Đánh Giá Đặc Điểm Kháng Staphylococcus Aureus Kháng Methicillin (Mrsa) Của Một Số Dược Liệu Thu Hái Tại Tỉnh Bình Dương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA MAI THỊ NGỌC LAN THANH ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN (MRSA) CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU THU HÁI TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG Ngành: Cơng Nghệ Sinh học Mã số: 62420201 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2022 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM Người hướng dẫn 1: PGS TS Trương Vũ Thanh Người hướng dẫn 2: TS Hoàng Anh Hoàng Phản biện độc lập 1: PGS.TS Phan Thị Phượng Trang Phản biện độc lập 2: PGS.TS Trần Cát Đông Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thi Thu Hoài Phản biện 2: PGS.TS Trần Hùng Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án họp Phòng 504 B4 - Trường ĐH Bách Khoa – ĐHQG-HCM vào lúc 14 00 ngày 04 tháng 07 năm 2022 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Tạp chí quốc tế T T N L Mai, H A Hoang, and T V Truong, “Antibacterial Activity of Tram Tron Syzygium Glomerulatum Extract against Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus,” Chemical Engineering Transactions, vol 78, pp 235-240, 2020 Tạp chí nước T T N L Mai, T M Phung, V T Nguyen, H A Hoang, and T V Truong, “Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn ethylacetate từ cao ethanol Trâm Tròn (Syzygium glomerulatum) chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA),” Tạp Chí Y học dự phòng, tập 29, số 2, trang 120-128, 2019 T T N L Mai, H A Hoang, and T V Truong, “Hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) cao chiết ethanol thực vật địa Bình Dương,” Tạp Chí Cơng Thương, số 7, trang 324332, 2019 Kỷ yếu hội nghị nước T T N L Mai, A C Dương, G H Lý, H A Hồng, T V Trương “Hoạt tính kháng hình thành Biofilm chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus từ cao phân đoạn Ethyl acetate Trâm Trịn (Syzygium Glomeratum)”, Hội Nghị Cơng nghệ Sinh học Tồn quốc, Viện Cơng nghệ sinh học-Đại học Huế, 2020 T T N L Mai, H T Huỳnh, S Nguyễn, V T Nguyễn, H A Hoàng, T V Trương, “Xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng độc tính kháng biofilm chủng Staphylococcus aureus cao phân đoạn ethyl acetate cò ke (Grewia asiatica L)” , Hội Nghị Cơng nghệ Sinh học Tồn quốc, Viện Công nghệ sinh học-Đại học Huế, 2020 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Tụ cầu vàng kháng methicillin (Staphylococcus aureus kháng methicillinMRSA) vấn đề y tế toàn cầu, thách thức điều trị [1] MRSA có chế kháng với kháng sinh nhóm β-lactam methicillin penicillin làm cho bệnh nhiễm trùng MRSA khó điều trị [2] Năm 2014, quan nghiên cứu y tế chất lượng Hoa Kỳ (AHRQ) công bố gần 375.000 trường hợp nhiễm trùng 23.000 trường hợp tử vong Hoa Kỳ có liên quan đến nhiễm MRSA Chi phí điều trị cho vết mổ sâu bị nhiễm MRSA, ước tính khoảng 43.970 USD cho bệnh nhân từ 65 tuổi trở lên Hoa Kỳ [3] với thời gian điều trị dài, kèm theo thương tật [3, 4] Nghiên cứu 10 nước châu Á tỷ lệ tử vong 30 ngày liên quan viêm phổi bệnh viện dao động từ 18,7 % đến 40,8 %, MRSA chiếm 82,1 % tổng số chủng S aureus phân lập [5] Năm 2017, WHO công bố danh sách mầm bệnh, kiểu hình kháng kháng sinh ưu tiên nghiên cứu phát triển phương pháp điều trị mới, phân chia thành ba mức độ ưu tiên quan trọng, cao trung bình Trong đó, MRSA xếp vào nhóm quan trọng ưu tiên tồn cầu để nghiên cứu phát triển phương pháp điều trị [6] S aureus có nhiều yếu tố độc lực, nguyên nhân gây hàng loạt bệnh nhiễm trùng da, nhiễm trùng máu, viêm phổi, viêm khớp Chủng vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm gây hội chứng sốc độc tố tạo siêu kháng nguyên máu [7] S aureus có nhiều yếu tố độc lực kháng lại phản ứng miễn dịch vật chủ, bao gồm protein bề