Thu Nhận Ethanol Từ Sinh Khối Rong Nước Lợ Chaetomorpha Sp.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN MINH HẢI THU NHẬN ETHANOL TỪ SINH KHỐI RONG NƯỚC LỢ CHAETOMORPHA SP Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số chuyên ngành: 62540101 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH - 2022 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM Người hướng dẫn 1: Giáo sư Tiến sĩ Lê Văn Việt Mẫn Người hướng dẫn 2: Phó Giáo sư Tiến sĩ Hoàng Kim Anh Phản biện độc lập: GS TS Nguyễn Minh Thủy Phản biện độc lập: PGS TS Phan Tại Huân Phản biện: PGS TS Đồng Thị Thanh Thu Phản biện: PGS TS Tôn Nữ Minh Nguyệt Phản biện: TS Lê Thị Ánh Hồng Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án họp tại: Phòng B4 – 401, Trường Đại Học Bách Khoa – ĐHQG TP Hồ Chí Minh vào lúc 14 00 ngày tháng năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM - Thư viện Đại Học Quốc Gia - HCM - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Tại Việt Nam, ethanol sản xuất từ nguyên liệu ngũ cốc (gạo) củ (khoai mì) Sản xuất ethanol từ gạo khoai mì ảnh hưởng lớn đến nguồn lương thực nước, đặc biệt việc xuất Để đảm bảo nhu cầu ngày gia tăng ethanol cân lương thực cho người, nhà khoa học giới tìm kiếm nguồn nguyên liệu để sản xuất ethanol sinh học Rong biển xem nguồn nguyên liệu từ sinh vật thủy sinh nhiều nhà khoa học ý đến nguồn nguyên liệu sản xuất ethanol hệ thứ ba sau tinh bột lignocellulose Rong biển có sinh khối lớn, không cạnh tranh với lương thực, không chiếm diện tích đất canh tác nên xem nguồn nguyên liệu phù hợp để sản xuất ethanol Giống rong biển Chaetomorpha sp có mặt tự nhiên với số lượng lớn khắp ao hồ nuôi tôm quảng canh tỉnh Tây Nam Bộ Sau thu hoạch thủy sản, lồi rong thường bị bỏ phí gây ô nhiễm môi trường Việc nghiên cứu thu nhận sản phẩm có giá trị từ lồi rong tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có để tạo sản phẩm có giá trị gia tăng Với tiền đề yêu cầu thực tiễn nêu trên, tiến hành nghiên cứu sử dụng sinh khối rong nước lợ Chaetomorpha sp làm nguyên liệu để sản xuất ethanol sinh học Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát chi tiết thành phần hóa học rong để làm sở cho việc chọn lựa phương pháp xử lý rong thích hợp - Nghiên cứu phương pháp tiền xử lý sinh khối rong để làm tăng tỷ lệ carbohydrate rong Chaetomorpha sp tạo điều kiện thuận lợi cho trình lên men ethanol - Nghiên cứu chuyển hóa sinh khối rong thành ethanol số phương pháp khác so sánh hiệu chúng: Phương pháp đường hóa lên men tách biệt (SHF); phương pháp đường hóa lên men đồng thời (SSF); phương pháp kết hợp SHF-SSF Những đóng góp luận án Về mặt khoa học: - Xác định thành phần hóa học rong, làm sở cho việc sử dụng phương pháp chuyển hóa rong thành ethanol thích hợp - Xác định quy luật tiền xử lý rong Chaetomorpha sp hợp chất hóa học (NaOH, H2SO4) kết hợp với điều kiện vật lý nhiệt độ siêu âm nhằm nâng cao hàm lượng polysaccharide làm giảm cấu trúc tinh thể rong - Xác định quy luật chuyển hóa rong Chaetomorpha sp thành ethanol phương pháp SHF, SSF kết hợp SHF-SSF Về mặt thực tiễn: - Xác định chi tiết thành phần hóa học rong đặc biệt liên kết glycoside - Xác định tham số công nghệ cho trình tiền xử lý rong Chaetomorpha sp NaOH kết hợp với sóng siêu âm để nâng cao hàm lượng polysaccharide rong - Xác định tham số cơng nghệ cho q trình tiền xử lý rong Chaetomorpha sp H2SO4 kết hợp nhiệt độ cao để loại bỏ phần lớn cấu trúc tinh thể rong - Xác định tham số kỹ thuật cho q trình chuyển hóa rong Chaetomorpha sp thành ethanol theo phương pháp SHF, SSF kết hợp SHF-SSF Cấu trúc luận án Luận án trình bày 109 trang bao gồm nội dung: Mở đầu (2 trang), Tổng quan (18 trang), Nguyên liệu phương