PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV ( monodon baculovirus), WSSV (white spot syndrome virus) và GEN BETA ACTIN TRÊN tôm sú (penaeus monodon)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN VIẾT TỒN PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV ( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN VIẾT TỒN PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV ( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN BÙI THỊ BÍCH HẰNG 2009 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc Bùi Thị Bích Hằng tận tâm hướng dẫn, bảo, cung cấp tài liệu kinh nghiệm giúp tơi hồn thành đề tài Tôi xin chân thành cám ơn tồn thể q thầy cơ, anh chị Bộ mơn Sinh Học Bệnh Thủy Sản – Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp Chân thành cám ơn bạn lớp Bệnh học thủy sản K31 động viên ủng hộ thực đề tài i LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Đề tài thực nhằm phát triển ứng dụng quy trình mPCR phát đồng thời MBV WSSV tơm sú (Penaeus monodon) Sau thực quy trình mPCR (Karlo et al., 2006) với mẫu dương tính với MBV cho kết vị trí 361bp Sau tiếp tục phát triển quy trình mPCR phát đồng thời MBV gen β-actin cho kết hai vạch vị trí 361bp (MBV) 216 (β-actin) Trên sở kết đạt được, thực quy trình mPCR phát MBV WSSV kết cho thấy vạch 1441bp (WSSV) bước 1, đồng thời hai vạch 941bp (WSSV) 361bp (MBV) bước Thực tiếp quy trình phát MBV, WSSV gen β-actin kết hai bước vạch WSSV (1441bp, 941bp) ii LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vii CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình chung tơm 2.1.1 Tình hình ni tơm thới giới 2.1.2 Tình hình Việt Nam 2.2 Tổng quang tình hình dịch bệnh tơm 2.2.1 Trên thới giới 2.2.2 Ở Việt Nam 2.3 Bệnh Monodon Baculovirus (MBV) 2.3.1 Tác nhân gây bệnh 2.3.2 Vật chủ cảm nhiễm 2.3.3 Dấu hiệu bệnh lý 2.3.4 Kiểu lan truyền 2.3.5 Phương pháp chuẩn đoán 2.3.6 Các biện pháp kiểm soát bệnh 10 2.4 Bệnh đốm trắng WSSV 11 2.4.1 Tác nhân gây bệnh 11 2.4.2 Vật chủ cảm nhiễm 11 2.4.3 Dấu hiệu bệnh lý 12 2.4.4 Kiểu lan truyền 12 2.4.5 Phương pháp chuẩn đoán 13 2.4.6 Các biện pháp kiểm soát bệnh 14 2.5.Sơ lược gen β-actin 14 2.6 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) 14 2.6.1 Một số nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 16 2.6.2 Ứng dụng phương pháp PCR Thủy sản 17 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Thời gian địa điễm nghiên cứu 19 3.2 Dụng cụ hóa chất 19 3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 20 3.3.2 Ly trích DNA 20 iii LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 3.3.3 Đo hàm lượng DNA 21 3.3.4 Quy trình PCR phát MBV (Karlo et al.,2006) 21 3.3.5 Phương pháp mPCR phát MBV gen β – actin 22 3.3.6 Phương pháp mPCR phát MBV WSSV 23 3.3.7 Phương pháp mPCR phát MBV, WSSV gen β – actin 25 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Thực quy trình PCR phát MBV (Karlo et al.,2006) 27 4.2 Thực quy trình mPCR phát MBV gen β – actin 29 4.3 Thực quy trình mPCR phát MBV WSSV 31 4.4 Thực quy trình mPCR phát hiệnMBV,WSSVvà β–actin 34 4.5.Ứng dụng quy trình mPCR phát MBV β –actin 36 4.6.Ứng dụng quy trình mPCR phát MBV WSSV 39 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 5.1 Kết luận 40 5.2.