai huyện Châu Đức tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, phân lập dòng p capsici Kêt nghiên cứu cho thấy, dòng p capsici phân lập thể khả gây bệnh chết nhanh hồ tiêu Trong đó, dịng có ký hiệu M1V7 KL phân lập từ mẫu đất vùng rễ hồ tiêu bị bệnh thu thập vùng trồng hồ tiêu huyện Châu Đức tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu có khả gây bệnh cao Sau lây nhiễm động bào tử p capsici (M1V7 KL) giống hồ tiêu Srilanka, tiêu Vĩnh Linh tiêu Trâu điều kiện phịng thí nghiệm nhà lưới, giống tiêu Trâu thể khả chống chịu bệnh p capsici cao với tỷ lệ bệnh chi số bệnh thấp giống tham gia thí nghiệm Từ khóa: Chống chịu, lây nhiễm, Phytophthora capsici, Piper nỉgrum L Đ Ả T V Ẩ N ĐÊ Hồ tiêu đen (Pỉper nỉgrum L.), với danh hiệu "vua gia vị", loại nho có hoa thuộc họ Piperaceae có nguồn gốc từ bờ biển Malabar Nam Ấn Độ (Nazeem et al., 2008) Tại Việt Nam, hồ tiêu trồng chủ yếu tỉnh ừọng điểm, với tổng diện tích 100.000 Mặc dù diện tích hồ tiêu chiếm 2,5% tổng số triệu trồng công nghiệp lâu năm giá trị xuất đạt khoảng 7.000 USD/ha, gấp 2,6 lần cà phê, lần chè, 3,8 lần điều lần cao su (Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam, 2014) Tuy nhiên, ngành trồng hồ tiêu nước ta đứng trước thách thức to lớn từ thiên tai dịch bệnh Bệnh chết nhanh nấm Phytophthora capsỉcỉ gây thiệt hại nghiêm trọng tất vùng trồng tiêu Việt Nam giới Ở Việt Nam, số vùng chuyên canh hồ tiêu, dịch bệnh phát triển thành ổ dịch, có nơi tỷ lệ gây hại đến 100%, làm giảm diện tích canh tác cách đáng kể (Bui & Le, 2013) Tác nhân gây bệnh ừên hồ tiêu sống đất, công vào tất phận rễ, thân, (Nazeem et al., 2008) Do việc nghiên cứu nhằm tìm biện pháp để quản lý bệnh giảm thiệt hại hồ tiêu cần thiết Nghiên cứu thực nhằm phân lập p capsici gây bệnh chết nhanh xác định khả chống chịu bệnh p capsỉci hồ tiêu Kết nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng nguồn gây bệnh khả chống chịu bệnh chết nhanh số giống hồ tiêu trồng phổ biến Việt Nam, sở để nhà quản lý đưa biện pháp phù hợp quản lý bệnh hại hồ tiêu PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu 50 mẫu đất vùng rễ hồ tiêu bị bệnh chết nhanh thu thập từ huyện Cẩm Mỹ, Vĩnh Cửu tỉnh Đồng Nai huyện Châu Đức tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu; ba giống tiêu gồm Vĩnh Linh, Trâu Srilanka 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thu thập mẫu bệnh Mầu bệnh đất vùng rễ hồ tiêu thu cách mặt đất 0,5 - 15 cm vườn hồ tiêu tuổi, có biểu bệnh chết nhanh héo rũ phần hay toàn với màu xanh tái, xuất đốm nâu đen lá, rụng đốt phần thân non, rễ thối đen mềm nhũn, mạch dẫn bên ưong thân biến màu từ trắng TẠP • CHÍ KHOA HỌC • VÀ CƠNG NGHỆ• LÂM NGHIỆP • SỐ - 2022 