NGHIÊN CỨU BIẾN ĐÓI SINH HỌC ĐẠU HŨ BẰNG Bacillus nao DÙNG CHÈ BIỂN THỨC UỐNG PROBIOTIC

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG ***000*** LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SINH HỌC ĐẬU HŨ BẰNG Bacillus natto DÙNG CHẾ BIẾN THỨC UỐNG PROBIOTIC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: TS LÊ CHIẾN PHƯƠNG SVTH: PHAN MINH CẢNH Niên khoá: 2005 – 2010 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009 TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG ***000*** NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SINH HỌC ĐẬU HŨ BẰNG Bacillus natto DÙNG CHẾ BIẾN THỨC UỐNG PROBIOTIC Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS LÊ CHIẾN PHƯƠNG PHAN MINH CẢNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành tốt đề tài này, nhận giúp đỡ tận tình thầy cơ, anh chị bạn Tôi xin chân thành cảm ơn: TS Lê Chiến Phương tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện để luận văn hoàn thành ThS Phan Văn Dân, ThS Võ Thanh Trang giúp đỡ, hỗ trợ, đồng hành với tơi để hồn thành đề tài Tôi vô cảm ơn thầy cô, anh chị Viện Sinh học Nhiệt Đới nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Khoa Học Ứng Dụng trường Đại học Tôn Đức Thắng tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học trường Cuối xin cảm ơn tất người giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực tốt đề tài Người thực Phan Minh Cảnh Trang i MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu đậu tương 1.1.1 Phân loại đậu tương 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Giá trị dinh dưỡng 1.1.4 Công dụng y học đậu nành 1.1.5 Các sản phẩm từ đậu nành 1.1.5.1 Đậu phụ 1.1.5.2 Chao 1.1.5.3 Tương 1.1.5.4 Miso 1.1.5.5 Natto 10 1.1.5.6 Tempeh 11 1.2 Giới thiệu Bacillus natto 11 1.2.1 Đặc điểm Bacillus natto 12 1.2.2 Phân bố tự nhiên 12 1.2.3 Tác hại 12 1.2.4 Lợi ích 12 1.2.4.1 Tạo kháng sinh 12 1.2.4.2 Sinh tổng hợp enzyme 13  Amylase 13  Protease 14 1.3 Giới thiệu vi khuẩn lactic 14 1.3.1 Phân loại 14 1.3.2 Hình thái, sinh lý 14 1.3.3 Vài đại diện 15 1.3.4 Úng dụng 16 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Trang ii 2.1 Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm 18 2.1.1 Thời gian 18 2.1.2 Địa điểm 18 2.2 Vật liệu thí nghiệm 18 2.2.1 Nguyên liệu 18 2.2.2 Chủng vi sinh vật 19 2.2.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 19 2.2.4 Môi trường dùng thực nghiệm 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Giữ giống Bacillus natto môi trường cá pepton 19 2.3.2 Nghiên cứu hình thái Bacillus natto 19 2.3.2.1 Phương pháp nhuộm Gram 20 2.3.2.2 Phương pháp nhuộm bào tử 20 2.3.3 Nghiên cứu động học sinh trưởng 21 2.3.3.1 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng 21 2.3.3.2 Phương pháp xác định thời gian hệ 23 2.3.3.3 Phương pháp xác định thời gian sinh khối max 23 2.3.3.4 Phương pháp xác định thời gian tạo sinh khối tối đa môi trường sữa đậu nành 23 2.3.4 Nghiên cứu hoạt tính enzyme 23 2.3.4.1 Phương pháp định tính enzyme 23 2.3 4.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase 24 2.3.