mặt tế bào, enzyme ngoại bào ngoại độc tố Một đặc điểm quan trọng khác chủng S aureus khả hình thành màng sinh học (biofilm) Màng sinh học tạo vi sinh vật sống bám dính liên kết với bề mặt chất [8] Sự hình thành màng sinh học có vai trò quan trọng tồn tại, kháng lại kháng sinh, trốn tránh hệ miễn dịch vật chủ vi khuẩn [9] Màng sinh học thành phần bao quanh bên ngồi màng có vai trị trở ngại vật lý góp phần cho chế kháng thuốc ngăn chặn xâm nhập tế bào miễn dịch Các độc tố tiết từ màng sinh học S aureus, bao gồm độc tố α (Hla) LukAB, ức chế chức diệt vi khuẩn đại thực bào gây chết tế bào [10] Vancomycin xem tiêu chuẩn vàng cho điều trị bệnh nhiễm khuẩn MRSA [11] Tuy nhiên, chủng MRSA kháng vancomycin (VRSA) chiếm tỉ lệ 6,1% báo cáo [12] Hơn khoảng 30 năm trở lại đây, nhà khoa học chưa thực thành cơng việc tìm loại kháng sinh mới, mà chủ yếu dạng sửa đổi (modify) dựa vào khung nguyên thuốc kháng sinh hệ cũ Đứng trước thực trạng nói trên, việc tìm kiếm nguồn kháng sinh phương pháp để kiểm soát vi khuẩn kháng kháng sinh, đặc biệt dạng siêu kháng thuốc cấp bách [13] Một phương pháp có khả kháng vi khuẩn kháng kháng sinh kết hợp hợp chất thực vật với kháng sinh [14] Hoặc kết hợp hợp chất thực vật với [15] Việt Nam có hệ sinh thái phong phú đa dạng, có tiềm tài nguyên thuốc Thực vật dùng làm thuốc điều trị bệnh cấp tính mãn tính sử dụng từ xa xưa theo đơn thuốc y học cổ truyền Trong đó, hoạt tính kháng khuẩn lồi thực vật ý [16] Bình Dương với 698 lồi thuốc phát hiện, có 140 loài thuốc quý điều tra từ vốn tri thức địa tỉnh báo cáo theo Trần Công Luận cộng với đề tài “Điều tra khảo sát tình hình thuốc tỉnh Bình Dương” nhiều lồi có tác dụng kháng khuẩn [17] Xuất phát từ nguyên nhân nói trên, đề tài: “Đánh giá đặc điểm kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) số dược liệu thu hái tỉnh Bình Dương” tiến hành thực Mục tiêu đề tài, đóng góp mặt khoa học thực tiễn 2.1 Mục tiêu đề tài Sàng lọc cao ethanol toàn phần thực vật thu hái tỉnh Bình Dương kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) Xác định cấu trúc phân tử hoạt chất nhóm hoạt chất thực vật Xác định công thức hợp lực nhóm hợp chất thực vật chế kháng MRSA 2.2 Ý nghĩa khoa học tính luận án Bốn lồi thực vật Bình Dương gồm Trâm Tròn, Xăng Mã, Ngành Ngạnh Nam, Cò Ke báo cáo hoạt tính kháng MRSA ATCC33591 lần đầu Tinh chất dimethyl pinocembrin thu nhận lần đầu từ chi Trâm (Syzygium), tinh chất pinostrobin thu nhận từ Syzygium glomeratum với hiệu suất chiết 12,5 mg pinostrobin 1g bột khô Xác định công thức phối hợp cao phân đoạn thực vật với kháng sinh Trong đó, cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam hợp lực với kháng sinh cefoxitin, giảm 512 lần giá trị MIC kháng sinh Xác định tỉ lệ nồng độ phối hợp pinostrobin với kháng sinh vancomycin 12,8 pinostrobin:0,5 vancomycin (µg/mL) Các cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn, Ngành Ngạnh Nam, Cị Ke có khả ức chế hình thành màng sinh học chủng MRSA Cao phân đoan ethylacetate Trâm Trịn có hoạt tính kháng MRSA với đích tác động yếu tố tổng hợp vách Đích tác động cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam MRSA vách tế bào Cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã có khả ức chế tan huyết chủng MRSA 2.3 Ý nghĩa thực tiễn Luận án góp phần tìm giải pháp kháng MRSA như: Bước đầu xác định hoạt tính kháng khuẩn cao chiết/phân đoạn/tinh chất từ ba loài thưc vật Việt Nam Ngoài ra, khả hợp lực khác nhau: phân đoạn - kháng sinh, tinh chất - kháng sinh, phân đoạn - phân đoạn chứng minh có hiệu góp phần kiểm sốt MRSA thực tiễn Cấu trúc luận án: Luận án gồm có chương Mở đầu Chương Tổng quan Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu Chương Kết biện luận Chương Kết luận kiến nghị CHƯƠNG TỒNG QUAN 1.1 Tổng quan MRSA 1.2 Tổng quan kháng sinh sử dụng điều