pháp (25 trang), Kết biện luận (61 trang) Kết luận (3 trang) NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương TỔNG QUAN Rong Chaetomorpha sp đồng sông Cửu Long Theo kết khảo sát cho thấy, Chaetomorpha sp thường tìm thấy ao ni tôm nước lợ quảng canh kênh mương khu vực Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) Đến nay, khoảng 10% diện tích ni tơm quảng canh nước lợ ĐBSCL có Chaetomorpha sp phát triển Hiện nay, lượng nhỏ sinh khối rong mền ĐBSCL sử dụng làm phân bón; lượng lớn sinh khối rong bị vứt bỏ, vừa lãng phí vừa gây nhiễm mơi trường Chính vậy, việc nghiên cứu chuyển hóa rong Chaetomorpha sp.thành sản phẩm có giá trị có tính cấp thiết cao có nhiều ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn Thu nhận ethanol từ sinh khối rong Quy trình sản xuất ethanol từ sinh khối rong: Nguyên liệu→Tiền xử lý→Thủy phân/Đường hóa→Lên men→Ethanol 2.1 Tiền xử lý Các nguyên liệu chứa polysaccharide tương tự cellulose thường có cấu trúc tinh thể nên thường gây khó khăn cho q trình đường hóa enzyme cellulase Tiền xử lý có tác dụng phá vỡ cấu trúc tinh thể nguyên liệu, giúp cho enzyme cellulase dễ dàng hình thành phức enzyme/cơ chất Các trình tiền xử lý thường thực phương pháp vật lý (nhiệt độ cao, nổ nước, nghiền…) xử lý hợp chất hóa học (kiềm, acid, dung dịch ion hóa…) kết hợp vật lý hóa học 2.2 Đường hóa lên men 2.2.1 Phương pháp SHF SHF (Separate Hydrolysis and Fermentation) phương pháp th ủy phân nguyên liệu thành đường enzyme acid sau lên men đường vi sinh vật để thu nhận ethanol 2.2.2 Phương pháp SSF SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) trình mà trình thủy phân nguyên liệu thành đường enzyme thực song song với trình lên men ethanol vi sinh vật Ưu điểm phương pháp rút ngắn đươc thời gian, đường tạo từ trình thủy phân enzyme chuyển hóa thành ethanol Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất thiết bị - Rong Chaetomorpha sp thu nhận ao nuôi tôm nước lợ quảng canh tỉnh Bạc Liêu Rong làm sấy nhiệt độ 50 oC tới độ ẩm xấp xỉ 10% - Hóa chất: Dung dịch H2SO4, thuốc thử DNS, methanol, acetonitril, ethanol tuyệt đối (Merck-Đức); NaOH, Ca(OH)2, K-Na tartrate (Xilong-Trung Quốc); kit GOD-PAP 6x250 (Biolabo-Pháp) - Enzyme: Chế phẩm Cellic Ctec2 (Novozyme, Đan Mạch), dung dịch có hoạt lực endoglucanase 150 FPU/mL (Filter Paper Unit) Ch ế phẩm Novozyme 188 (Sigma Aldrich, Mỹ) dạng dung dịch có hoạt lực βglucosidase khơng thấp 300 CBU/mL (CelloBiase Unit) - Nấm men: chế phẩm nấm men ThermoSacc® DRY (LBDS-Mỹ) chứa lồi Saccharomyces cerevisiae dạng khơ có độ ẩm không 5%, số lượng tế bào sống trung bình 2×1010/g - Sự chuyển hóa hợp chất chứa carbon trình lên mem - So sánh hiệu phương pháp 3.4 So sánh phương pháp - Nồng độ chất - Hàm lượng enzyme endoglucanase - Hàm lượng enzyme β-glucosidase - Nhiệt độ - Mật độ nấm men - Thời gian 3.2 Phương pháp đường hóa lên men đồng thời (SSF) - Công suất siêu âm - Thời gian siêu âm - Nồng độ chất bổ sung - Hàm lượng enzyme endoglucanase bổ sung - Hàm lượng β-glucosidase bổ sung - Mật độ nấm men - Thời gian 3.3 Phương pháp kết hợp SHF-SSF - Tỷ lệ nguyên liệu:dung dịch H2SO4 - Nồng độ dung dịch H2SO4 - Nhiệt độ xử lý - Thời gian xử lý Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu q trình chuyển hóa rong Chaetomorpha sp thành ethanol - Nhiệt độ - Mật độ nấm men - Thời gian lên men Lên men - Tỷ lệ nguyên liệu - Hàm lượng enzyme endoglucanase - Hàm lượng enzyme β-glucosidase - Thời gian đường hóa Đường hóa 3.1 Phương pháp đường hóa lên men tách biệt (SHF) - Tỷ lệ nguyên liệu:dung môi NaOH - Nồng độ dung môi NaOH - Nhiệt độ xử lý - Thời gian xử lý Nghiên cứu trình đường hóa lên men để thu nhận ethanol 2.3 Tiền xử lý rong lần