kl le thi phuong loan 072485s

TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐỘNG VIỆT NAM ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BƯỚC ĐẦU THIẾT LẬP QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO LAN DENDROBIUM SONIA BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành : Công nghệ sinh học Chuyên ngành : Công nghiệp Mã số : GVHD : THS NGUYỄN XUÂN DŨNG SVTH : LÊ THỊ PHƯƠNG LOAN MSSV : 072485S TP.HỒ CHÍ MINH - 2011 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực đề tài đến em hoàn thành báo cáo luận văn tốt nghiệp, để có hội thực hành học hỏi thêm nhiều kiến thức suốt trình vừa qua, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Ban Giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng Ban Giám đốc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh Qúy thầy, khoa Khoa Học Ứng Dụng trường Đại học Tôn Đức Thắng tạo điều kiện để em hoàn tất luận văn Cùng anh chị thuộc phịng Cơng Nghệ Sinh học thực vật Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh Đặc biệt, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Xuân Dũng người hết lòng dạy dỗ hướng dẫn em thực đề tài suốt thời gian qua Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè giúp đỡ động viên em suốt thời gian thực đề tài i TÓM TẮT KHĨA LUẬN Lê Thị Phương Loan, Đại học Tơn Đức Thắng Tp HCM Tháng 12/2011 “BƯỚC ĐẦU THIẾT LẬP QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO LAN DENDROBIUM SONIA BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium ” Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Xuân Dũng Đề tài nghiên cứu “Bước đầu thiết lập quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia vi khuẩn Agrobacterium” tiến hành Phịng Cơng nghệ sinh học Thực vật – Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh, thời gian thực từ 20/8 đến 20/12 năm 2011.Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Kết nghiên cứu đề tài nhằm mục đích cung cấp liệu khoa học cần thiết cho việc chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia lan Dendrobium nói chung vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Các thông số kỹ thuật đề tài sở để tiếp tục tiến hành chuyển gen tạo lan Dendrobium Sonia có khả kháng virus Kết nghiên cứu: - Acetosyringone 100  thời gian đồng nuôi cấy ngày tạo hiệu chuyển gen cao chuyển gen vào PLB lan Dendrobium Sonia - Hygromycin 10 mg/l có khả giết chết tồn PLB sau 20 ngày ni cấy, thích hợp cho sàn lọc PLB chuyển gen - Cefotaxime 300 mg/l có khả diệt hoàn toàn vi khuẩn cộng sinh với PLB sau ngày, thích hợp cho loại vi khuẩn từ PLB sau đồng nuôi cấy ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH SÁCH CÁC HÌNH vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỀU ĐỒ vii CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích phạm vi đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu chung lan Dendrobium Sonia 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.2 Sơ lược vi khuẩn Agrobacterium 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium 2.2.3 Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium 2.2.4 Sơ lược phương pháp chuyển gen vào nhân tế bào thực vật thông dụng: 11 2.2.5 Cơ chế chuyển gen thông qua Agrobacterium 13 2.