trị bệnh nhiễm MRSA 1.3 Cao chiết/phân đoạn/tinh chất kháng MRSA 1.3.1 Tóm lược nghiên cứu 1.3.2 Các đích tác động cao chiết/tinh chất 1.4 Tổng quan thực vật 1.4.1 Ngành Ngạnh Nam 1.4.2 Xăng Mã 1.4.3 Trâm Tròn 1.4.4 Cò Ke 1.4.5 Kim Vàng CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hoá chất thí nghiệm MRSA ATCC 33591, MSSA ATCC 6538 Các mẫu dược liệu gồm Ngành Ngạnh Nam, Xăng Mã, Trâm Tròn, Cò Ke, Kim Vàng thu mẫu Thành Phố Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương ( định vị: 11º00’33.02’’ phía bắc, 106º39’00.37’’ phía đơng, độ cao 11m±3m) 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu luận án chia làm phần: Phần Thu nhận cao chiết/phân đoạn/tinh chất Phần Đánh giá khả kháng khuẩn MRSA cao chiết/phân đoạn/tinh chất Phần Cơ chế tác động kháng khuẩn phân đoạn/tinh chất Đồng thời, thử nghiệm khả gây độc tế bào cao chiết hai dòng tế bào nguyên bào sợi tế bào ung thư gan 2.2.1 Thu nhận cao chiết/phân đoạn/tinh chất: Mục đích phần nghiên cứu thu nhận cao thực vật, phân đoạn cho hoạt tính kháng MRSA Sau tiến hành tách tinh chất từ cao thực vật cho hoạt tính kháng MRSA tốt 2.2.2 Đánh giá khả kháng MRSA cao chiết/phân đoạn/tinh chất Mục đích phần nghiên cứu xác định cao thực vật kháng MRSA, xác định giá trị MIC cao phân đoạn, thử nghiệm thời gian diệt khuẩn cao phân đoạn Đồng thời tách tinh chất từ cao thực vật cho hoạt tính kháng MRSA tốt Sau tiến hành đánh giá khả hợp lực phân đoạn với kháng sinh, phân đoạn với phân đoạn, tinh chất với kháng sinh 2.2.3 Cơ chế tác động kháng khuẩn phân đoạn/tinh chất Mục đích phần nghiên cứu nhằm chứng minh đích tác động phân đoạn/tinh chất chủng MRSA 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu IC50 xác định cách sử dụng phần mềm Prism với phương pháp hồi quy khơng tuyến tính đa thơng số R2 > 0.9 Các thí nghiệm lặp lại lần xử lý phần mềm STATGRAPHICS Centurion XV CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Thu cao ethanol toàn phần thực vật, khảo sát hoạt tính kháng MRSA cao ethanol tồn phần thực vật, độc tính tế bào cao Bảng 3.1 Các cao ethanol toàn phần thực vật cho hoạt tính kháng MRSA Tên Thực Vật Stt Tên Thơng Thường Trâm Trịn Cị Ke Xăng Mã Ngành Ngạnh Nam Bộ Phận Sử Dụng Kích thước vịng vơ khuẩn (mm)±SD Lá cành non 9,5±0,5 Lá cành non Lá cành non 7,0±0,0 11,5±0,5 Lá cành non 10,3±0,3 Tên Khoa Học Syzygium Glomerulatum Grewia Asiatica L Carallia Brachiata Cratoxylum Cochinchinense Bốn cao ethanol tồn phần từ Trâm Trịn, Xăng Mã, Ngành Ngạnh Nam, Cị Ke lần báo cáo hoạt tính kháng MRSA Bảng 3.2 Phần trăm gây độc tế bào mẫu cao dòng tế bào ung thư gan Hep G2 nguyên bào sợi xác định phương pháp SRB Dòng tế bào Mẫu Hep G2 SCTTED (100µg/ml) Fibroblas SCTTED (100µg/ml) t cell Hep G2 NN ED (100µg/ml) Fibroblas NN ED (100µg/ml) t cell Hep G2 CK ED (200µg/ml) Fibroblas CK ED (200µg/ml) t cell Hep G2 Fibroblas t cell XM ED (200µg/ml) XM ED (200µg/ml) Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần 36.20 Lần 35.60 Lần 26.62 TB ± ĐLC 32.81 ± 5.36 36.17 36.40 39.53 37.37 ± 1.88 3,20 -0,32 -5,86 -0,99 ± 4,57 -1,28 -2,09 3,72 0,12 ± 3,15 -8,50 -5,38 3,66 -3,41 ± 6,32 1,94 1,12 7,53 3,53 ± 3,49 -5,49 -13,46 ± 7,20 12,90 9,23 ± 3,55 -19,50 5,81 15,38 8,99 TB, ĐLC: trung bình, độ lệch chuẩn dài pha lag chủng MRSA d) Khảo sát hợp lực cao phân đoạn với kháng sinh cefoxitin Mối quan tâm nhà khoa học liệu pháp kháng khuẩn rút ngắn thời gian nghiên cứu hợp chất mới, liệu pháp Thay vào nghiên cứu kết hợp với nhóm kháng sinh hệ cũ bị kháng vi khuẩn, nhằm tái sử dụng điều trị, giảm chi phí đầu tư cho nghiên cứu, tận dụng nguồn nguyên liệu có sẵn Đồng thời hạn chế kiểu hình kháng thuốc vi khuẩn cách kết hợp hướng đến nhiều mục tiêu hoạt tính ức chế vi khuẩn [20] Việc kết hợp giảm giá trị MIC kháng sinh, giảm tác dụng phụ nồng độ sử dụng thấp hai chất