Đề xuất 41 iv LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Sản lượng tôm nuôi giới qua số năm (nghìn tấn) (Bộ Thủy Sản số năm 2003) Bảng 2.2: Tình hình ni tôm sú VN qua số năm (Bộ Thủy Sản số năm 2003) Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng qui trình PCR phát MBV (Belcher and Young, 1998) , β-actin (Oanh, 2007), WSSV (OIE, 2006) 20 Bảng 3.4 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình PCR phát MBV 21 Bảng 3.5 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV β – actin 22 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV, WSSV (bước 1) 23 Bảng 3.7 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV, WSSV (bước 2) 24 Bảng 3.8 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV, WSSV β – actin (bước 1) 25 Bảng 3.9 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV, WSSV β – actin (bước 2) 25 Bảng 4.10 Hàm lượng ADN mẫu tôm sú 27 Bảng 4.11 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình PCR phát MBV 28 Bảng 4.12 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV β – actin 30 Bảng 4.13 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV, WSSV (bước 1) 31 Bảng 4.14 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV, WSSV (bước 2) 31 Bảng 4.15 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV, WSSV (bước 2) điều chỉnh 33 Bảng 4.16 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV, WSSV β – actin (bước 1) 35 v LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Bảng 17 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV, WSSV β – actin (bước 2) 35 vi LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Sản lượng tơm sú giới năm 2001 (Bộ Thủy Sản số năm 2003) Hình 2.2 Sản lượng tơm ni tính theo khu vực ( Nguồn tổng cục thống kê, 2008) Hình 2.3: Tơm sú nhiễm bệnh MBV chậm lớn, màu xanh xẫm (Bùi Quang Tề, 2004) Hình 2.4: Tiêu ép mô gan tụy hậu ấu trùng tôm P monodon bị nhiễm MBV nhuôm malachite green (700X) (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001)…… .10 Hình 2.5 Gan tụy tôm sú bị nhiễm MBV, nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004) 10 Hình 2.6 Tơm sú bị bệnh đốm trắng WSSV, có đốm trắng vỏ (Bùi Quang Tề, 2004) 12 Hình 2.7 Tôm sú bị nhiễm đốm trắng, nhân tế bào biểu bị dày trương to vùi màu hồng, mẫu nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004) 13 Hình 4.8 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV 27 Hình 4.9 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV 29 Hình 4.10 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV β – actin 30 Hình 4.11 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV WSSV 32 Hình 4.12 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV WSSV chuẩn hóa 34 Hình 4.13 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV, WSSV β – actin 36 Hình 4.14 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV β – actin 37 Hình 4.15 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV β – actin 38 Hình 4.16 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV WSSV 39 vii LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Việt Nam có diện tích mặt nước lớn, kể nước ngọt, lợ mặn, lợi cho việc phát triển nuôi trồng thủy sản lý dẫn tới thành công ngành thời gian qua Việt Nam trở thành nước nuôi trồng thủy sản lớn thứ 10 nước xuất thủy sản lớn giới Theo thủy sản 2006, sản lượng thủy sản nuôi trồng Việt Nam đạt 1,67 triệu với giá trị xuất đạt 1,7 tỷ USD, tổng kim ngạch xuất