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease 25 2.3.5 Nghiên cứu chế biến thức uống lên men lactic từ đậu hũ thủy phân 26 2.3.5.1 Nhân giống Bacillus natto môi trường sữa đậu nành 26 2.3.5.2 Chuẩn bị chất cho lên men 26 2.3.5.3 Nghiên cứu quy trình dùng Bacillus natto biến đổi sinh học đậu hũ để chế biến thức uống probiotic 26 2.3.6 Phân tích tiêu nguyên liệu sản phẩm 27 2.3.6.1 Phương pháp định lượng đạm tổng số 27 2.3.6.2 Phương pháp định lượng đạm formol 28 Trang iii 2.3.6.3 Phương pháp định lượng đạm amoniac 30 2.3.6.4 Phương pháp định lượng đường tổng số 31 2.3.6.5 Phương pháp định lượng đường khử 32 2.3.6.6 Phương pháp định lượng lipit thô 33 2.3.5.7 Phương pháp định lượng peroxyde 33 2.3.5.8 Phương pháp xác định độ ẩm 34 2.3.5.9 Phương pháp định lượng acid lactic cách xác định độ Therner 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết khảo sát nguồn giống 38 3.1.1 Hình thái đại thể vi thể Bacillus natto 38 3.1.2 Kết nhuộm Gram 38 3.1.3 Kết nhuộm bào tử 39 3.1.4 Kết xác định thời gian hệ 39 3.1.5 Kết định tính enzyme amylase 41 3.1.6 Kết định tính enzyme protease 41 3.1.7 Kết xác đinh hoạt tính enzyme amylase 42 3.1.8 Kết xác định hoạt tính enzyme protease 43 3.1.9 Kết xác định sinh khối tối đa môi trường sữa đậu nành 44 3.2 Các kết phân tích 45 3.2.1 Đạm tổng 45 3.2.2 Đạm formol 45 3.2.3 Đường tổng 46 3.2.4 Đường khử 47 3.2.5 Peroxyde 48 3.2.6 Độ ẩm 49 3.2.7 Acid lactic 50 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 CHƯƠNG PHỤ LỤC 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Trang iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Thành phần acid amin protein đậu nành Bảng 1.2 Thành phần khoáng đậu nành Bảng 1.3 Thành phần vitamin đậu nành Bảng 3.1 Sự tăng trưởng B natto môi trường dịch nước mắm CP 39 Bảng 3.2 Đường kính vịng phân giải tinh bột B natto B subtilis 41 Bảng 3.3 Đường kính vịng phân giải casein B natto B subtilis 42 Bảng 3.4 Hoạt tính enzyme amylase môi trường sữa đậu nành 42 Bảng 3.5 Hoạt tính enzyme protease mơi trường sữa đậu nành .43 Bảng 3.6 Sự tăng trưởng B natto môi trường sữa đậu nành 44 Bảng 3.7 Lượng đạm tổng nguyên liệu 45 Bảng 3.8 Lượng đạm formol nguyên liệu giai đoạn thủy phân 45 Bảng 3.9 Lượng đường tổng nguyên liệu giai đoạn thủy phân 46 Bảng 3.10 Lượng đường khử nguyên liệu giai đoạn thủy phân 47 Bảng 3.11 Lượng peroxyde nguyên liệu giai đoạn thủy phân 48 Bảng 3.12 Độ ẩm nguyên liệu giai đoạn thủy phân .49 Bảng 3.13 Lượng acid lactic 50 Bảng 3.14 Bảng tổng kết trình thủy phân 50 Trang v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây đậu tương Hình 1.2 Sản phẩm đậu hũ Hình 1.3 Sản phẩm chao Hình 1.4 Sản phẩm nước tương Hình 1.5 Sản phẩm Miso 10 Hình 1.6 Sản phẩm natto 10 Hình 1.7 Sản phẩm Tempeh 11 Hình 2.1 Đậu hũ vina 18 Hình 2.2 Nước mắm Hưng Thịnh .18 Hình 2.3 Sữa đậu nành khơng đường 19 Hình 3.1 Kết giữ giống thạch nghiêng 38 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc (a) hình thái tế bào nhuộm đơn (b) 38 Hình 3.3 Kết nhuộm Gram 38 Hình 3.4 Hình thái bào tử 39 Hình 3.5.Nhân giống B.natto môi trường dịch thể nước mắm .39 Hình 3.6 Khả phân giải tinh bột Bacillus natto Bacillus subtilis sau ngày nuôi cấy môi trường cảm ứng tổng hợp amylase .41 Hình 3.7 Khả phân giải casein