có tính hợp lực [51, 52] Bảng 3.4 Chỉ số FIC phân đoạn ethyl acetate thực vật với cefoxitin Vi khuẩn MRSA SCTT Ea MIC (mg/ml) NN Ea 1,625 cefo 1,024 FICI SCTTEa-cefo NN Ea-cefo 0,508 0,312 Ghi chú: NN Ea: cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam; SCTT Ea: cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn; Cefo: kháng sinh cefoxitin Dựa vào Bảng 3.4 xác định số FIC cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn với cefoxitin chủng MRSA 0,5 Vậy, công thức hợp lực cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn với cefoxitin SCTT Ea nồng độ 0,5 mg/mL cefoxitin nồng độ 0,008 mg/mL Trong đó, nồng độ kháng sinh cefoxitin sử dụng 0,008 mg/ml so với giá trị MIC cefoxitin MRSA 1,024 mg/ml, giảm 128 lần; nồng độ cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn 0,5 mg/mL giảm lần so với giá trị MIC cao phân đoạn Khả hợp lực cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam cefoxitin xác định mạnh phân đoạn Trâm Trịn thơng qua số FIC 0,312 trình bày Bảng 3.4 Công thức hợp lực cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam cefoxitin NN Ea nồng độ 0,812 10 mg/mL cefoxitin nồng độ 0,002 mg/mL Khi hai chất có khả hợp lực với đích tác động chúng xác định tương đồng Vì vách tế bào vi khuẩn đích tác động cefoxitin, có khả cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam có đích tác động vách tế bào vi khuẩn MRSA Hoạt tính kháng MRSA tái nhạy với kháng sinh nhóm β-lactam MRSA xử lý với cao phân đoạn ethyNgành Ngạnh Nam lần đầu báo cáo Hai cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã Cò Ke có số FIC lớn khơng có hợp lực hai cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã, Cị ke với cefoxitin hoạt tính kháng MRSA Như vậy, đề tài xác định hai bốn cao thực vật cho hoạt tính hợp lực với kháng sinh cefoxitin chủng MRSA ATCC33591 hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn, Ngành Ngạnh Nam e) Khảo sát hợp lực cao phân đoạn với kháng sinh vancomycin Vancomycin xem tiêu chuẩn vàng điều trị bệnh nhiễm MRSA gây [58, 59] Việc sử dụng vancomycin thường xuyên làm tăng nguy kháng vancomycin chủng MRSA, minh chứng xuất chủng MRSA kháng với vancomycin báo cáo, đề tài lựa chọn hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Trịn Ngành Ngạnh Nam cho hoạt tính kháng MRSA tốt để khảo sát khả hợp lực với vancomycin Kết xác định cao phân đoạn ethylacetate Trâm Trịn có khả hợp lực phần với vancomycin dựa số FIC 0,74 Công thức hợp lực cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn vancomycin xác định nồng độ SCTT Ea nồng độ 0,24 mg/mL vancomycin nồng độ 0,001mg/mL (1:1) Tuy nhiên, cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam với vancomycin có số FIC 2,00, dựa công thức Kuok cộng [45] xác định khơng 11 có hợp lực khả ức chế vi khuẩn MRSA f) Thử nghiệm khả hợp lực cao phân đoạn Các phân đoạn khơng thể hoạt tính phân đoạn nhỏ Điều giải thích chất chuyển hóa thứ cấp giới thực vật thường có hoạt tính kháng khuẩn thấp Nhưng trừ có xẫm nhiễm vi khuẩn thực vật đáp ứng trường hợp bệnh chiến lược hợp lực, chất trao đổi thứ cấp tạo ra, tương tác với để kháng lại vi khuẩn gây bệnh [61] Vì thử nghiệm hợp lực cao phân đoạn tiến hành Bảng 3.5 Chỉ số FIC cao phân đoạn ethyl acetate thực vật MRSA MIC (mg/ml) XM CK SCTT NN Ea Ea Ea Ea 1,625 2,500 2,01 SCTT EaNN Ea 0,2655 FICI SCTT Ea- SCTT Ea- NN EaXM Ea CK Ea XM Ea 0,2578 0,125 0,1562 Dựa vào Bảng 3.5, xác định khả hợp lực mạnh cao phân đoạn ethyl acetate Trâm Tròn với ba cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, Xăng Mã Cò Ke MRSA thông qua số FIC nhỏ 0,5 Công thức hợp lực hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn Ngành Ngạnh Nam SCTT Ea nồng độ 0,015 mg/mL NN Ea nồng độ 0,406 mg/ml Công thức hợp lực hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn Xăng Mã SCTT