dung dịch H2SO4 để phá vỡ cấu trúc tinh thể sinh khối Nghiên cứu trình tiền xử lý rong 2.2 Sử dụng sóng siêu âm hỗ trợ q trình tiền xử lý rong lần dung dịch NaOH để tách protein khống Khảo sát thành phần hóa học rong 2.1 Tiền xử lý rong lần dung dịch NaOH để tách protein khoáng Rong Chaetomorpha sp - Thiết bị: Thùng gia nhiệt Sandbath ống phản ứng thép không rỉ (Techne, Mỹ), bể ổn nhiệt Elma S300H (Elma Hans Schmidbauer GmbH & Co KG, Đức), máy siêu âm Vibra-Cell VCX 750 (Sonics, Mỹ), máy lắc ổn nhiệt Innova 4230 (New Brunswick Scientific, Mỹ), hệ thống HPLC đầu dò RI (Water, Nhật) dùng cột phân tích HPX 87H (BioRad, Mỹ), máy quang phổ UV – Vis 8453 (Agilent, Mỹ), máy đo phân bố kích thước hạt LA-920 (Horiba, Nhật), máy đo nhiễu xạ tia X D8 Advance (Brucker, Mỹ), kính hiển vi điện tử quét JSM-7401F (Jeol, Đức) 2.2 Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm bố trí theo sơ đồ hình 2.1, sử dụng phương pháp xác định yếu tố tối ưu theo phương pháp cổ điển 2.3 Phương pháp phân tích Tổng lượng polysaccharide định lượng phương pháp thủy phân Protein tổng định lượng phương pháp Kjeldahl Tro tổng định lượng phương pháp nung Tổng lượng đường khử định lượng theo phương pháp quang phổ so màu sử dụng thuốc thử acid 3,5dinintrosalicylic Phương pháp ICP/OES dùng để xác định thành phần khoáng Phương pháp GC/MS dùng để xác định thành phần liên kết glycosid acid amin rong Hàm lượng đường glucose xác định phương pháp enzyme với chế phẩm glucose-oxydase Ethanol số loại đường đơn khác định lượng phương pháp HPLC Sự phân bố kích thước hạt (PSD) rong xác định phương pháp tán xạ laser (LDS) Hình dạng hạt nguyên liệu quan sát kính hiển vi điện tử quét Tổng lượng carbon hữu xác định phương pháp chuẩn độ Walkley-Black có hiệu chỉnh Chỉ số tinh thể (CrICrystallization Index) ngun liệu tính tốn từ phổ nhiễu xạ tia X nguyên liệu rong dạt bột mịn Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Khảo sát thành phần hóa học rong Chaetomorpha sp Bảng 3.1 Thành phần hóa học rong Chaetomorpha sp (g/100g chất khô) Mẫu Chaetomorpha sp Lipid Protein Polysaccharide Tro khoáng Thành phần khác* 3,38±0,08 12,7±0,30 47,26±1,75 29,26±1,29 7,40±0,15 4,47±0,05 20,9±0,45 40,29±1,64 28,55±1,34 5,79±0,17 Mùa khô (tháng đến 4) Mùa mưa (tháng đến 8) *Thành phần khác bao gồm chất màu chlorophyll, carotenoid, hợp chất phenolic… Rong Chaetomorpha sp có hàm lượng polysaccharide tương đối cao (khoảng 40-47%), hàm lượng lipid thấp (3-4%) hàm lượng protein mức độ trung bình (13-21%) Điểm lưu ý là, mẫu rong có hàm lượng khoáng (tro tổng) cao, lên tới 28-29% 3.1.1 Thành phần polysaccharide Kết bảng 3.2 cho thấy, hàm lượng glucose chiếm tỷ lệ lớn (7074%) so với tổng lượng đường đơn có carbohydrate rong Chaetomorpha sp Liên kết 1,4-glucopyrasosyl có tỷ lệ lên đến 74,4%; điều cho thấy sở cho việc chọn lựa hệ enzyme thích hợp để thủy phân liên kết Tuy nhiên, kết cho thấy lượng đáng kể loại liên kết glycoside khác nhau, chứng tỏ polysaccharide rong có cấu trúc khác phức tạp Bảng 3.2 Các loại liên kết glycoside carbohydrate rong Chaetomorpha sp Các gốc Glycosyl Các liên kết mạch thẳng Tỷ lệ (%) Gốc Rhamnopyranosyl đầu mạch (t-Rha) 0,2 Gốc Arabinofuranosyl đầu mạch (t-Araf) 0,1 Gốc liên kết 2- Rhamnopyranosyl 0,1 Gốc Manopyranosyl đầu mạch (t-Man) 2,2 Gốc Glucopyranosyl đầu mạch (t-Glc) 4,6 Gốc Galactopyranosyl đầu mạch (t-Gal) 3,5 Gốc 3-Glucopyranosyl + Gốc 2,4-Rhamnopyranosyl (3-Glc + 2,4-Rha) Gốc liên kết 2-Glucopyranosyl (2-Glc) 1,3 Gốc liên kết 3-Glucopyranosyl (3-Gal) 0,2 Gốc liên kết - Manopyranosyl (4-Manl) 0,6 Gốc liên kết - Manopyranosyl (6-Manl) 2,0 Gốc liên kết - Glucopyranosyl (6-Glc) 1,1 Gốc liên kết – Glucopyranosyl (4-Glc) 74,4 Gốc