thủy sản tồn ngành đạt 3,35 tỷ USD Đồng Sơng Cửu Long có diện tích tự nhiên khoảng 39.747 km2, chiếm 12% diện tích nước Trên thực tế, ni trồng thủy sản (NTTS) ĐBSCL trở thành nghề truyền thống khơng ngừng thay đổi Theo tính tốn, tổng diện tích có khả NTTS ĐBSCL 1.200.000 ha, gần 60% nước Trong đó, diện tích có khả NTTS vùng triều khoảng 750.300 ha, chiếm 26% tổng diện tích đất tự nhiên tỉnh ven biển vùng chiếm 74% tổng diện tích có khả NTTS vùng triều toàn quốc Năm 2006, sản lượng NTTS vùng ĐBSCL đạt khoảng 1.200.000 tấn, 70% sản lượng NTTS toàn quốc Trong Tơm sú (Penaeus monodon) đối tượng thuỷ sản có giá trị thương phẩm cao đối tượng nuôi quan trọng Việt Nam số nước phát triển Châu Á Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Philippines, Việt Nam Nam Mỹ (Ecuador) Nghề ni tơm khơng góp phần lớn làm tăng kim ngạch xuất thủy sản cho nước nêu mà cịn có tác động tích cực đến trình phát triển kinh tế xã hội, cải thiện đời sống cho người nuôi thủy sản Tuy nhiên, nghề ni tơm thâm canh hóa ni với mật độ cao phải đương đầu với tình trạng dịch bệnh bùng nổ ngày thường xun nghiêm trọng suy thối mơi trường lây lan mầm bệnh Đặt biệt bệnh virus tôm sú như: bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus – WSSV), bệnh MBV (monodon baculovirus), bệnh đầu vàng (yellow head virus – YHV),…đã gây thiệt hại nặng nề cho người ni Do đó, việc phát phát sớm bệnh để giảm thiệt hại cho người nuôi, đồng thời nâng cao chất lượng sản lượng tôm nuôi vấn đề quan tâm hàng đầu ngành thủy sản người nuôi tơm Có nhiều phương pháp chẩn đốn bệnh như: phương pháp chẩn đoán truyền thống cách quan sát dấu hiệu bệnh hay phương pháp mơ bệnh học lại khơng cho phép phát sớm xác tác nhân gây bệnh Nhiều phương pháp phân tử lai in situ, western blot, PCR, RT-PCR phát -1- LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com M 500bp 250bp 361bp Hình 4.9 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: đối chứng âm Giếng 2: mẫu bị nhiễm MBV (200 ng/µl) Dựa vào hình 4.9 ta thấy sau điều chỉnh lại chu kỳ nhiệt (tăng nhiệt độ gắn mồi lên 65oC) mẫu đối chứng dương rỏ vạch 361bp (vạch thể có mặt MBV), đối chứng âm không vạch Kết cho thấy chu kỳ nhiệt có ảnh hưởng lớn đến trình sản phẩm khuếch đại Kết cho thấy quy trình sử dụng để phát MBV điều kiện phịng thí nghiệm Đồng thời cho phép ta tiến hành quy trình mPCR phát MBV gen β-actin tôm 4.2 Thực quy trình PCR phát MBV gen β – actin Phương pháp PCR ứng dụng phát triển rộng rãi y học thủy sản Tuy nhiên PCR có nhiều hạn chế, hạn chế PCR tượng âm tính giả thao tác DNA ly trích có chất lượng Để khắc phục tình trạng này, sở qui trình PCR phát MBV qui trình PCR phát gen β-actin (Đặng Thị Hồng Oanh, 2007), quy trình mPCR phát đồng thời MBV gen β – actin thực nhằm kiểm sốt chất lượng AND tơm q trình phát MBV để kiểm sốt trường hợp âm tính giả nâng cao hiệu xét nghiệm - 29 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Bảng 4.12 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV β – actin Hóa chất/dung dịch Nước Dung dịch đệm 10X MgCl2 (25mM) dNTP (10mM) Taq DNA polymerase (5U/ μl) Mồi MBV-361 F (10μM) Mồi MBV-361 R (10μM) Mồi β – actin F (10μM) Mồi β – actin R (10μM) ADN khuôn Tổng Nồng độ 1X 1,5 mM 0,02 mM 1,25 U 0,4 µM 0,4 µM 0,25 µM 0,25 µM 200ng Thể tích 14,85 µl 2,5 µl 1,5 µl 0,5 µl 0,25 µl µl µl 0,625 µl 0,625 µl µl 25 