Ea nồng độ 0,0078 mg/mL XM Ea nồng độ 0,625 mg/mL Công thức hợp lực hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn Cò Ke SCTT Ea nồng độ 0,062 mg/mL CK Ea nồng độ 0,125 mg/mL Cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam cho hoạt tính kháng MRSA mạnh sau cao phân đoạn Trâm Tròn, nên phân đoạn lựa chọn khảo sát hợp lực với cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã Dựa vào Bảng 3.5 Chỉ số FIC xác định 0,156, chứng tỏ khả hợp lực hai cao phân 12 đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam Xăng Mã Công thức hợp lực hai phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam Xăng Mã NN Ea nồng độ 0,06 mg/mL XM Ea nồng độ 0,312 mg/mL Trong bốn lồi thực vật cho hoạt tính kháng MSSA MRSA cao phân đoạn ethylacetate Trâm Trịn với giá trị MIC thấp mg/ml chủng MRSA Do đó, cao ethanol tồn phần Trâm Trịn lựa chọn để xác định thành phần hóa học chính, đồng thời thu nhận hợp chất khác diện cao ethanol toàn phần làm sở khoa học cho việc sử dụng dược liệu, góp phần nâng cao giá trị loại dược liệu Việt Nam 3.3 Thu tinh chất khảo sát hoạt tính kháng MRSA a) Thu nhận tinh chất từ Trâm Tròn Cao phân đoạn n-hexan (0,2 g) với hệ dung mơi n-hexan/EtOAc có tỉ lệ dung môi giải ly tăng % EtOAc hexan (0-100 %) Cột silica gel có chiều cao 9cm, rộng 3,2cm tốc độ dòng 0,2 mL/phút Kết thu 20 phân đoạn đặt tên Hex đến Hex 20 Các phân đoạn định tính khả kháng MRSA Phân đoạn Hex cho hoạt tính kháng MRSA nên tiếp tục đưa lên cột sắc ký silicagel 60 Cột silica gel có chiều cao 15,5 cm, rộng 1,6 cm tốc độ dịng 0,4 mL/phút với hệ dung mơi rửa giải nhexan:CHCl3 có tỉ lệ 5:5 Sau sử dụng phương pháp kết tinh lại CHCl3 n-hexan thu chất kết tinh hình kim khơng màu Dùng TLC để kiểm tra tinh Tạm gọi chất H1.1 (9 mg) So sánh với liệu NMR MS có sẵn [164] khẳng định tinh chất Pinostrobin Hình 3.2 Cấu trúc Pinostrobin 13 Tiến hành sắc kí cột silica gel phân đoạn Hex với dung mơi rửa giải nhexan:CHCl3:EtOAc có tỉ lệ 4:5:1 cột silica gel có chiều cao 16,7cm, rộng 1,6 cm tốc độ dòng 0,5 mL/phút thu chất lỏng màu vàng sáng dung môi rửa giải Sử dụng phương pháp kết tinh lại n-hexan aceton Thu kết tinh màu trắng Dùng TLC kiểm tra tinh Tạm gọi chất H7.1 (2mg) Tinh chất gửi đo NMR để xác định cấu trúc Sau đo khối phổ để xác nhận lại So sánh với liệu NMR MS có sẵn khẳng định dimethyl pinocembrin Hình 3.3 Dimethyl pinocembrin 5,7-dimethoxyflavone Pha ethylacetate (EtOAc) phân chia thành phân đoạn cho giải ly lượng dung môi tăng 25% EtOAc (0% - 100%) hexane, tăng 25% MeOH EtOAc (0% - 100%), thu phân đoạn Hình 3.4 Cơng thức 4-methoxy-benzoic acid E4.1: Hợp chất dạng tinh thể trắng Phân đoạn thứ tư pha EtOAc giải ly với hệ dung môi 25% n-hexane 75% EtOAc, phân đoạn sau đưa lên cột silica gel giải ly hệ nhexane:chloroform:Isopropyl alcohol (8:12:1) Cột silica gel có chiều cao 14,0 cm, rộng 1,6 cm tốc độ dòng 0,4 mL/phút, thu mg tinh thể Kết sau gửi đo NMR để xác định cấu trúc Phổ 1H-NMR thể 14 peak: δH 8.06 (m, 2H), 6.9 (m, 2H), 3.81 (s, 3H) Và 13C-NMR δC 171.32, 164.04, 132.37, 132.34, 121.69, 113.78, 113.74, 55.44 Khối phổ có kết 78, 152, 304, 404 Dựa kết nhận bước đầu xác định có nhóm OMe với peak 1H-NMR 3.81 (s, 3H) 13C-NMR 55.44, khối phổ 31 Ngồi ra, cơng thức đối xứng Dựa kết đó, xác định hợp chất 4-methoxy-benzoic acid Tinh chất pinostrobin nằm tất pha cao ethanol toàn phần Trâm Tròn Hiệu suất chiết pinostrobin phân đoạn ethyl acetate 0,2 g thu 7,3 mg Như vậy, tổng khối lượng pinostrobin thu từ hai phân đoạn hexan ethylacetate 16,1±0,2 mg/0,4 g cao phân đoạn Phân đoạn thứ bảy pha EtOAc giải ly với hệ dung môi 25% EtOAc 75% MeOH, phân đoạn sau đưa lên cột silica gel giải ly hệ n-hexane : ethylacetate (9:1) Cột silica gel có chiều cao 14,0 cm, rộng 1,6 cm tốc độ dòng 0,4 mL/phút Thu 1mg tinh thể, hợp chất dạng tinh thể