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng sang nâu đen chạy dọc theo thân (Bui & khoanh hệ sợi có đường kính mm rìa mép Le, 2013) Các mẫu bệnh bảo quản thùng lạnh (dưới 10°C) phân lập 24 Danh sách nguồn mẫu bệnh thu thập để cấy vào đĩa petri (đường kính 90 mm) có chứa 15 ml dung dịch CR 20% ủ điều kiện tổi 27°c để kích thích hình thành bào tử Thay dung dịch khống nước cất vô trùng ủ 10°c 30 phút để kích thích phóng bào tử động phân lập Phytophthora trình bày Bảng 2.2.2 Phân lập Phytophthora từ mẫu thu thập Mẫu đất (50 g) cho vào hộp nhựa, sau thêm 100 ml nước cất vơ trùng Đặt tiêu trưởng thành khơng có vết bệnh lên bề mặt ủ nhiệt độ 27 - 30°c Sau - ngày, với vết loét đặc trưng bệnh chết nhanh rửa vịi nước, thấm khơ giấy lọc, khử khuẩn bề mặt ethanol 70%, rửa lại nước cất vơ trùng, cắt thành mẫu có kích thước 0,5 cm2 đặt lên môi trường chọn lọc (thạch), ủ tối nhiệt độ 25 - 30°c quan sát kính hiển vi sau - ngày (Ngun, 2008) Chọn dịng p capsici có hệ sợi màu trắng co cụm lại tạo hình hoa (Zhijun et al., 2007) ừên đĩa thạch để cấy chuyền sang môi trường CR 20% (120 g cà rốt, g CaCƠ 1000 ml nước cất), ủ tối 28°c 48 Sau đó, loại bỏ dung dịch CR 20%, thay nước cất hấp khử trùng ni sáng 36 - 48 để kích thích hình thành túi bào tử Quan sát hình dạng kích thước túi bào tử, hình dạng kích thước nuốm, cành sinh bao tử, lỗ phóng thích bao tử, xuất túi trương phồng chlamydopore kính hiển vi phóng đại X I0 X40 để định danh p capsỉcỉ (Ho et al., 1995) Khả gây bệnh chết nhanh hồ tiêu dòng nấm phân lập xác định phương pháp lây nhiễm nhân tạo Dịng nấm có khả gây bệnh cao sử dụng cho thí nghiệm 2.2.3 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo Chuẩn bị dịch động bào tử: Các dòng p capsici phân lập cấy môi trường CRA (cà rốt agar) ủ nhiệt độ phịng Khi đường kính hệ sợi đạt - cm lấy 10 Lây nhiễm: Mỗi giống hồ tiêu chọn 27 lá, dùng kim tiệt trùng tạo vết thương nhẹ bề mặt Nhỏ 40 pl dịch động bào tử p capsicỉ chuẩn bị lên vết thương quan sát vết bệnh xuất Các tiêu theo dõi gồm: (1) Thời gian xuất vết bệnh: tính từ lây nhiễm đến có vết bệnh màu nâu đen xuất (2) Tỉ lệ bệnh (%) = (số bị bệnh/tổng số thí nghiệm) X 100 (3) Chỉ số bệnh (%) = P{[(N1 X 1) + (N2 X 3) + + (Nn X n)]/N X n} X 100 Trong đó: N tổng số thí nghiệm; N l, N2, , Nn số bị bệnh cấp 1, 3, 5, n Các cấp bệnh bảng phân cấp mức độ bệnh gồm: cấp không bị bệnh, cấp 10% diện tích bị bệnh, cấp có 10 - 20% diện tích bị bệnh, cấp 20 30% diện tích bị bệnh, cấp cỏ 30 - 40% diện tích bị bệnh cấp 40% diện tích bị bệnh (Q CV N 01172:2014/ BNNPTNT) 2.2.4 Đánh giả khả chống chịu p capsicì m ột số giống hồ tiêu điều kiện th í nghiệm Trong điều kiện phịng thí nghiệm hồ tiêu khơng có biểu bệnh cắt