liên kết - Galactopyranosyl (6-Gal) 1,7 0,4 Các liên kết mạch nhánh Gốc liên kết 3,4 - Glucopyranosyl (3,4-Glc) 1,2 Gốc liên kết 2,4 - Manopyranosyl (2,4-Manl) 0,1 Gốc liên kết 2,4 - Glucopyranosyl (2,4-Glc) 0,7 Gốc liên kết 2,3,4 - Xylopyranosyl (2,3,4-Xyl) 0,8 Gốc liên kết 4,6 - Glucopyranosyl (4,6-Glc) 1,7 Gốc liên kết 2,3,4,6 - Glucopyranosyl (2,3,4,6-Glc) 3,2 3.1.2 Thành phần acid amin protein Theo kết bảng 3.3 cho thấy, aspartic acid glutamic acid hai acid amin chiếm tỷ lệ cao 12,1% 12,6% Bên cạnh đó, tổng hàm lượng acid amin thiết yếu chiếm đến 42,11% so với tổng lượng Hình 3.2 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét bề mặt hạt rong trước (trái) sau trình tiền xử lý dung dịch NaOH 3.1.2 Tiền xử lý rong sóng siêu âm dung dịch NaOH Bảng 3.7 So sánh trình tiền xử lý rong để tách protein khống dung dịch NaOH khơng có có sóng siêu âm hỗ trợ Thơng số Khơng có sóng Có sóng siêu siêu âm hỗ trợ âm hỗ trợ Nồng độ dung dịch NaOH (%) Tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w:v) 1:25 Công suất siêu âm (W/g) 45 Thời gian siêu âm (phút) Nhiệt độ (oC) 60 Thời gian xử lý NaOH (phút) 60 Tỷ lệ polysaccharide rong (%) 58,4 a ± 0,8 72,3 b ± 1,1 Tỷ lệ protein rong (%) 5,3 a ± 0,2 2,5 b ± 0,2 Tỷ lệ khoáng rong (%) 13,8 b ±0,3 8,2 a ± 0,2 445 b 344a 276 a 308b 75 b 71a Kích thước hạt nguyên liệu sau trình tiền xử lý (μm) Tổng diện tích bề mặt hạt sau q trình tiền xử lý (cm2 /cm3) Chỉ số tinh thể hóa (CrICrystalinity Index) (%) 11 Nguyên liệu xử lý siêu âm trước đưa vào xử lý NaOH để loại protein khống Khoảng khảo sát sau:cơng suất siêu âm thay đổi từ đến 45 W/g nguyên liệu thời gian siêu âm từ đến phút Kết thí nghiệm thu cho thấy, so với mẫu khơng xử lý siêu âm loại thêm protein khoáng rong 53 47%; đồng thời làm tăng thêm 24% lượng polysaccharide cịn lại rong Bên cạnh đó, sóng siêu âm góp phần làm đứt gãy thêm phần sợi polysaccharide nên kích thước trung bình hạt rong giảm 23%, ngược lại tổng diện tích bề mặt riêng tăng thêm 12%; bề mặt hạt rong xuất nhiều bó sợi polysaccharide (Bảng 3.7, hình 3.3, 3.4) Hình 3.3 Giản đồ phân bố kích thuớc hạt rong sau trình tiền xử lý NaOH (trái) NaOH kết hợp với sóng siêu âm (phải) Hình 3.4 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét bề mặt hạt rong sau trình tiền xử lý NaOH (trái) NaOH kết hợp với sóng siêu âm (phải) 3.1.3 Tiền xử lý rong dung dịch H2SO4 Rong sau tiền xử lý NaOH tiếp tục tiền xử lý H2SO4 để phá vỡ cấu trúc tinh thể polysaccharide rong Với điều kiện kỹ thuật thay đổi sau: nồng độ dung dịch H2SO4 thay đổi từ 12 đến 1,75% (w/v), tỷ lệ nguyên liệu rong dung dịch H2SO4 từ đến 15% (w/v), nhiệt độ xử lý từ 110 đến 140 oC thời gian tiền xử lý từ 15 đến 75 phút Kết thu phần nguyên liệu bị thủy phân thành đường khử hòa tan với hàm lượng 20,2g/L phần đường khử bị chuyển hóa thành HMF (Hydroxymethylfurfural) điều kiện thích hợp nồng độ H2SO4 1,75%, tỷ lệ nguyên liệu dung dịch H2SO4 12,5%, nhiệt độ tiền xử lý 120 oC thời gian tiền xử lý 30 phút Bên cạnh đó, số tinh thể nguyên liệu bị giảm 34% so với mẫu xử lý với NaOH siêu âm Ngồi ra, kích thước trung bình hạt rong giảm thêm 4,1 lần tổng diện tích bề mặt hạt tăng gấp 4,8 lần (Hình 3.5) Hình 3.6 cịn cho thấy xuất số lỗ xốp nhiều bó sợi polysaccharide bề mặt hạt nguyên liệu Hình 3.5 Giản đồ phân bố kích thước hạt rong sau trình tiền xử lý với dung dịch H2SO4 Hình 3.6 Ảnh chụp SEM bề mặt sợi rong sau trình tiền xử lý với dung dịch H2SO4 3.2 Chuyển hóa sinh khối rong thành ethanol phương pháp SHF 3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình đường hóa Ngun liệu sau q trình tiền xử lý NaOH kết hợp siêu âm H2SO4 sử dụng để tiến hành q trình đường hóa với tham số khảo sát