trắng Tạm gọi chất E7.1 So sánh với liệu NMR MS có sẵn khẳng định acid 3-oxobetulinic acid Hình 3.5 Acid 3-Oxobetulinic acid betulonic Trong phần thu nhận tinh chất, mục tiêu luận án xác định tinh chất cao ethanol thực vật cho hoạt tính kháng MRSA cao nhất, kết thu nhận tinh chất pinostrobin Ngoài ra, kết luận án thu nhận ba tinh chất khác dimethyl pinocembrin, acid 3-Oxobetulinic, 4methoxy-benzoic acid, dimethyl pinocembrin, 4-methoxy-benzoic acid lần đầu thu nhận từ chi Trâm 15 Tinh chất pinostrobin sau phân lập tiếp tục khảo sát hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán đĩa Tuy nhiên, tinh chất cho hoạt tính kháng MRSA yếu Vì vậy, pinostrobin thu nhận từ cao ethanol toàn phần Trâm Tròn tiến hành thử nghiệm khả hợp lực với kháng sinh vancomycin cefoxitin b) Hoạt tính kháng MRSA tinh chất pinostrobin Thử nghiệm khả hợp lực pinostrobin với cefoxitin, vancomycin hai chủng MSSA MRSA tiến hành Kết xác định pinostrobin có hợp lực với vancomycin khơng có hợp lực với cefoxitin Chỉ số FIC pinostrobin vancomycin 0,5 Công thức hợp lực pinostrobin vancomycin pinostrobin nồng độ 12,8 µg/mL vancomycin nồng độ 0,5 µg/mL Điều chứng minh hoạt tính hợp lực cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn với kháng sinh vancomycin có liên quan đến tinh chất pinostrobin 12 11 10 Hình 3.6 Hợp lực pinostrobin với vancomycin Đề tài thực thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành biofilm, ức chế tan huyết, khả chịu muối biểu protein PBP2a tiến hành nội dung 3.3 3.4 Cơ chế kháng MRSA phân đoạn/tinh chất 3.4.1 Ức chế hình thành màng sinh học 16 a) Hai phân đoạn ethyl acetate Trâm Tròn Ngành Ngạnh Nam Thử nghiệm khả ức chế hình thành màng sinh học thực phương pháp nhuộm màu với crystal violet Kết xác định cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam nồng độ 0,25 mg/mL, cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn nồng độ 0,406 mg/mL, cao phân đoạn ethylacetate Cò Ke nồng độ 0,251 mg/mL có khả ức chế hình thành màng sinh học MRSA Dựa kết định cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn Ngành Ngạnh Nam có hoạt tính ức chế hình thành màng sinh học kháng MRSA tốt Nên thí nghiệm ức chế hình thành màng sinh học tiến hành lặp lại cho chụp ảnh SEM nhằm mục đích quan sát hình thái tế bào vi khuẩn biofilm sau xử lý Độ phóng đại x10.0K Độ phóng đại x1.0K Hình 3.7a Biofilm chủng MRSA Độ phóng đại x10.0K Độ phóng đại x1.0K Hình 3.7b Biofilm chủng MRSA (MRSA nuôi môi trường TSB+1%glucose+kháng sinh cefoxitin nồng độ 128µg/mL) 17 Ở mẫu đối chứng, Hình 3.7a MRSA ni mơi trường TSB+1%glucose, Hình 3.7b MRSA nuôi môi trường TSB+1%glucose+kháng sinh cefoxitin nồng độ 128 µg/mL Các màng sinh học hình thành có mật độ tế bào đồng đều, hình thái tế bào rõ trịn, Hình 3.7a Hình 3.7b đối chứng màng sinh học MRSA Trong môi trường TSB 1% glucose bổ sung cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, hình thái tế bào MRSA khác biệt so với đối chứng Độ phóng đại x10.0K (NN Ea1) Độ phóng đại x1.0K (NN Ea1) Độ phóng đại x10.0K (NNEa2) Độ phóng đại x1.0K (NN Ea2) Hình 3.7c Mơi trường TSB+1% glucose bổ sung phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam (NN Ea) nồng độ 0,8125 mg/mL, 0,4062 mg/mL, 0,2031mg/mL Cụ thể, Hình 3.7c Khi mơi trường TSB bổ sung NNEa1 nồng độ 0,8125 mg/mL mật độ tế bào màng sinh học giảm Dựa hình SEM (10.0kV 7.9mm x10.0K) hình thái MRSA thay đổi, vách tế bào vi khuẩn bị tổn 18 thương đóng cụm Khi môi trường TSB bổ sung NN Ea2 nồng độ 0,4062 mg/mL hình thái tế bào MRSA màng sinh học cịn đóng cụm, nhiên mật độ tế bào đồng Khi môi trường TSB bổ sung NN Ea3 nồng độ 0,2031 mg/mL, mật độ tế bào đồng đều, hình thái tế bào rõ tương đồng giống so với đối chứng Như vậy, kết cao phân đoạn ethyl acetate Ngành Ngạnh Nam có hoạt tính ức chế hình thành biofilm, vách tế bào