µl Sau thực qui trình mPCR phát đồng thời MBV gen β-actin theo chu kì nhiệt quy trình PCR phát MBV (Karlo et al., 2006 có bổ sung), ta kết sau M 361bp 500bp 250bp 216bp Hình 4.10 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV β – actin Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: đối chứng âm Giếng 2: mẫu bị nhiễm MBV mồi β – actin Kết hình 4.10 cho thấy mẫu đối chứng dương (giếng 2) rỏ vạch vị trí 361bp vạch biểu mẫu có diện MBV vạch vị trí 216 bp vạch biểu có mặt β – actin, đối chứng âm không vạch - 30 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Kết cho thấy ứng dụng quy trình mPCR để phát MBV β – actin , đồng thời kiểm sốt trường hợp âm tính giả chất lượng ADN tơm q trình phát MBV thông qua gen nội sinh β – actin tơm 4.3 Thực qui trình PCR phát MBV WSSV Do khơng có mẫu bị nhiễm hai loại WSSV MBV nên thực phản ứng phải cho mẫu ADN có hai loại vi-rút Ở bước cho ADN vào để tham gia phản ứng khuếch đại ta cho 1µl DNA (200 ng/µl) có chứa WSSV 2µl ADN (200 ng/µl) có chứa MBV Ở bước cho vào µl sản phẩm PCR bước Bảng 4.13 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV, WSSV (bước 1) Hóa chất/dung dịch Nước Dung dịch đệm 10X MgCl2 (25mM) dNTP (10mM) Taq DNA polymerase (5U/ μl) Mồi MBV-361 F (10μM) Mồi MBV-361 R (10μM) Mồi WSSV-146 F1(100μM) Mồi WSSV-146 R1(100μM) ADN khuôn WSSV ADN khuôn MBV Tổng Nồng độ 1X 1,5 mM 0,2mM 0,04 U/μl 0,4 µM 0,4 µM µM µM 200 ng/µl 200 ng/µl Thể tích 32,6 µl µl 3µl µl 0,4 µl 2µl 2µl 0,5 µl 0,5 µl µl µl 50 µl Bảng 4.14 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV, WSSV (bước 2) Hóa chất/dung dịch Nước Dung dịch đệm 10X MgCl2 (25mM) dNTP (10mM) Taq DNA polymerase (5U/ μl) Mồi MBV-361 F (10μM) Mồi MBV-361 R (10μM) Mồi WSSV-146 F2(100μM) Mồi WSSV-146 R2(100μM) Sản phẩm PCR bước Tổng Nồng độ 1X 1,5 mM 0,02 mM 0,04 U/μl 0,4 µM 0,4 µM µM µM Thể tích 30,6 µl µl 3µl 1µl 0,4 µl µl µl 0,5 µl 0,5 µl µl 50 µl - 31 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Điều kiện phản ứng: Trước chuẩn hóa Sau Sau chuẩn hóa 95oC vịng phút 95oC vịng phút 95oC vịng 30 giây Sau 95oC vòng 30 giây 65oC vòng phút 62oC vòng phút 72oC vòng phút 72oC vòng phút Lặp lại chu kỳ 35 lần Lặp lại chu kỳ 35 lần 72oC vòng phút M 72oC vòng phút Hình 4.11 Kết điện di sản phẩm mPCR phát M BV WSSV Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: mẫu đối chứng âm (PCR bước 1) Giếng 2: mẫu dương tính với MBV WSSV (PCR bước 1) Giếng 3: mẫu đối chứng âm (PCR bước 2) Giếng 4: mẫu dương tính với MBV WSSV (PCR bước 2) Thực phản ứng mPCR bảng 4.5 bảng 4.6 Kết chạy mPCR phát WSSV MBV cho thấy bước giếng số vạch vị trí 1441bp (vạch thể có mặt của WSSV) khơng vạch 361bp (vạch thể có mặt của MBV) Ở bước vạch 941 (vạch thể có mặt của WSSV) khơng vạch 361bp Vì - 32 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com cần phải điều thành phần hóa chất bước (cho thêm 2µl ADN 200 ng/µl có chứa MBV) chu kỳ nhiệt (giảm nhiệt độ gắn mồi từ 65 oC xuống 62 oC) để kết tốt Bảng 4.15 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV, WSSV (bước 2) điều chỉnh Hóa chất/dung dịch Nước Dung dịch đệm 10X MgCl2 (25mM) dNTP (10mM) Taq DNA polymerase (5U/ μl) Mồi MBV-361 F (10μM) Mồi MBV-361 R (10μM) Mồi WSSV-146 F2(100μM) Mồi WSSV-146 R2(100μM) Sản phẩm PCR bước DNA khuôn MBV Tổng Nồng độ 1X 1,5 mM 0,02 mM 0,04 U/μl 0,4 µM 0,4 µM µM µM 