Bacillus natto Bacillus subtilis sau ngày nuôi cấy môi trường cảm ứng tổng hợp protease 41 Hình 3.8 Nhân giống Bacillus natto môi trường sữa đậu nành 44 Trang vi DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Trang Đồ thị Đường cong tăng trưởng Bacillus natto môi trường dịch thể nước mắm CP 40 Đồ thị Hoạt tính enzyme amylase mơi trường sữa đậu nành .42 Đồ thị Hoạt tính enzyme protease môi trường sữa đậu nành 43 Đồ thị Đường cong tăng trưởng Bacillus natto môi trường sữa đậu nành 45 Đồ thị Lượng đạm focmon nguyên liệu giai đoạn thủy phân 46 Đồ thị Lượng đường tổng nguyên liệu giai đoạn thủy phân 47 Đồ thị Lượng đường khử nguyên liệu giai đoạn thủy phân 48 Đồ thị Chỉ số peroxyde nguyên liệu giai đoạn thủy phân .49 Đồ thị Độ ẩm nguyên liệu giai đoạn thủy phân 49 Trang vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT FAO: Food and Agriculture Organization FDA: Food and Drug Administration AOAC: Association of Analytical Communities OD: Optical Density B natto: Bacillus natto B.subtilis: Bacilus subtilis LDL: Low-density lipoprotein HDL: High-Density Lipoprotein Trang viii 8h 3,0 4,2 3000 10h 5,2 7,28 5200 12h 5,7 7,98 5700 14h 6,0 8,4 6214 16h 6,4 8,96 6400 Lượng đạm (g/100g) Đạm formol 10 7.28 7.98 8.4 8.96 4.2 3.36 0.14 0.21 0.84 10 12 14 16 Thời gian (giờ) Đồ thị Lượng đạm formol nguyên liệu giai đoạn thủy phân Nhận xét: Lượng đạm formol cao nguyên liệu ban đầu tăng dần theo thời gian enzyme vi khuẩn phân giải protein tạo acid amin 3 Đường tổng Bảng 3.9 Lượng đường tổng nguyên liệu giai đoạn thủy phân Mẫu Đường tổng (g/100g) % Nguyên liệu 3,09 100 2h 2,38 76,99 4h 1,66 53,73 6h 1,49 48,13 8h 1,48 47,89 10h 1,05 34,08 12h 1,00 32,34 14h 0,93 30,22 16h 0,83 26,74 Trang 46 Đường tổng Đ ường tổ ng (g/1 0 g ) 3.50 3.09 3.00 2.38 2.50 2.00 1.66 1.49 1.50 1.48 1.05 1.00 0.93 0.83 12 14 16 1.00 0.50 0.00 10 Thời gian (giờ) Đồ thị Lượng đường tổng nguyên liệu giai đoạn thủy phân Nhận xét: Lượng đường tổng giảm vi khuẩn sử dụng hydratcacbon để tạo sinh khối lượng Đường khử Bảng 3.10 Lượng đường khử nguyên liệu giai đoạn thủy phân Mẫu Đường khử (g/100g) % Nguyên liệu 0,19 100 2h 0,62 325 4h 0,67 350 6h 0,69 359,3 8h 0,70 367,6 10h 0,72 376,8 12h 0,75 394,7 14h 0,78 410,5 16h 0,80 421 Trang 47 Đường khử 0.90 Đường khử (g/100g) 0.80 0.70 0.69 0.70 0.72 0.67 10 0.75 0.78 0.80 14 16 0.62 0.60 0.50 0.40 0.30 0.19 0.20 0.10 0.00 12 Thời gian (giờ) Đồ thị Lượng đường khử nguyên liệu giai đoạn thủy phân Nhận xét: Lượng đường khử tăng đáng kể vi khuẩn phân giải hydratcacbon tạo đường khử, ngun liệu hydratcacbon khơng sử dụng nên có hàm lượng đường khử thấp Peroxyde Bảng 3.11 Lượng peroxyde nguyên liệu giai đoạn thủy phân Mẫu VNa2S2O3 (ml) Peroxyde (g/100g) % Nguyên liệu 0,6 1,59 100 0,8 2,03 127,67 1,05 2,665 167,61 1,2 3,05 191,8 1,3 3,3 207,54 10 1,4 3,55 223,27 12 1,6 4,06 255,35 14 1,7 4,31 271,07 16 1,9 4,82 303,14 Trang 48 Peroxyde Chỉ số peroxyde 4.82 4.31 4.06 3.05 2.665 3.55 3.3 2.03 1.59 0 10 12 14 16 Thời gian (giờ) Đồ thị Chỉ số peroxyde nguyên liệu giai đoạn thủy phân Nhận xét: Chỉ số peroxyde tăng theo thời gian thủy phân cao nguyên liệu ban đầu Độ ẩm Bảng 3.12 Độ ẩm nguyên