sau: tỷ lệ nguyên liệu từ đến 15% (w/v), lượng enzyme endoglucanase sử dụng từ đến 40 FPU/g nguyên liệu, lượng enzyme βglucosidase từ đến 25 CBU/g thời gian thủy phân từ đến 60 Các 13 giá trị tối ưu chọn tỷ lệ nguyên liệu 10%, lượng enzyme endoglucanase β-glucosidase sử dụng 30 FPU/g 10 CBU/g nguyên liệu thời gian 40 giờ, kết thu dung dịch có hàm lượng đường khử 65,5 g/L, lượng glucose dung dịch 39,6 g/L, bên cạnh hàm lượng HMF tăng thêm đạt 174 mg/L (Hình 3.7) Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian đến q trình đường hóa 3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian đến phương pháp lên men SHF Sau thu dịch thủy phân từ rong, tiến hành trình lên men dịch dường chủng nấm men ThermoSacc®Dry Các tham số khảo sát nhiệt độ lên men từ 25 đến 35 oC, mật độ nấm men từ đến 20×106 CFU/mL thời gian lên men từ đến 48 Các tham số phù hợp cho trình lên 14 men nhiệt độ 35 oC, mật độ nấm men 10×106 CFU/mL thời gian lên men 40 với kết thu dung dịch có hàm lượng ethanol 1,83% (v/v) ứng với hiệu suất lên men 54,8% (Hình 3.8) 3.3 Chuyển hóa sinh khối rong thành ethanol phương pháp SSF Nguyên liệu sau tiền xử lý NaOH kết hợp siêu âm H2SO4 đưa vào q trình đường hóa lên men đồng thời với tham số kỹ thuật khảo sát sau: tỷ lệ nguyên liệu thay đổi từ 5-10% (w/v), nồng độ enzyme endoglucanase β-glucosidase đến 30 FPU/g đến CBU/g nguyên liệu, nhiệt độ lên men từ 32 đến 42 oC, mật độ nấm men từ đến 25×106 CFU/mL thời gian lên men từ đến 72 Kết nghiên cứu chọn tham số kỹ thuật thích hợp bao gồm tỷ lệ nguyên liệu 9%, hai enzyme endoglucanase β-glucosidase sử dụng 25 FPU/g CBU/g nguyên liệu, nhiệt độ lên men 38 oC, mật độ nấm men 10×106 CFU/mL thời gian lên men thích hợp 36 Hàm lượng ethanol tối ưu thu nghiên cứu 2,1% (v/v) với hiệu suất lên men 70,0% (Hình 3.9) Hình 3.9 Ảnh hưởng thời gian đến q trình lên men SSF 15 3.4 Chuyển hóa sinh khối rong Chaetomorpha sp thành ethanol phương pháp kết hợp SHF-SSF Q trình đường hóa thực theo tham số xác định phương pháp SHF Dịch đường sau đường hóa rong bổ sung thêm rong chưa qua đường hóa, enzyme endoglucanase, enzyme βglucosidase với lượng nấm men thích hợp tiến hành q trình đường hóa lên men đồng thời nhiệt độ 38 oC Các tham số khảo sát lượng rong nguyên liệu bổ sung thay đổi từ 25 đến 100% so với lượng nguyên liệu ban đầu đường hóa, enzyme endoglucanase từ 10 đến 25 FPU/g β-glucosidase từ đến CBU/g nguyên liệu bổ sung, mật độ nấm men từ 10 đến 25×106 CFU/mL thời gian lên men từ đến 48 Hình 3.10 Ảnh hưởng thời gian đến trình lên men theo phương pháp kết hợp SHF-SSF Kết thu hàm lượng ethanol cao với tham số có giá trị 37,5% nguyên liệu bổ sung, 20 FPU/g endoglucanase, CBU/g βglucosidase, mật độ nấm men 20×106 CFU/mL thời gian lên men 36 giờ; hàm lượng ethanol thu 3,93% (v/v) với hiệu suất lên men 89,6% Điều cho thấy việc gia tăng hàm lượng nguyên liệu đầu vào 16 với việc sử dụng enzyme nấm men thích hợp giúp cho hiệu chuyển hóa nguyên liệu cao Hiệu suất chuyển hóa cao giúp gia tăng hàm lượng ethanol (Hình 3.10) 3.5 Sự chuyển hóa thành phần chứa carbon trình 3.5.1 Phương pháp SHF Khi bắt đầu trình lên men, hàm lượng carbon polysaccharide không tan, cellooligosaccharide glucose chiếm tỷ lệ 15,8%, 33,2% 15,8%; lượng carbon nấm men giống chiếm 0,3% tổng lượng carbon Lượng C thành phần canh trường (g/L) canh trường 40 35 30 25 20 15 10 0 12 16 20 24 28 32 36 40 Thời gian lên men (giờ) Polysaccharide Cellooligosaccharide Glucose Ethanol CO2 Nấm men Hình 3.11 Sự chuyển hóa thành phần chứa carbon phương pháp lên men SHF Sau lên men đầu tiên, hàm lượng carbon glucose giảm 48,8% so với ban đầu lượng carbon sinh khối nấm men tăng thêm 17,2% so với tổng lượng carbon