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen hoa lan 15 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 17 3.1.1 Thời gian 17 3.1.2 Địa điểm 17 3.2 Nội dung nghiên cứu 17 3.3 Vật liệu nghiên cứu 17 iii 3.3.1 Vật liệu 17 3.3.2 Trang thiết bị dụng cụ 19 3.3.3 Hóa chất 19 3.3.4 Điều kiện thí nghiệm 20 3.4 Phương pháp nghiên cứu 20 3.4.1 Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 20 3.4.2 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng Acetosyringone thời gian đồng nuôi cấy thích hợp vi khuẩn Agrobacterium PLB 20 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ kháng sinh Cefotaxime lên khả loại vi khuẩn từ mô cấy 21 3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ kháng sinh Hygromycin lên khả sống protocorm 22 3.4.5 Xử lý thống kê 22 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy nồng độ Acetosyringone đến khả chuyển gen vào PLB thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 23 4.2 Ảnh hưởng nồng độ kháng sinh Cefotaxime lên khả diệt vi khuẩn Agrobacterium từ mô cấy 28 4.3 Ảnh hưởng nồng độ kháng sinh Hygromycin lên khả sống PLB 31 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 39 iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A.tumefacciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone DNA Deoxyribonucleic acid GFP Green Fluorescent Protein GUS β-glucuronidase LB Luria-Bertani LB Left Border MS Murashige and Skoog PCR Polymerase Chain Reaction PEG Polyethylene glycol PLB Protocorm like body RB Right Border T-DNA Transfer-DNA v DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Lan Dendrobium Sonia Hình 2.2: Vi khuẩn Agrobacterium kính hiển vi Hình 2.3: Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium Hình 2.4: Vị trí Ti-plasmid tế bào vi khuẩn Hình 2.5: Cấu trúc Ti-Plasmid 10 Hình 3.1: Chuẩn bị protocorm cho trình chuyển gen 17 Hình 3.2: Vi khuẩn Agrobacterium cấy đĩa môi trường LB 18 Hình 3.3: Cấu trúc vector pCambia 1301 18 Hình 4.1: Các mức độ biểu màu khác mẫu PLB dương tính GUS 27 Hình 4.2: PLB nuôi cấy môi trường MS không bổ sung Hygromycin (A) có bổ sung Hygromycin nồng độ 10 mg/l (B) sau 20 ngày 31 vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 4.1: Tỷ lệ mẫu PLB dương tính sau nhuộm GUS nồng độ Acetosyringone sau ngày đồng nuôi cấy 23 Bảng 4.2: Tỷ lệ mẫu PLB dương tính sau nhuộm GUS nồng độ Acetosyringone sau ngày đồng nuôi cấy 24 Bảng 4.3: Tỷ lệ mẫu PLB dương tính sau nhuộm GUS nồng độ Acetosyringone sau ngày đồng nuôi cấy 25 Bảng 4.4: Tỷ lệ mẫu PLB dương tính sau nhuộm GUS nồng độ Acetosyringone sau ngày đồng nuôi cấy 26 Bảng 4.5: Tỷ lệ mẫu sống khuẩn môi trường MS bổ sung kháng sinh Cefotaxime nồng độ khác theo thời gian nuôi cấy 30 Bảng 4.6: Tỷ lệ mẫu PLB sống môi trường chứa Hygromycin nồng độ khác theo thời gian nuôi cấy 32 Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ mẫu PLB dương tính GUS nồng độ Acetosyringone 100 µM theo thời gian đồng nuôi cấy 26 Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ mẫu sống khuẩn môi trường MS bổ sung kháng sinh Cefotaxime nồng độ khác sau ngày nuôi cấy 28 Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ mẫu sống khuẩn môi trường MS bổ sung kháng sinh Cefotaxime nồng độ khác sau ngày nuôi cấy 29 Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ mẫu sống khuẩn môi trường MS bổ sung kháng sinh Cefotaxime nồng độ khác sau 15 ngày nuôi cấy 30 Biểu đồ 4.5: Tỷ lệ mẫu PLB sống môi trường chứa Hygromycin nồng độ khác sau 10 ngày nuôi cấy 32 Biểu đồ 4.6: Tỷ lệ mẫu PLB sống môi trường chứa Hygromycin nồng độ khác sau 15 ngày nuôi cấy 33 Biểu đồ 4.7: Tỷ lệ mẫu PLB sống môi trường chứa Hygromycin nồng độ khác sau 20 ngày nuôi cấy 33 vii CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 3.1 Đặt vấn đề Dendrobium giống