liệu giai đoạn thủy phân Mẫu Nguyên liệu Độ ẩm (%) 83.9 10 12 14 16 giờ giờ giờ giờ 84.1 84.3 84.35 84.4 84.5 84.8 84.05 84.1 Độ ẩm 85 84.8 84.8 84.6 % 84.4 84.2 84 84.05 84.08 84.1 84.3 84.35 84.4 10 12 84.5 83.9 83.8 83.6 83.4 14 16 Thời gian (giờ) Đồ thị Độ ẩm nguyên liệu giai đoạn thủy phân Trang 49 Nhận xét: Độ ẩm tăng theo thời gian thủy phân cao nguyên liệu ban đầu tăng không đáng kể Acid lactic Bảng 3.13 Lượng acid lactic tạo sau 24 lên men Mẫu VNaOH (ml) Độ therner Lượng acid lactic (g/100g) 24 2,3 23 2,07 Nhận xét: vi khuẩn lactic phát triển chất đậu hũ thủy phân, sinh acid lactic Bảng 3.14 Bảng tổng kết trình thủy phân Chỉ tiêu Ntổng Nformol Đường Đường (g/100g) (g/100g) tổng khử Peroxyde Độ ẩm (%) (g/100g) (g/100g) (g/100g) Nguyên liệu 10,5 0,14 3,09 0,19 1,59 83,9 0,21 2,38 0,62 2,03 84,05 0,84 1,66 0,67 2,665 84,08 3,36 1,49 0,69 3,05 84,1 4,2 1,48 0,70 3,3 84,3 10 7,28 1,05 0,72 3,55 84,35 12 7,98 1,00 0,75 4,06 84,4 14 8,4 0,93 0,78 4,31 84,5 16 8,96 0,83 0,80 4,82 84,8 Trang 50 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Trang 51 KẾT LUẬN  Qua trình thí nghiệm chúng tơi xây dựng đường cong tăng trưởng B natto  Định tính hệ enzyme B natto thích hợp cho q trình nghiên cứu  Đã xác định phương pháp thủy phân (lượng giống, thời gian thủy phân…)  Đã tạo đậu hũ thủy phân có hàm lượng dinh dưỡng cao nhiều so với nguyên liệu đậu hũ ban đầu không bị đắng phương pháp vi sinh vật (sử dụng vi khuẩn lactic lên men phối hợp để ức chế B natto)  Chúng xác định biến đổi tiêu đạm formon, đường, peroxyde, độ ẩm nguyên liệu sản phẩm Các kết thu phù hợp với quy luật bình thường biến đổi chất hoạt động sống vi sinh vật gây ĐỀ NGHỊ  Trong q trình thí nghiệm, chúng tơi nhân giống môi trường dịch thể nước mắm sữa đậu nành thấy vi khuẩn B natto phát triển tốt Vì thời gian có hạn, chúng tơi chưa khảo sát ảnh hưởng yếu tố khác nhiệt độ, pH đến enzyme B natto môi trường Xin đề nghị tiếp tục xác định:  Ảnh hưởng nhiệt độ, pH đến trình tổng hợp enzyme B natto  Xác định điều kiện ni cấy tối ưu cho q trình tổng hợp enzyme B natto ứng dụng vào sản xuất thực phẩm dinh dưỡng  Các tiêu vi sinh sản phẩm  Hàm lượng đạm tổng, lipid thô qua giai đoạn thủy phân  Lên men lactic đậu hũ thủy phân để sản xuất thức uống probiotic Trang 52 Chương PHỤ LỤC Trang 53 Thành phần môi trường 1 Môi trường CP (Cá peptone) Nước mắm 350N 20 ml Peptone 10 g Agar 20 g Nước cất 1000 ml Môi trường PGA (Peptone glucose agar) Khoai tây 200 g Glucose 20 g Agar 20 g Nước cất 1000 ml Môi trường sữa đậu nành Sữa đậu nành tỷ trọng 1,01 Đường saccharose 3% Môi trường Czapek-Dox NaNO3 3,5g K2HPO4 1,5g MgSO4 0,5g KCl 0,5g FeSO4 0,1g Đường kính 30g Agar 20g Nước 1000ml pH 6,5 5 Môi trường cà chua (N2) Nước ép cà chua 400ml Glucose 10g Cao nấm men 10g CaCO3 10g Dung dịch A 5ml Dung dịch B 5ml Trang 54 Agar 20g Nước cất 1000ml pH 6,9 Dung dịch A: K2HPO4 2,5g KH2PO4 2,5g Nước cất 250ml Dung dịch B: MgSO4.7H2O 10g NaCl 5g FeSO4.H2O 5g MnSO4.4H2O 5g Nước cất 250ml Qui trình sản xuất đậu hũ Đậu tương rửa Ngâm nước 5-6h 20-250C Đãi vỏ rửa Xay nước (1kg đậu:6l nước) Lọc thô Bã Rửa bã Bã Lọc tinh Lọc Bã Dịch sữa đậu Sữa đậu (1kg/9l sữa pH 