CHƯƠNG III LẬP TRÌNH CỦA DI TRUYỀN NGOÀI NHÂN DNA (EPIGENETIC)

93 CHƯƠNG III LẬP TRÌNH CỦA DI TRUYỀN NGOÀI NHÂN DNA (EPIGENETIC) 3 1 Định nghĩa epigenetic Khái niệm epigenetic được Waddington đưa ra vào năm 1942, lúc này các tính chất vật lý và vai trò di truyền.

CHƯƠNG III LẬP TRÌNH CỦA DI TRUYỀN NGỒI NHÂN DNA (EPIGENETIC) 3.1 Định nghĩa epigenetic Khái niệm epigenetic Waddington đưa vào năm 1942, lúc tính chất vật lý vai trò di truyền gene chưa khám phá, ông sử dụng epigenetic mơ hình khái niệm cách thức gene tương tác với môi trường xung quanh để tạo kiểu hình Theo Robin Holliday, định nghĩa epigenetic: “là nghiên cứu chế kiểm soát theo thời gian không gian hoạt động gene phát triển phức tạp sinh vật” Như epigenetic dùng để mơ tả điều khác trình tự DNA có ảnh hưởng đến phát triển quan Ngày nay, lập trình epigenetic hiểu thay đổi q trình ngun phân hay giảm phân mà khơng gây nên thay đổi trình tự DNA, tạo tác động quan trọng cho phát triển thành thể (Russo ctv, 1996) 3.2 Cơ sở phân tử epigenetic Ở sinh vật nhân chuẩn, tồn đặc tính cấu trúc NST có ảnh hưởng đến phiên mã gene, thường dạng thường biến DNA hay NST mà di truyền ổn định sang tế bào Những đặc tính gọi ngoại di truyền chúng xuất ngồi phạm vi trình tự DNA trì từ tế bào sang hệ Bởi có đặc tính ngoại di truyền, dạng tế bào khác sinh trưởng mơi trường giữ lại đặc điểm riêng biệt chúng Hình 3.1 Khả phát triển trạng thái epigenetic tế bào Mơ hình C H Waddington epigenetic Các loại tế bào với tiềm phát triển khác (trái) trạng thái epigenetic tương ứng (phải) Sự hạn chế phát triển minh họa viên bi lăn xuống chỗ lõm Màu viên bi tương ứng với trạng thái 93 biệt hóa khác (tím – tồn năng, xanh – đa năng, đỏ - vạn năng, xanh – đơn năng) Quá trình tái lập trình thể mũi tên đứt đoạn (Waddington, 1957) Cơ sở phân tử epigenetic phức tạp, liên quan đến biến đổi kích hoạt gene định, khơng thay đổi cấu trúc DNA Ngồi ra, protein NST kích hoạt tắt Điều giải thích tế bào khác thể sinh vật đa bào biểu gene cần thiết cho hoạt động Epigenetic bảo tồn tế bào phân chia Hầu hết thay đổi epigenetic xảy cá thể, đột biến DNA tinh trùng trứng thụ tinh thay đổi epigenetic truyền đến hệ sau Điều đặt câu hỏi có hay khơng thay đổi epigenetic sinh vật từ thay đổi cấu trúc DNA  Quy trình epigenetic gồm + Paramutation Đặc tính ngoại di truyền nhìn chung mang tính động tiến trình phát triển khơng giữ lại hệ sau hệ kế tiếp, số, tượng cận đột biến (paramutation), di truyền qua nhiều hệ tồn ngoại lệ hoi nằm quy luật chung DNA Cận đột biến tương tác hai allele locus, dẫn đến thay đổi di truyền allele gây allele khác + Bookmarking tượng sinh học có chức chế ngoại di truyền để truyền nhớ tế bào mơ hình biểu gene tế bào, nguyên phân đến tế bào hệ sau Điều quan trọng việc trì kiểu hình dịng tế bào Ví dụ tế bào gan phân chia thành tế bào gan khác loại tế bào khác Đặc điểm bookmarking số trình tự khởi đầu phiên mã gene không bị nén chặt Cơ chế bookmarking: Tại số điểm trước khởi đầu nguyên phân, promoter gene tồn trạng thái có chức phiên mã, bị "đánh dấu" cách “Đánh dấu” tồn sau nguyên phân Các “đánh dấu” truyền đến nhớ biểu gene cách ngăn cản nén chặt DNA locus phân bào, tạo điều kiện lắp ráp lại phức hợp phiên mã promoter, hai Trong số trường hợp, đánh dấu qua trung gian cách liên kết với yếu tố đặc trưng cho promoter trước khởi đầu nguyên phân, trường hợp khác việc đánh dấu thực qua trung gian mơ hình biến đổi histon diện biến thể histon đặc trưng cho gene hoạt động kéo dài suốt trình ngun phân 94 Ví