sinh khối sinh trình lên men Ethanol tạo thành lên men lượng carbon ethanol chiếm 19,6% so với tổng lượng carbon ethanol trình lên men kết thúc Lượng CO2 sinh giai đoạn chiếm 53,6% tổng lượng CO2 sinh trình lên men khảo sát Bên cạnh đó, phần polysaccharide khơng hịa tan hợp chất cellooligosaccharide canh trường chuyển hóa chậm; lượng carbon polysaccharide cellooligosaccharide giảm 5,9% 10,2% so 17 với ban đầu Từ thứ đến thứ 28 giai đoạn mà ethanol CO2 sinh nhiều nhất; hàm lượng carbon ethanol CO2 lên men thứ 28 đạt tỷ lệ 90,2% 96,1% so với tổng lượng carbon ethanol CO2 sinh trình lên men Hàm lượng carbon cellooligosaccharide polysaccharide giảm 32,1% 30,0% so với thời điểm bắt đầu trình lên men Từ thứ 28 đến thứ 40, lượng carbon cellooligosaccharide giảm 39,9% so với thời điểm bắt đầu lên men, polysaccharide không thủy phân thêm Lượng carbon ethanol CO2 lên men thứ 40 tăng 10,9% 5,1% so với lên men thứ 28; lượng carbon sinh khối tăng thêm 5,2% thứ 40 so với thứ 28 Có xấp xỉ 55,8% lượng carbon thành phần chất môi trường ban đầu chuyển hóa thành sản phẩm trình lên men, với tỷ lệ lượng carbon ethanol CO2 phương pháp SSF 1:1,5 Luojng C thành phần canh trường (g/L) 3.5.2 Phương pháp SSF 35 30 25 20 15 10 0 12 16 20 24 28 32 36 Thời gian lên men (giờ) Polysaccharide Cellooligosaccharide Glucose Ethanol CO2 Nấm men Hình 3.12 Sự chuyển hóa thành phần chứa carbon phương pháp lên men SSF Hàm lượng carbon polysaccharide, cellooligosaccharide glucose 66,0%, 26,6% 7,1% so với tổng lượng carbon nguyên liệu ban đầu Lượng carbon sinh khối nấm men chiếm xấp xỉ 0,3% so với tổng lượng carbon canh trường 18 Trong 12 đầu tiên, hàm lượng carbon polysaccharide giảm 71,3% hàm lượng cellooligosaccharide tăng thêm 76,1% so với ban đầu Lượng carbon glucose tăng thêm 116% đầu; nhiên, từ thứ đến thứ 12 hàm lượng carbon glucose bị giảm đi; lượng carbon ethanol, CO2 sinh khối nấm men đạt 10,4%, 16,4 4,8% so với tổng lượng carbon chúng sinh suốt trình lên men Từ thứ 12 đến thứ 36, lượng carbon ethanol CO2 tăng liên tục biến đổi lượng carbon polysaccharide, cellooligosaccharide glucose xảy theo quy luật khác Từ lên men thứ 12 trở đi, hàm lượng carbon polysacchride giảm dần, lên men thứ 24 giảm 82,1% so với ban đầu sau khơng thay đổi Lượng cellooligosaccharide giảm liên tục từ thứ 12 đến lên men thứ 36, giảm 29,2% giai đoạn này; lượng carbon glucose giảm 71,4% khoảng thời gian từ lên men thứ 12 đến thứ 20 Có xấp xỉ 56,3% lượng carbon nguyên liệu chuyển hóa thành sản phẩm lên men Tỷ lệ lượng carbon ethanol CO2 1:0,8 3.5.3 Phương pháp kết hợp SHF-SSF Ở thời điểm bắt đầu trình, hàm lượng carbon polysaccharide, cellooligosaccharide glucose chiếm tỷ lệ 31,0%, 38,7% 29,9% so với tổng lượng carbon có canh trường Lượng carbon nấm men giống chiếm tỷ lệ 0,5% so với tổng lượng carbon môi trường ban đầu Trong 12 đầu tiên, lượng carbon polysaccharide glucose giảm 46,3% 82,1% lượng carbon cellooligosaccharide tăng thêm 22,0% so với ban đầu Khi đó, lượng carbon ethanol, CO2 sinh khối nấm men tăng thêm chiếm tỷ lệ 41,3%, 52,1% 50,0% so với tổng lượng carbon chúng sinh suốt trình lên men 19 Lượng C thành phần canh trường (g/L) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 0 12 16 20 24 28 32 36 Thời gian lên men (giờ) Polysaccharide Cellooligosaccharide Glucose Ethanol CO2 Nấm men Hình 3.13 Sự chuyển hóa thành phần có chứa carbon phương pháp lên men kết hợp SHF-SSF Từ lên men thứ 12 đến lên men thứ 36, trình thủy phân polysaccharide cellooligosaccharide tiếp diễn Ở lên men thứ 32, lượng carbon polysaccharide lại 28,2% so với ban đầu không thay đổi kết thúc q trình lên men Bên cạnh đó, hàm lượng carbon cellooligosaccharide lên tục giảm