6-6,5) Đun sôi 5-10 phút Kết tủa Hoa đậu Ép Bánh đậu Nước đậu Trang 55 Phương trình đường chuẩn Đường chuẩn protease Đường chuẩn đường tổng Trang 56 3 Đường chuẩn đường khử Trang 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trang 58 Tài liệu tiếng việt Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường Thực hành Hóa Sinh Học NXB Giáo Dục, tr 19-24, 54, 55 Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh, Văn Đức Chín, 2000 Thực tập lớn Sinh Hóa, Tủ Sách Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, TP.HCM, tr 34-37, 57-61 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 2001 Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục, tr 221, 224-225 Ngạc Văn Giậu Chế biến đậu tương lạc thành thức ăn giàu protein NXB Nông Nghiệp, tr 11, 177-185 TS Bùi Văn Lệ, ThS Lê Thị Mỹ Phước, CN Nguyễn Thị Mỹ Lan, CN Lê Văn Bình, CN Võ Minh Trí, 2001 Thực tập sinh hóa, tr 34-37 Nguyễn Văn Mùi, 2002 Thực hành hóa sinh học, NXB Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội, tr 50-54, 83-84 PTS Nguyễn Hữu Phúc, 1998 Các phương pháp lên men thực phẩm truyền thống Việt Nam nước vùng, NXB Nông nghiệp, TP.HCM Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982 Enzyme vi sinh vật, tập 1, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội, tr 124, 125, 131, 133, 190, 192, 202-209 PGS-TS Trần Minh Tâm, 2000 Công nghệ vi sinh ứng dụng, NXB Nông Nghiệp, TP.HCM, tr 143-145 10 Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lai, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào, 1999 Cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, tr 11 Viện dinh dưỡng, Bộ Y tế, 2000 Bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam, NXB y học, Hà Nội, tr 17 12 Sử dụng thực phẩm nhiệt đới Trang 59 Các hạt có dầu, trung tâm thông tin nông nghiệp-công nghệ thực phẩm ấn hành với thỏa thuận tổ chức lương thực nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO), Hà Nội, 1993 Tài liệu nước 13 J.G.Holt the shorter Bergey’s manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, tiếng Nga, NXB Mir, 1980, tr 286-288 Tài liệu internet 14 http://www.khoe24.vn/home/kien-thuc-san-pham/thong-tin-hoat-chatinsoflavones-dau-nanh-htm 15 http://dhsphue.edu.vn:88/view/style1.asp?topic=000000000001431 16 http://www.cuocsongviet.com.vn/index.asp?act=detail&mabv=4962 17 http://www.cuocsongviet.com.vn/index.asp?act=detail&mabv=4966 18 http://www.jafra.gr.jp/eng/sumi.html 19 http://www.vocw.edu.vn/content/m10181/latest/ 20 http://d.violet.vn/uploads/resources/49/370835/preview.swf Trang 60 ... lần : 14 * V * x * 1 0-4 (g) Số gam đạm có 10ml dung dịch nguyên liệu chưa pha loãng 10 lần 14 * V * x * 1 0-4 * 10 (g) Số gam đạm có 1l dung dịch nguyên liệu 14 * V * x * 1 0-4 * 10 * 1000 / 10... trưởng Bacillus natto môi trường lỏng CP Thời gian Số lượng khuẩn lạc đĩa 10 -5 10^5.CFU/ml OD600nm (giờ) 10 -4 10 -6 63;51 0,57 0,03 153;166 1,59 0,05 Trang 39 10^ 6.CFU/m l 52; 58; 75 4,43 0,15... dẫn xuất acid nucleic, vitamin, acid béo hay ester acid béo Biên độ nhiệt độ rộng 5-3 50C, nhiệt độ thích hợp 3 0-4 20C, pH thích hợp 5,55,8 Úng dụng Vi khuẩn lactic dùng để lên men thu nhận acid