đích tác động phân đoạn Dựa vào ảnh chụp SEM Hình 3.7d Mơi trường TSB % glucose bổ sung cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn (SCTT Ea) nồng độ 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,125 mg/mL MRSA xử lý với phân đoạn Trâm Trịn nồng độ mật độ tế bào màng sinh học giảm so với đối chứng Hình thái tế bào MRSA màng sinh học bị thay đổi, tế bào kéo dài, đóng cụm môi trường TSB bổ sung cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn nồng độ 0,5 mg/mL Độ phóng đại x10.0K (SCTT Ea1) Độ phóng đại x1.0K (SCTT Ea1) Hình 3.7d phân đoạn ethylacetate Trâm Trịn (SCTT Ea) nồng độ 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,125 mg/mL Đối với pinostrobin, kết trình bày Hình 3.22e Kết pinostrobin khơng ức chế hình thành biofilm nồng độ khảo sát Hình thái tế bào 19 MRSA mật độ tế bào tương đồng với đối chứng Trong thử nghiệm trước, hai phân đoạn ethyl acetate Trâm Tròn Ngành Ngạnh Nam chứng minh hợp lực mạnh với kháng sinh cefoxitin, hợp lực với Kết ảnh chụp SEM lần chứng minh hai phân đoạn có đích tác động với kháng sinh cefoxitin vách tế bào 3.4.2 Ức chế sinh độc tố tan huyết Những phân tử có liên quan đến xuất tác nhân độc tính vi khuẩn quan tâm, phân tử hạn chế áp lực chọn lọc [169] Hai chủng MSSA MRSA có khả sinh độc tố tan huyết, độc tố nghiên cứu tìm kiếm chất ức chế [170] Do khảo sát khả ức chế độc tố tan huyết tiến hành Đối chứng MRSA MRSA xử lý với cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam MRSA xử lý với cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã Hình 3.8 Ức chế độc tính tan huyết từ cao phân đoạn Xăng Mã Các cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, Trâm Tròn, Xăng Mã, Cò Ke pinostrobin khảo sát khả ức chế sinh độc tố tan huyết hai chủng MSSA MRSA, Kết xác định hai cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã Cị Ke có hoạt tính ức chế độc tính tan huyết MRSA Trong đó, cao phân đoạn ethyl acetate Xăng Mã cho hoạt tính ức chế sinh độc tố tan huyết hoàn toàn chủng MRSA nồng độ mg/mL Kết trình bày Hình 3.8 20 3.4.3 Ức chế biểu protein PBP2a chủng MRSA: Cơ chế kháng Cơ chế kháng kháng sinh phổ biến chủng MRSA lâm sàng biểu gen mecA thơng qua protein PBP2a Sử dụng Kít Latex Agglutination nhằm xác định protein PBP2a chủng MRSA chủng MRSA nuôi môi trường có bổ sung cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, Trâm Tròn, Xăng Mã, Cò Ke pinostrobin Kết xác định hai cao phân đoạn Ngạnh Ngạnh Nam, Trâm Trịn pinostrobin có khả ức chế biểu protein PBP2a MRSA Kết trình bày Hình 3.9 Hai cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã Cị Ke khơng cho hoạt tính ức chế biểu protein PBP2a MRSA trình bày Phụ lục Hình 3.9 Kiểm tra diện PBP2a chủng MRSA Protein PBP2a MRSA có liên quan đến trình tổng hợp vách tế bào MRSA, thử nghiệm ức chế biểu protein PBP2a cao phân đoạn 21 ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, Trâm Tròn, Xăng Mã, Cò Ke pinostrobin kit latex PBP2a, bước đầu định tính PBP2a bị ức chế biểu bới hai cao ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, Trâm Tròn pinostrobin MRSA Do thử nghiệm khả chịu muối MRSA tiến hành nhằm chứng minh vách tế bào đích tác động 3.4.4 Thử nghiệm khả chịu muối MRSA Khả chịu nồng độ muối cao chủng MRSA xác định Do đó, khả chịu đựng với muối tổn thương vách tế bào chủng vi khuẩn Việc xử lý tế bào vi khuẩn với cao phân đoạn/tinh chất nồng độ MIC, ½ MIC giết chết tế bào nhạy cảm, cảm ứng chế chống lại tác nhân stress sinh lý tế bào [73] Tuy nhiên, số ba nghiệm thức gồm cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, Trâm Tròn pinostrobin, kết xác định MRSA giảm khả chịu muối MRSA bị xử lý với cao phân đoạn ethyl acetate Ngành Ngạnh Nam vịng Kết thể Hình 3.10 Thử nghiệm thưc theo mô tả Carson cộng (2002) [73] Môi trường dinh dưỡng (TSA) bổ sung NaCl