200ng Thể tích 28,6 µl µl 3µl 1µl 0,4 µl µl µl 0,5 µl 0,5 µl µl µl 50 µl M 1500bp 1000bp 1441bp 941bp 361bp 250bp Hình 4.12 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV WSSV chuẩn hóa Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: mẫu đối chứng âm (PCR bước 1) Giếng 2: mẫu dương tính với MBV WSSV (PCR bước 1) Giếng 3: mẫu đối chứng âm (PCR bước 2) - 33 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Giếng 4: mẫu dương tính với MBV WSSV (PCR bước 2) Dựa vào kết hình 4.12 sau điều chỉnh thành phần hóa chất chu kỳ nhiệt ta thấy bước giếng vạch vị trí 1441bp khơng vạch 361bp Ở bước giếng rỏ hai vạch 941bp (vạch thể có mặt của WSSV) 361bp (vạch thể có mặt của MBV) Đối chứng âm hai bước điều không vạch Điều chứng tỏ ứng dụng quy trình để phát đồng thời hai loại virut MBV WSSV 4.4 Thực quy trình PCR phát MBV - WSSV β – actin Dựa vào kết mục 4.3 qui trình phát MBV, WSSV β – actin thực Các thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng mPCR thực trình bày bảng 4.16 4.17 Bảng 4.16 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV, WSSV β – actin (bước 1) Hóa chất/dung dịch Nước Dung dịch đệm 10X MgCl2 (25mM) dNTP (10mM) Taq DNA polymerase (5U/ μl) Mồi MBV-361 F (10μM) Mồi MBV-361 R (10μM) Mồi WSSV-146 F1(100μM) Mồi WSSV-146 R1(100μM) Mồi β – actin F (10μM) Mồi β – actin R (10μM) DNA khuôn WSSV DNA khuôn MBV Tổng Nồng độ 1X 1,5 mM 0,02 mM 0,04 U/μl 0,4 µM 0,4 µM µM µM 0,25 µM 0,25 µM 200 ng/µl 200 ng/µl Thể tích 30,1 µl µl 3µl 1µl 0,4 µl µl µl 0,5 µl 0,5 µl 1,25 µl 1,25 µl µl µl 50 µl - 34 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Bảng 17 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại quy trình mPCR phát MBV, WSSV β – actin (bước 2) Nồng độ Hóa chất/dung dịch Nước Dung dịch đệm 10X MgCl2 (25mM) dNTP (10mM) Taq DNA polymerase (5U/ μl) Mồi MBV-361 F (10μM) Mồi MBV-361 R (10μM) Mồi WSSV-146 F2(100μM) Mồi WSSV-146 R2(100μM) Mồi β – actin F (10μM) Mồi β – actin R (10μM) Sản phẩm PCR bước ADN khuôn MBV Tổng M 1X 1,5 mM 0,02 mM 0,04 U/μl 0,4 µM 0,4 µM µM µM 0,25 µM 0,25 µM 200 ng/µl Thể tích 26,1 µl µl 3µl 1µl 0,4 µl µl µl 0,5 µl 0,5 µl 1,25 µl 1,25 µl µl µl 50 µl 1650bp 1441bp 1000bp Hình 4.13 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV ,WSSV β – actin Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: mẫu đối chứng âm (PCR bước 1) Giếng 2: mẫu dương tính với MBV, WSSV β – actin (PCR bước 1) Giếng 3: mẫu đối chứng âm (PCR bước 2) Giếng 4: mẫu dương tính với MBV, WSSV β – actin (PCR bước 2) - 35 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Kết hình 4.12 cho thấy bước 1, giếng vạch vị trí 1441bp (vạch thể có mặt của WSSV) khơng vạch 361bp 216bp (vạch thể có mặt của MBV β – actin) Ở bước 2, giếng không vạch Sau nhiều lần điều chỉnh thành phần hóa chất tăng thể tích β – actin lên gấp đơi (1,25 µl lên 2,5 µl) kết giống hình 4.13 bước phát WSSV bước không phát vạch Do thành phần hóa chất thời gian có hạn nên nghiên cứu dừng lại chu trình mPCR phát đồng thời MBV WSSV 4.5 Ứng dụng quy trình mPCR phát MBV β – actin Quy trình mPCR phát MBV β – actin thử nghiệm để xét nghiệm số mẫu tơm giống phịng xét nghiệm giống – Bộ môn sinh học Bệnh Thủy Sản khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ Thực quy trình mPCR phát MBV β – actin mục 4.2 Kết kiểm tra số mẫu tơm giống trình bày hình 4.14 4.15 