lớn thứ hai họ lan (Orchidaceae), có phân bố rộng từ vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới, thích hợp điều kiện khí hậu Việt Nam Trong đó, Dendrobium Sonia lồi lan lai có hoa đẹp, màu tím, ưa chuộng loại lan cắt cành chủ lực Việt Nam nói chung Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng Tuy nhiên, lan Dendrobium Sonia hoa lan nói chung dễ mắc loại bệnh gây hại, đặc biệt bệnh virus Bệnh virus gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng phát triển lan chưa có thuốc đặc trị Do đó, việc tạo giống lan có khả kháng virus vấn đề cấp thiết phương pháp quan tâm để tạo lan kháng virus chuyển gen Mặc dù phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thường sử dụng để chuyển gen thuộc lớp hai mầm Tuy nhiên, gần có nhiều nghiên cứu cho thấy sử dụng vi khuẩn để chuyển gen mầm, nhiên địi hỏi phải tối ưu hóa nhiều yếu tố liên quan quy trình chuyển gen Với mục tiêu tạo quy trình phù hợp để chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, góp phần vào mục tiêu tạo lan chuyển gen kháng virus tương lai, đề tài: “Bước đầu thiết lập quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia vi khuẩn Agrobacterium” triển khai thực 3.2 Mục đích phạm vi đề tài Xây dựng quy trình chuyển gen vào protocorm lan Dendrobium Sonia thông qua vi khuẩn Agrobacterium Đồng thời tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chuyển gen 3.3 Ý nghĩa đề tài Kết nghiên cứu đề tài cung cấp liệu khoa học cần thiết cho việc chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia lan Dendrobium nói chung vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Các thông số kỹ thuật đề tài sở để tiếp tục tiến hành chuyển gen tạo lan Dendrobium Sonia có khả kháng virus Vitamin Morel and Wetmore (1951) Panthothenat decalcium Meso-inositol 100 Acid nicotinique Pyrydoxin – HCL Thiamin Bioyin 0.001 Đường sacharose: 30.0 g/l Agar : 8.0 g/l pH : 5.8 Môi trường Luria-Bertania ( LB ) Bacto tryptone 10,0 g/1 BactoYeast Extract 5,0 g/1 NaCl 10,0 g/1 Nước cất 1000,0 ml pH 7,0 40 Kết phân tích SPSS phiên 16 3.1 Kết phân tích thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy nồng độ acetosyringone đến khả chuyển gen vào PLB thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens a Sau ngày đồng nuôi cấy TLMAUDOIMAU Levene Statistic df1 df2 Sig .308 10 866 ANOVA TLMAUDOIMAU Sum of Squares Between df Mean Square 2826.667 706.667 Within Groups 1866.667 10 186.667 Total 4693.333 14 Groups Post Hoc Tests Homogeneous Subsets 41 F Sig 3.786 040 TLMAUDOIMAU Duncan Subset for alpha = 0.05 NT N 1 6.6667 6.6667 26.6667 33.3333 3 40.0000 Sig .117 26.6667 280 Means for groups in homogeneous subsets are displayed b Sau ngày đồng nuôi cấy TLMAUDOIMAU Levene Statistic df1 df2 Sig 2.476 10 112 42 ANOVA TLMAUDOIMAU Sum of Squares df Mean Square F Sig Between Groups 2360.000 590.000 4.917 019 Within Groups 1200.000 10 120.000 Total 3560.000 14 Post Hoc Tests Homogeneous Subsets TLMAUDOIMAU Duncan Subset for alpha = 0.05 NT N 1 6.6667 6.6667 10.0000 16.6667 3 Sig 40.0000 321 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 43 1.000 c Sau ngày đồng nuôi cấy TLMAUDOIMAU Levene Statistic df1 df2 Sig 3.467 10 050 ANOVA TLMAUDOIMAU Sum of Squares df Mean Square F Sig 5240.000 1310.000 8.188 003 Within Groups 1600.000 10 160.000 Total 6840.000 14 Between Groups Post Hoc Tests Homogeneous Subset 44 TLMAUDOIMAU Duncan Subset for alpha = 0.05 NT N 13.3333 20.0000 20.0000 20.0000 20.0000 3 43.3333 43.3333 63.3333 Sig .552 