dụ: Sự căng thẳng, cảm ứng gene hsp70 bookmarking hoạt động chế để đảm bảo gene chép vào đầu giai đoạn G1 căng thẳng xảy thời điểm Nếu promoter gene bị nén chặt G1 tế bào phiên mã gene tổng hợp tác nhân bảo vệ tế bào, khiến tế bào tổn thương chết stress + Imprinting tượng di truyền mà số gene biểu cách cụ thể nguồn gốc cha mẹ Gen in dấu biểu allele thừa hưởng từ mẹ (ví dụ: H19 CDKN1C), trường hợp khác allele thừa hưởng từ cha (ví dụ: IGF-2) Gene imprinting epigenetic có liên quan đến q trình methyl hóa sửa đổi histone + Gene im lặng thuật ngữ mô tả epigenetic gene quy định Gene im lặng có khả “tắt” gene chế khác với biến đổi gene Ngoài cịn q trình như: bất hoạt NST X, hiệu ứng vị trí (position effect), lập trình (reprogramming), dị hốn (transvertion), đổi histone, Các kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu epigenetic: chromatin immunoprecipitation (CHIP), fluorescent in situ hybridization (FISH), methyl hóa – enzyme giới hạn nhạy cảm, DNA adenine methyltransferase identification (DamID) trình tự bisulfit, tin sinh học 3.3 Các yếu tố epigenetic ảnh hưởng đến biểu gene Sự cải biên NST bao gồm methyl hóa DNA histone số vị trí, acetyl hóa, phosphoryl hóa ubiquitine hóa histone Sửa đổi histone: protein histone tạo từ chuỗi dài amino acid, amino acid có chuỗi bị thay đổi dẫn đến hình dạng histone bị sửa đổi Các histone sửa đổi kết hợp với DNA theo cách khác Từ tạo tế bào khác biệt không chuyển đổi trở lại tế bào gốc Những nghiên cứu gần chức NST cho thấy có liên hệ chức cao protein cấu trúc NST histone H1 HP1 (heterochromatin associated protein) so sánh NST tế bào vạn NST tế bào biệt hóa Khi histone H1 thay cho vị trí histone H3 liên kết NST chặt tế bào ES biệt hóa Điều cho thấy protein cấu trúc liên kết lỏng lẻo với NST tế bào vạn năng, nên có khả tái xếp lại cấu trúc NST q trình biệt hóa Ngồi ra, gene đặc hiệu mô cho im lặng tế bào chưa biệt hóa nhiều biểu tế bào ES Có domain vừa ngăn cản histone H3-K27me3 (methyl hóa lysine 27 histone 3) vừa kích hoạt H3-K4me3 làm cải biên vùng rộng lớn gene quan trọng mà bình thường im lặng tế bào ES trở thành hoạt động trình biệt hóa Điều quan trọng khơng phải tất gene đặc hiệu mơ có domain này, cấu trúc NST gene tái cấu trúc vạn đặc trưng khác 95 Methyl hóa DNA: chế chung khác điều khiển phiên mã động vật có xương sống, có liên quan đến cấu trúc NST Những phần dư cytosine DNA động vật có xương sống bị biến đổi việc thêm vào nhóm methyl vị trí carbone số base nitơ DNA methyl hóa cặp C-G Sự methyl hóa có liên quan tới việc giảm hoạt tính phiên mã gen chứa nhiều C-G vùng lân cận promoter Sự methyl hóa ức chế phiên mã gen nhờ vào hoạt động protein MeCP2 (methyl CpG binding protein 2) nối cách đặc hiệu tới DNA methyl hóa kìm hãm phiên mã Những chức MeCP2 phức hệ với histone deacetylase, kết hợp với methyl hóa DNA dẫn đến biến đổi acetyl hóa histone cấu trúc nucleosome Sự khử methyl hóa chủ động (active demethylation) xảy vắng mặt nhân tố phiên mã hay chép DNA Do cịn gọi bước suy tàn methyl hóa giai đoạn phơi dâu Quá trình suy giảm kết thiếu vắng DNA methyl transferase, Dnmt1, suốt trình chép Bởi vậy, sau chép mạch DNA vừa tạo nhanh chóng bị methyl hóa Sự khả methyl hóa phụ thuộc chép gọi khử methyl bị động (passive demethylation) Khởi q trình methyl hóa bắt đầu vào chu kì tế bào thứ năm với thời gian sau biệt hóa xảy Hình 3.2 Sự khử methyl DNA gene quan trọng (A) Thành lập mơ hình methyl hóa DNA thụ động, q trình chép cản trở Dnmt ràng buộc ngẫu nhiên yếu tố tái lập trình