M 361bp 500bp 250bp 216bp Hình 14 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV β – actin Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: mẫu đối chứng âm Giếng 2: mẫu bị nhiễm MBV mồi β – actin Giếng 3: mẫu (200ng ADN ) Giếng 4: mẫu (200ng ADN) Giếng 5: mẫu (200ng ADN ) - 36 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Giếng 6: mẫu (200ng ADN) Giếng 7: mẫu (200ng ADN) Giếng 8: mẫu (200ng ADN) M 500bp 250bp 361bp 216bp Hình 15 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV β – actin Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: mẫu đối chứng âm Giếng 2: mẫu bị nhiễm MBV mồi β – actin Giếng 3: mẫu (200ng ADN) Giếng 4: mẫu (200ng ADN) Giếng 5: mẫu (200ng ADN) Kết hình 4.14 4.15 cho thấy đối chứng âm không vạch, đối chứng dương vạch vị trí 361bp vạch biểu mẫu có diện MBV vạch vị trí 216 bp vạch biểu có mặt β – actin vị trí 361bp Đối với hình 4.13, mẫu phân tích điều vạch 216bp mẫu giếng giếng không vạch 316bp (mẫu âm tính với MBV), mẫu cịn lại vạch 316bp (mẫu dương tính với MBV) Đối với hình 4.14, mẫu phân tích vạch 216bp khơng vạch 361bp (mẫu âm tính với MBV) Điều chứng tỏ ta áp dụng quy trình để thực phản ứng phát MBV, kiểm soát tượng âm tính giả - 37 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 4.6 Ứng dụng quy trình mPCR phát MBV WSSV Trong trình xét nghiệm số mẫu tơm giống phịng xét nghiệm giống – Bộ môn sinh học Bệnh Thủy Sản khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ phát mẫu vừa nhiễm MBV WSSV dựa vào mục 4.3 thực quy trình phát MBV WSSV M 1500bp 1000bp 750bp 1441bp 941bp 361bp 250bp Hình 16 Kết điện di sản phẩm mPCR phát MBV WSSV Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: mẫu 5/4/2009 (PCR bước 1, 200ng DNA) Giếng 2: mẫu đối chứng âm (PCR bước 1) Giếng 3: mẫu 5/4/2009 (PCR bước 2, 200ng DNA) Giếng 4: mẫu đối chứng âm (PCR bước 2) Kết chạy mPCR phát WSSV MBV cho thấy bước giếng số vạch vị trí 1441bp khơng vạch 361bp Ở bước thể rỏ vạch 941 vạch 361bp Điều chứng tỏ ứng dụng quy trình để phát đồng thời hai loại virut MBV WSSV - 38 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Đã thực thành cơng quy trình: PCR phát MBV (Karlo et al., 2006), sản phẩm PCR cho kết vạch vị trí 361bp với thành phần hoá chất tham gia phản ứng sau: 1X dung dịch đệm, 1,5mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 1.25 U Taq ADN polymerase, 0.4 µM mồi MBV-361F, 0.4µM mồi MBV-361R, 200 ng ADN khuôn, nước cất tiệt trùng Với chu kỳ nhiệt thực phản ứng là: 95ºC phút; 95ºC 30 giây, 65ºC phút, 72ºC phút, lặp lại chu kỳ 35 lần; 72ºC phút mPCR phát MBV β – actin (Karlo et al., 2006 có bổ sung) sản phẩm PCR cho kết vạch vị trí 361bp vạch 216bp với thành phần hố chất tham gia phản ứng sau: 1X dung dịch đệm, 1,5mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 1.25 U Taq ADN polymerase, 0.4 µM mồi MBV361F, 0.4µM mồi MBV-361R, 0,25µM mồi β – actin F, 0,25µM mồi β – actin R, 200 ng ADN khuôn, nước cất tiệt trùng Với chu kỳ nhiệt thực phản ứng là: 95 ºC phút; 95 ºC 30 giây, 65ºC phút, 72 ºC phút, lặp lại chu kỳ 35 lần; 72ºC phút mPCR phát MBV WSSV sản phẩm PCR cho kết vạch 1441bp bước 1, vạch 941bp 361bp bước Với thành phần phản ứng PCR Bước 1: 1X dung dịch đệm, 1,5mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0, 04 U/µM Taq ADN polymerase, 0.4 µM mồi MBV-361F, 0.4µM mồi MBV-361R, µM