056 082 Means for groups in homogeneous subsets are displayed d Sau ngày đồng nuôi cấy TLMAUDOIMAU Levene Statistic df1 df2 Sig .519 10 724 45 ANOVA TLMAUDOIMAU Sum of Squares df Mean Square F Sig 8800.000 2200.000 5.500 013 Within Groups 4000.000 10 400.000 Total 12800.000 14 Between Groups Post Hoc Tests Homogeneous Subsets TLMAUDOIMAU Duncan Subset for alpha = 0.05 NT N 1 13.3333 20.0000 20.0000 33.3333 33.3333 3 Sig 53.3333 53.3333 80.0000 269 080 134 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 46 3.2 Kết phân tích thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ kháng sinh cefotaxime lên khả diệt vi khuẩn Agrobacterium từ mô cấy a Sau ngày TLMAUSONG Levene Statistic df1 df2 Sig 6.486 016 ANOVA TLMAUSONG Sum of Squares df Mean Square Between Groups 3111.022 1037.007 Within Groups 740.815 92.602 Total 3851.837 11 Post Hoc Tests 47 F Sig 11.199 003 Homogeneous Subsets TLMAUSONG Duncan Subset for alpha = 0.05 NT N 60.0000 3 80.0000 97.7767 Sig 97.7767 1.0000E2 1.000 054 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 48 784 b Sau 15 ngày TLMAUSONG Levene Statistic df1 df2 Sig 8.025 009 ANOVA TLMAUSONG Sum of Squares df Mean Square F Sig 16188.922 5396.307 13.747 002 Within Groups 3140.459 392.557 Total 19329.381 11 Between Groups Post Hoc Tests Homogeneous Subsets 49 TLMAUSONG Duncan Subset for alpha = 0.05 NT N 0000 3 26.6667 3 Sig 26.6667 48.8900 1.0000E2 138 207 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 3.3 Kết phân tích thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ kháng sinh Hygromycin lên khả sống PLB a Sau 10 ngày TLMAUSONG Levene Statistic df1 df2 Sig 3.999 12 035 50 ANOVA TLMAUSONG Sum of Squares df Mean Square F Sig 4385.864 1461.955 10.741 001 Within Groups 1633.300 12 136.108 Total 6019.164 15 Between Groups Post Hoc Tests Homogeneous Subsets TLMAUSONG Duncan Subset for alpha = 0.05 NT N 4 56.6675 89.9975 91.6675 100.0000 Sig 1.000 271 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 51 b Sau 15 ngày Oneway Test of Homogeneity of Variances TLMAUSONG Levene Statistic df1 3.172 df2 Sig 12 064 ANOVA TLMAUSONG Sum of Squares df Mean Square F Sig Between Groups 17719.014 5906.338 24.823 000 Within Groups 2855.278 12 237.940 Total 20574.292 15 Post Hoc Tests Homogeneous Subsets 52 TLMAUSONG Duncan Subset for alpha = 0.05 NT N 4 11.6675 74.9975 81.6675 81.6675 1.0000E2 Sig 1.000 552 119 Means for groups in homogeneous subsets are displayed b Sau 20 ngày TLMAUSONG Levene Statistic df1 4.266 df2 53 Sig 12 029 ANOVA TLMAUSONG Sum of Squares Between df Mean Square 22700.117 7566.706 Within Groups 5110.222 12 425.852 Total 27810.339 15 Groups F Sig 17.768 000 Post Hoc Tests Homogeneous Subsets TLMAUSONG Duncan Subset for alpha = 0.05 NT N 4 0000 4 70.0000 1.0000E2 Sig 33.3325 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 54 062 ... Trang thi? ??t bị dụng cụ - Tủ cấy vô trùng - Nồi hấp - Máy cất nước - Tủ lạnh - Máy chỉnh pH - Cân điện tử - Tủ sấy - Lị vi sóng - Máy điều hịa - Máy đo mật độ quang - Máy ly tâm - Máy lắc - Tủ... Cấu trúc chức T-ADN T-ADN đoạn ADN có kích thước 25 kb, chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine gen gây khối u Trong Ti-plasmid, vị trí T-ADN giới hạn bờ phải (RB- Right Border)... trái (LB-Left Border) Ngồi T-ADN, Ti-plasmid cịn có vùng ADN mã hóa cho việc tái sinh plasmid, cho khả lây nhiễm tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine [1] Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-ADN