từ hồ tiêu khỏe mạnh trồng nhà lưới thuộc giống gồm Vĩnh Linh, Trâu, Srilanka Các rửa với nước khử khuẩn bề mặt ethanol 70%, 30 giây, sau rửa lại nước cất vơ trùng để khơ giấy thấm Sau đó, lây TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2022 Công nghệ sinh học & Giống trồng nhiễm nhân tạo với dịch động bào tử p capsỉcỉ ủ 25°c phòng thí nghiệm Thí nghiệm lặp lại lần, lần lặp lại gồm 30 hồ tiêu Trong nhà lưới, chọn hồ tiêu không biểu bệnh gồm giống tiêu Vĩnh Linh, tiêu Trâu, tiêu Srilanka có từ - đếm từ lên Phun dung dịch động bào tử p capsici ướt lên với 25 ml/chậu Che kín tủi nilong thời gian từ - Thí nghiệm bố trí nhà lưới theo kiểu khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD) với lần lặp lại, lần lặp lại 30 chậu, chậu hom Ghi nhận thời gian xuất vết bệnh, tỉ lệ bệnh số bệnh 2.2.5 P hương p h p x lý sổ liệu Số liệu xử Microsoữ Excel 2010 trắc nghiệm phân hạng Duncan’s chương trình xử lý thống kê SAS 9.1 Bảng Danh sách nguồn mẫu bệnh thu thập đễ phân lập Phytophthora Địa điểm thu thập mẫu bệnh Lâm San, cẩm Mỹ, Đồng Nai Loại mẫu Đất vùng rễ Số lượng mẫu 20 Kỉ hiệu mẫu LSM1V1 LS M2V1 LSM1V2 LS M2V2 LS M1V3 Vĩnh Tân, Vĩnh Cửu, Đồng Nai Đất vùng rễ 15 VTM1V1 VT M2V1 VT M1V2 VT M2V2 VT M1V3 Kim Long, Châu Đức, Bà Rịa - Vũng Tàu Đất vùng rễ 15 KLM1V1 KLM2V1 KL M1V2 KLM2V2 KLM1V3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hương Mai Hải Châu (2022) Ngoài tác 3.1 Phân lập xác định tác nhân gây bệnh nhân Phytophthora sp., hồ tiêu cịn chịu cơng gây hại nấm Fusarium hay chết nhanh hồ tiêu Từ 50 mẫu đất vùng rễ hồ tiêu có triệu tuyến trùng tác nhân có m ột điểm chứng điển hình bệnh chết nhanh thu chung gây vàng lá, thối rễ rụng lá, thập từ vườn tiêu chuyên canh thuộc huyện khó phân biệt Cẩm Mỹ, Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu phân lập Hệ sợi tất dòng p capsicỉ phân lập phù hợp với mơ tả p capsỉcỉ dịng p capsici với hệ sợi có màu mơi trường CRA Le et al (2014) Tản nấm trắng, đường kính từ 20 - 30 mm co cụm lại dịng nấm có dạng hình hoa hồng tạo hình hoa sau ngày ni cấy mơi hình hoa cúc, mép trịn Hệ sợi nấm có trường CRA (Hình 1) màu trắng đục đến ngà, mọc sát thạch Ket nghiên cứu cho thấy tỷ lệ p capsici bung Không xuất Clamỵdospore ừên phân lập đạt tỷ lệ 10% Điều chứng tỏ rễ tiêu có biểu bệnh khơng môi trường lỏng đặc Cănh sinh bào tử dạng đơn dạng bất qui tắc hình thành hên có tác nhân p capsici mà có mơi trường đặc, riêng mơi trường lỏng thể có số tác nhân khác gây triệu cành sinh bào tử có dạng tán dù, đặc chứng tương tự Kết phù hợp với điểm nhận diện quan họng nấm p capsỉcỉ nghiên cứu Bui & Le (2013); Trần Thị TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SĨ - 2022 Công nghệ sinh học