mồi WSSV R1 , 1µM mồi WSSV F1, 200 ng AND khn WSSV, 400 ng AND khuôn MBV, nước cất tiệt trùng Với chu kỳ nhiệt thực phản ứng là: 95ºC phút; 95ºC 30 giây, 62ºC phút, 72ºC phút, lặp lại chu kỳ 35 lần; 72ºC phút Bước 2: 1X dung dịch đệm, 1,5mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0, 04 U/µM Taq ADN polymerase, 0.4 µM mồi MBV-361F, 0.4µM mồi MBV-361R, µM mồi WSSV R1 , 1µM mồi WSSV F1, 5µl sản phẩm bước 1, 400 ng AND khn MBV, nước cất tiệt trùng Với chu kỳ nhiệt thực phản ứng là: 95ºC phút; 95ºC 30 giây, 62ºC phút, 72ºC phút, lặp lại chu kỳ 35 lần; 72ºC phút - 39 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 5.2 Đề xuất Tiếp tục thực chuẩn hóa quy trình mPCR phát đồng thời MBV, WSSV β – actin Ứng dụng quy trình mPCR phát đồng thời MBV β – actin nhiều mẫu để kiểm tra tính ổn định quy trình để ứng dụng quy trình điều kiện phịng thí nghiệm Cần tối ưu hóa quy trình mPCR phát đồng thời MBV WSSV nhằm tăng khả ứng dụng quy trình - 40 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ thủy sản, 2005 Kết thực kế hoạch năm ngành thủy sản hhtt://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=49&new_ID=6124705 (Ngày truy cập 29/11/2008) Bộ thủy sản, 2006 Vai trò vị trí ngành thủy sản kinh tế quốc dân Ngày 18/1/2006 hhtt://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=181639&new_ID=181707 Bodad-reantaso, Melba G Bondad-Reantaso, Melba G BondadReantaso, Iain East, Rohana P Subasinghe 2001 Asia diagnostic guide to aquatic amiml FAO and NACA Bùi Quang Tề ctv , 2004 Bệnh học thuỷ sản Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp Chanratchakool, P.,D.F Fegan and M.J Phillips 1999 Sumary of Asian national rewiews on management strategies for major disease in shrimp aquaculture In: R.P.Subasinge, J.R Philips and M.B Reantaso (Editors) The matic reweiw management stragies for major disease in shrimp aquaculture Report of a workshop held in Cebu, Phippines from 28-30 November 1999 Page 85-90 Dịch bệnh tôm sú giải pháp khắc phục Ngày 25/06/2008 http://www.vietlinh.com.vn/dbase/VLTTShowContent.asp?ID=3108 Ngày truy cập 29/11/2008 Dịch bệnh tàn phá khắp nơi Ngày 21/5/2008 http://www.thiennhien.net/news/160/ARTICLE/5611/2008-05-21.html Ngày truy cập 29/11/2008 Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007 Giáo trình ngun lý kỹ thuật chuẩn đốn bệnh thủy sản Trường Đại học Cần Thơ FAO, 2004 The state of world fisheries and aquaculture (SOFIA) http://www.fao.org///docrep/007/y600e/ y600e04.htm Accessed on 13 June 2008 10 http://www.vietlinh.com.vn/html/tintue Ngày truy cập 29/11/2008 Thông tin chuyên đề, Bộ Thủy Sản số năm 2003 - 41 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 11 Karlo Dante T Natividad, Maria Veron P Migo, Juan D Albaladejo, Jose Paolo V Magbanua, Nakao Nomura, Masatoshi Matsumura 2006 Simultaneous PCR detection of two shrimp viruses (WSSV and MBV) in postlarvae of enaeus monodon in the Philippines Aquaculture 257 (2006) 142–149 12 Khuất Hữu Thanh, 2003 Cơ sở truyền phân tử kỹ thuật gen NXB khoa học kỹ thuật 13 Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục 14 Thông tin Khoa Học & Công nghệ thủy sản, số 10/2001 Hiện trạng nghề ni tơm giới Trích báo cáo hội thảo bệnh tôm sú Hải Phòng tháng 2/2004 15 Nguyễn Thanh Quang, 2004 Khảo sát tình hình bệnh đốm trắng (White spot disease) tơm sú