nồng độ 75g/l, làm giảm khả hình thành khuẩn lạc so với tế bào MRSA không xử lý đến 58,89 %, có khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng Cụ thể, môi trường TSB không bổ sung cao phân đoạn/tinh chất, nghiệm thức đối chứng khả hình thành khuẩn lạc mơi trường TSA-NaCl, MRSA có khả hình thành khuẩn lạc mơi trường TSA-NaCl có nồng độ muối cao đến 96,05±7,34 (%) Ngược lại, môi trường TSB bổ sung cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam nồng độ 1,625 mg/mL mơi trường TSA-NaCl (NaCl nồng độ 75g/L), phần trăm tế bào MRSA sống sót môi trường TSA-NaCl 41,11±7,34 %, so với tế bào MRSA khơng xử lý giảm 58,89 %, có khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng Khi mơi trường TSB có bổ sung cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh 22 Nam nồng độ 0,812 mg/mL phần trăm tế bào MRSA sống sót môi trường TSA-NaCl 65,20±7,34 %, so với tế bào MRSA khơng xử lý giảm 30,85 %, có khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng Như vậy, Thử nghiệm khả chịu muối MRSA xử lý với cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam chứng minh vách tế bào đích tác động phân đoạn 120,00 96,05 100,00 Mật độ tế bào trung bình mơi trường TSA( Log (CFU/ml)) 80,00 65,20 Mật độ tế bào trung bình mơi trường TSANaCl( Log (CFU/ml)) 60,00 41,11 40,00 Tỉ lệ tế bào chịu muối (%) 20,00 8,808,78 6,716,52 6,646,25 0,00 NNEa1 NNEa2 Control MRSA Hình 3.10 Phần trăm tế bào MRSA sống sót Tổng kết lại kết cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, cao phân đoạn cho khả hợp lực với cefoxitin, không cho khả hợp lực với vancomycin; cao phân đoạn định tính ức chế biểu PBP2a MRSA; thử nghiệm khả chịu muối cao phân đoạn làm giảm khả chịu muối MRSA Từ kết chứng tỏ, vách tế bào MRSA đích tác động cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam 23 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau thực đề tài, số kết luận quan trọng sau rút Đề tài xác định bốn lồi thực vật Việt Nam cho hoạt tính kháng MRSA Trong đó, Xăng Mã, Ngành Ngạnh Nam, Trâm Trịn lần đầu báo cáo hoạt tính sinh học Các tinh chất tách cao phân đoạn Trâm Tròn pinostrobin, dimethyl pinocembrin, 4-methoxy-benzoic acid Trong đó, 4-methoxy-benzoic acid, dimethyl pinocembrin lần đầu tách chiết từ chi Trâm Các công thức hợp lực cao phân đoạn kháng sinh cefoxitin, vancomycin xác định Trong đó, phân đoạn ethyl acetate Ngành Ngạnh Nam cho hoạt tính hợp lực mạnh với cefoxitin, tái nhạy với cefoxitin chủng MRSA Đề tài bước đầu xác định đích tác động phân đoạn/tinh chất khả hình thành biofilm, ức chế tan huyết, biểu PBP2a Trong đó, phân đoạn ethyl acetate Ngành Ngạnh Nam có hoạt tính ức chế đường tổng hợp vách tế bào có liên quan PBP2a MRSA xác định Kiểm tra tính an tồn cao chiết hai loại tế bào nguyên bào sợi tế bào ung thư gan Kết xác định cao thực vật khơng có độc tính tế bào hai dịng tế bào kiểm tra Đề tài góp phần cung cấp minh chứng khoa học cho phương pháp dân gian truyền miệng điều trị bệnh 4.2 Kiến nghị ➢ Cần nghiên cứu thêm tinh chất có cao phân đoạn Ngành Ngạnh Nam, Xăng Mã ➢ Xác định chế phân tử độc tố tan huyết với PBP2a, từ làm sở cho xác định chế tác động thuốc ➢ Xác định hoạt tính kháng khuẩn chủng MRSA lâm sàng Việt Nam 24 ... Xuất phát từ nguyên nhân nói trên, đề tài: ? ?Đánh giá đặc điểm kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) số dược liệu thu hái tỉnh Bình Dương? ?? tiến hành thực Mục tiêu đề tài, đóng góp... Mục tiêu đề tài Sàng lọc cao ethanol toàn phần thực vật thu hái tỉnh Bình Dương kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) Xác định cấu trúc phân tử hoạt chất nhóm hoạt chất... tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) cao chiết ethanol thực vật địa Bình Dương, ” Tạp Chí Cơng Thương, số 7, trang 324332, 2019 Kỷ yếu hội nghị nước T T N L Mai, A C Dương,