trình lên men kết thúc, lượng carbon cellooligosaccharide canh trường lại 60,9% so với ban đầu Từ lên men thứ 12 đến lên men thứ 28, lượng carbon glucose liên tục giảm không đổi từ thứ 28 trở đi, xấp xỉ 2,7% so với ban đầu; lượng carbon ethanol, CO2 sinh khối nấm men tăng thứ 28 đạt tỷ lệ 84,0%, 89,7% 98,1% so với tổng lượng carbon thành phần sinh suốt trình lên men Từ thứ 28 đến thứ 36, lượng carbon glucose sinh khối không đổi lượng carbon ethanol, CO2 tiếp tục tăng thêm Với phương pháp này, 66,8% lượng carbon nguyên liệu chuyển hóa thành sản phẩm với tỷ lệ carbon ethanol CO2 1:0,8 20 3.6 So sánh hiệu phương pháp Bảng 3.26 So sánh hiệu phương pháp lên men Phương pháp SHF SSF Kết hợp SHF-SSF Lượng nguyên liệu Ban đầu 10 10 môi trường Bổ sung 0 37,5% nguyên liệu (% w/v) ban đầu Nồng độ endoglucanase Ban đầu 30 25 30 (FPU/g nguyên liệu) Bổ sung 0 20 FPU/g nguyên liệu bổ sung Nồng độ β-glucosidase Ban đầu 10 10 (CBU/g nguyên liệu) Bổ sung 0 CBU/g nguyên liệu bổ sung Hàm lượng ethanol cuối (% v/v) 1,83 a 2,10 b 3,93 c Hiệu suất lên men (%) 54,8 a 70,0 b 89,6 c YP/S (Ethanol) 0,364 a 0,504 b 0,539 c YP/S (CO2) 0,558 c 0,402 a 0,427 b Tỷ lê Cethanol/CCO2 1:1,5 b 1:0,8 a 1:0,8 a Tổng thời gian trình (giờ) 80 36 76 Thời gian thủy phân (giờ) 40 40 Thời gian lên men (giờ) 40 36 36 Các kết bảng 3.26 cho thấy, phương pháp kết hợp SHF-SSF có ưu điểm vượt trội hiệu suất chuyển hóa chất thành sản phẩm hàm lượng sản phẩm (ethanol) thu so với phương pháp truyền thống chuyển hóa sinh khối rong Chaetomorpha sp thành ethanol 21 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Rong Chaetomorpha sp loại nguyên liệu sử dụng để sản xuất ethanol nhiều sản phẩm có giá trị gia tăng khác Thành phần liên kết glycosid rong có chứa 74,4% liên kết 1,4-glucopyranosyl Đây sở cho việc sử dụng hệ enzyme cellulase thủy phân sinh khối rong thành đường - Rong Chaetomorpha sp cần xử lý trước với dung dịch NaOH sóng siêu âm để làm tăng tỷ lệ polysaccharide trước chuyển hóa thành ethanol Điều kiện xử lý sau: Nồng độ NaOH 1,0% w/v, tỷ lệ rong:dung dịch NaOH 1:25 (w:v), công suất siêu âm 45W/g, thời gian siêu âm phút, thời gian trích ly protein khống 60 phút, nhiệt độ trích ly 60 oC Khi đó, lượng protein, khống kích thước hạt rong giảm 81,8%, 73,2% 31,6% so với ban đầu Sau xử lý, hạt rong chứa xấp xỉ 72% polysaccharide - Rong Chaetomorpha sp cần xử lý với dung dịch H2SO4 để làm tăng hiệu xúc tác hệ enzyme cellulase Điều kiện xử lý sau: Nồng độ H2SO4 1,75% w/v, tỷ lệ rong dung dịch H2SO4 12,5% w/v, nhiệt độ 120 oC thời gian 30 phút Khi đó, kích thước số tinh thể hạt rong bị giảm 83,3% 42,0% so với ban đầu Phương pháp tách protein khoáng cách sử dụng dung dịch NaOH kết hợp với sóng siêu âm làm tăng đáng kể tỉ lệ polysaccharide rong Chaetomorpha sp., từ làm tăng hàm lượng chất để thu nồng độ ethanol dịch lên men cao Bên cạnh đó, việc tách protein cịn góp phần tạo sản phẩm có giá trị từ rong để tiếp tục nghiên cứu ứng dụng loại thực phẩm khác - Đối với phương pháp SHF; q trình đường hóa thực với tỷ lệ rong 10%, nồng độ endoglucanase β-glucosidase 30 FPU/g 10 CBU/g nguyên liệu, thời gian đường hóa 40 giờ; dịch thủy phân có tổng 22 lượng đường khử glucose 65,8 g/L 39,3 g/L; trình lên men tiến hành nhiệt độ 35 oC, mật độ giống cấy 10×106 CFU/mL thời gian 40 giờ; canh trường thu có nồng độ ethanol 1,83% v/v hiệu suất lên men đạt 54,8% - Đối với phương pháp SSF; mơi trường có tỷ lệ rong 9% w/v, nồng độ endoglucanase β-glucosidase 25 FPU/g CBU/g, mật độ giống cấy 10×106 CFU/mL nhiệt độ lên men 38 oC thời gian 36 giờ; canh trường thu có hàm lượng ethanol 2,1% v/v hiệu suất lên men đạt 70,0% - Đối với phương pháp kết hợp SHF-SSF; sử dụng dịch rong