ni (P monodon) tỉnh Sóc Trăng 16 Nguyễn Văn Hảo 2003 Tình hình dịch bệnh tơm sú nuôi thới giới Việt Nam http://www.longdinh.com/home.asp?act=chitiet&ID=3211&catID=1 17 Nguyễn Văn Hậu, 2006 Xác định tỉ lệ cảm nhiễm WSSV (White spot syndrome virus) MBV (Monodon bacculovirus) tôm sú (Penaeus monodon) giống tỉnh Đồng Bằng Sông Cử Long Luận văn Đại học Trường Đại học Cần Thơ 18 Nguyễn Văn Hảo, 2003 Một số vấn đề kỷ thuật nuôi tôm sú công nghiệp Nhà xuất nông nghiệp TpHCM.210 trang 19 Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2008 Ứng dụng kỷ thuật PCR – genotyping (ORF125) nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) Luận văn tốt nghiệp đại học 20 Sở thủy sản tỉnh Bạc Liêu 2006 Báo cáo “Tổng kết tình hình thực nhiệm vụ 2005 kế hoạch phát triển Thủy sản năm 2006” 21 Lightner, D.V., R.M Redman 1981 A baculovirus-caused diease of the penaeid shrimp, Penaeus monodon Joumal of invertebrate Pathology 38: 299-302 22 Thông tin Khoa Học & Công nghệ thủy sản, số 4/2004 Lê Trọng Tổng quan bệnh virus đốm trắng tôm he (Penaeus) 23 Theo lao đông, ngày 13/03/2003 Tơm chết hàng loạt, ngành thủy sản bó tay hhtt://www.vnexpress.net/Vietnam/KinhdOanh/2003/03/3B9C5D27/ (Ngày truy cập 29/11/2008) - 42 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 24 Tạp chí thủy sản số 2006 25 Trần Thị Mỹ Duyên, 2006 Ứng dụng kỷ thuật PCR – genotyping nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) Luận văn tốt nghiệp đại học 26 Trần Thị Xô Nguyễn Hương Lan 2005 Cơ sở di truyền công nghệ gen Nhà xuất khoa học kỹ thuật 27 Bùi Thị Tuyết Hoa, 2004 Bài giảng sinh học phân tử Trường Đại học Cần Thơ 28 Trần Việt Tiên, 2007 Ứng dụng kỹ thuật PCR RT-PCR chuẩn đoán WSSV (White spot syndrome virus) GAV (Gill-associated virus) tôm sú (Penaeus monodon) Đồng Bằng Sông Cửu Long 29 Trần Nguyên Diễm Tú, 2008 Phát triển quy trình mPCR (multiplex Polymerase Chain Reaction) phát WSSV (White Spot Syndrome Virus), HPV (Hepatopancreatic Parvovirrus) gen nội chuẩn beta-actin tôm sú (Penaeus monodon) 30 Viện nghiên cứu ni trồng thủy sản I http://www.ria1.org/modules/news/article.php?storyid=150 Báo cáo tình hình bệnh tơm Thái bình (Ngày truy cập 29/11/2008) 31 K.K Vijayan, S.V Alavandi, K.L Rajendran and K Alagarswami 1995 Prevalence and Histopathology of Monodon Baculovirus (MBV) Infection in Penaeus monodon and P Indicus in Shrimp Farms in the South-East Coast of India Asia fisheries science (1995): 267-272 32 Win Surachetpong*, Bonnie T Poulos, Kathy F.J Tang, Donald V Lightner Improvement of PCR method for the detection of monodon baculovirus (MBV) in penaeid shrimp Aquaculture 249 (2005) 69– 75 - 43 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com ... KHOA THỦY SẢN TRẦN VIẾT TỒN PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV ( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) VÀ GEN BETA- ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP... WSSV (White spot syndrome virus) gen beta – actin tôm sú (Penaeus monodon) ” thực Mục tiêu đề tài Phát triển ứng dụng quy trình mPCR phát đồng thời MBV, WSSV tơm sú (Penaeus monodon) kiểm sốt kết... QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Thực quy trình PCR phát MBV (Karlo et al.,2006) 27 4.2 Thực quy trình mPCR phát MBV gen β – actin 29 4.3 Thực quy trình mPCR phát MBV WSSV 31 4.4 Thực quy trình