đường hóa theo điều kiện phương pháp SHF, bổ sung thêm rong với tỷ lệ 37,5% so với lượng ban đầu, nồng độ endoglucanase β-glucosidase 20 FPU/g CBU/g rong bổ sung, mật độ giống cấy 20×106 CFU/mL, nhiệt độ thời gian lên men 38 oC 36 giờ; canh trường thu có hàm lượng ethanol 3,93% (v/v) hiệu suất lên men 89,6% - Đối với việc khảo sát chuyển hóa thành phần chứa carbon nguyên liệu cho thấy: hai phương pháp SHF SSF có khả chuyển đổi rong nguyên liệu thành sản phẩm tương đương (55,8 56,3) thấp so với phương pháp kết hợp 66,8%; nhiên, với phương pháp SHF tỷ lệ chuyển hóa thành ethanol CO2 1:1,5 thấp nhiều so với hai phương pháp SSF kết hợp SHF-SSF có tỷ lệ 1:0,8 Dù có tỷ lệ chuyển đổi nguyên liệu thành sản phẩm, phương pháp kết hợp cho hiệu suất lên men cao phương pháp SSF 28% vượt trội so với phương pháp SHF 63,5% Trong phương pháp phần lớn nguyên liệu cịn sót lại mơi trường chủ yếu cellooligosaccharide hòa tan Phương pháp kết hợp SHF-SSF cho hiệu lên men cao vượt trội so với phương pháp truyền thống chuyển hóa rong thành ethanol Kết 23 tiền đề cho việc xây dựng phương pháp lên men quy mô công nghiệp để làm tăng khả chuyển hóa sinh khối rong thành ethanol 4.2 Kiến nghị Hướng nghiên cứu đề tài thực tận dụng hợp chất tách q trình chuyển hóa ngun liệu rong thành ethanol protein khống sau q trình tiền xử lý thành phần cịn lại mơi trường lên men sau thu nhận ethanol Việc nghiên cứu sử dụng thành phần góp phần nâng cao hiệu sử dụng sinh khối rong hạn chế chất thải mức thấp Nghiên cứu kết hợp phương pháp tiền xử lý khác như: nổ nước, oxy hóa ẩm, dung dịch ion hóa…để làm giảm số tinh thể rong Chaetomorpha sp.; từ đó, làm tăng hiệu thủy phân hệ enzyme cellulase đối tượng Nghiên cứu chủng vi sinh vật lên men ethanol có khả sử dụng loại đường đơn mà nấm men ThermoSac® DRY khơng lên men (đường 5C xylose, arabinose hay đường 6C rhamnose, mannose…) để cải thiện nồng độ ethanol cuối hiệu suất lên men 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Tạp chí nước N M Hải, B N Minh, Đ T Tuyến, L T H Chuyên, H K Anh L V V Mẫn, "Tối ưu hóa q trình tiền xử lý bã rong Chaetomorpha sp H2SO4 để sử dụng sản xuất ethanol sinh học," Tạp chí Hóa học, vol 6ABC, pp 815-820, 2013 H K Anh, L T H Ánh, B N Minh N M Hải, "Nghiên cứu thành phần hóa học rong nước lợ Chaetomorpha sp khu vực Đồng sông Cửu Long," Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, vol 52, no 5C, pp 247-254, 2014 N M Hải, L V V Mẫn H K Anh, "Ảnh hưởng số yếu tố cơng nghệ đến q trình đường hóa lên men đồng thời sinh khối bã rong Chaetomorpha sp để thu nhận ethanol sinh học," Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, vol 52, no 5C, pp 185-192, 2014 N M Hai, T N Hieu, L V V Man, and H K Anh, "Bioethanol production from Chaetomorpha sp residue by separate hydrolysis and fermentation method," Journal of Science and Technology, vol 53, no 2A, 2015 Bằng độc quyền Giải pháp Cơng nghệ Hữu ích H K Anh, N Q Khánh, L N Vĩnh N M Hải, "Phương pháp đường hóa lên men đồng thời sinh khối rong Chaetomorpha sp.," Việt Nam Patent 2063, 6/18/2019 ... hóa rong Chaetomorpha sp.thành sản phẩm có giá trị có tính cấp thiết cao có nhiều ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn Thu nhận ethanol từ sinh khối rong Quy trình sản xuất ethanol từ sinh khối rong: ... pháp tiền xử lý sinh khối rong để làm tăng tỷ lệ carbohydrate rong Chaetomorpha sp tạo điều kiện thu? ??n lợi cho trình lên men ethanol - Nghiên cứu chuyển hóa sinh khối rong thành ethanol số phương... xuất ethanol sinh học Rong biển xem nguồn nguyên liệu từ sinh vật thủy sinh nhiều nhà khoa học ý đến nguồn nguyên liệu sản xuất ethanol hệ thứ ba sau tinh bột lignocellulose Rong biển có sinh khối