đến vị trí mục tiêu cách ức chế chức Dnmt1 gián tiếp Hemi-methylated DNA dẫn đến methyl hóa sau chu kì phân chia tế bào tiếp tục (B) Methyl hóa DNA chủ động enzyme demethylase (Azuara V., 2007) Mặc dù methyl hóa DNA ức chế phiên mã, ý nghĩa điều hịa gene chưa rõ ràng Tuy nhiên, methyl hóa DNA có vai trò quan trọng tượng “in dấu hệ gene” (genomic imprinting), điều khiển biểu 96 số gene tham gia trình phát triển phơi động vật có vú Các allele có nguồn gốc từ bố mẹ biểu tế bào lưỡng bội Tuy nhiên, có vài “gene in dấu” biểu phụ thuộc vào di truyền chúng từ bố hay từ mẹ Hoặc có gene đánh dấu thuộc allele có nguồn gốc từ bố biểu Một số trường hợp khác ngược lại Mặc dù vai trị sinh học “genomic imprinting” chưa điển hình, methyl hóa DNA góp phần phân biệt “gene đánh dấu” có nguồn gốc từ bố hay từ mẹ Ví dụ gene H19 phiên mã từ mẹ Gene methyl hóa cách đặc hiệu suốt trình phát triển cái, đực khơng Vì thế, kết hợp trứng tinh trùng thụ tinh sinh hợp tử, phát triển thành phôi chứa allele methyl hóa có nguồn gốc từ bố allele có nguồn gốc từ mẹ khơng methyl hóa Những khác methyl hóa trì tái DNA nhờ vào enzyme methyl hóa trình tự CG mạch DNA hệ con, mạch liên kết với mạch methyl hóa có nguồn gốc từ bố Vì thế, allele chứa gen H19 có nguồn gốc từ bố trì methyl hóa, khơng hoạt động phiên mã tế bào phôi mô soma Tuy nhiên, allele chứa gen H19 có nguồn gốc từ bố khử methyl dịng tế bào mầm phơi, cho phép mơ hình methyl hóa thiết lập cho hệ 3.4 Các vấn đề cần quan tâm Sự tái lập trình ngồi nhân khơng phù hợp dẫn đến hậu bất thường nguy hiểm đến sức khỏe động vật chuyển nhân Phôi từ nguồn tế bào chuyển nhân phải khử methyl có mức độ methyl hóa cao nhân cho để trì tính vạn Sự phân chia sớm bị sai lệch phơi chuyển nhân chiếm tỷ lệ cao thiếu khử methyl Trong tạo dòng từ chuyển nhân, việc tái lập trình epigeneetic cần quan tâm Để cá thể tạo dòng phát triển hồn tồn, gene biểu bình thường suốt q trình phát triển phơi, “im lặng” tế bào soma cho phải tái kích hoạt Hiện nay, hiệu clone từ động vật thấp độc lập với nguồn gốc loại tế bào sử dụng nhân, trừ vài ngoại lệ Những bất thường epigenetic diện clone nguyên nhân gây kiểu hình bất thường động vật clone Những nhân phân tách từ tế bào ES phôi thời kỳ đầu clone có hiệu cao so với loại tế bào soma cho khác Như vậy, gene tế bào thời kỳ đầu dễ dàng cho việc tái lập trình so với tế bào soma Bởi yếu tố cần thiết việc tái lập trình biểu từ làm cho tế bào tạo dịng sống sót 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO Byrne E., Howells D W 2003 Stem cell therapies: a table of caution MJA 179:164-166 Kirschstein R., Skirboll L R (2001) Stem cells: Scientific Progress and Future Research Direction Report of The national Institutes of Health (US) Lerman S 2005 Stem cell research: an overview Pushin’s On 23 (1) Nisbet M C (2004) Public opinion about stem cell researh and human cloning Public Opinion Quarterly 68(1): 121-154 Reya T R., Morrision S J., Clark M R., Weissman I L (2001) Stem cells, cancer and cancer stem cells Nature 144 (1) www.nature.com Rosenfeld J V., Gillet G R Ethics, stem cells and spinal cord repair G 2004 MJA 180:637-639 98 CHƯƠNG IV XÁC ĐỊNH TÍNH ĐA NĂNG CỦA TẾ BÀO Trong vài thập kỷ gần đây, biết nhiều thành tựu quan trọng nghiên cứu tế bào gốc, tính đa tế bào nhân tranh cãi đạo đức nghiên cứu lĩnh vực Nghiên cứu tế bào gốc, tính đa tế bào nhân trang bị cho hiểu biết trình hình thành thể sinh vật từ tế bào đơn lẻ trình tế bào khỏe mạnh thay tế bào bị tổn thương thể trưởng thành, mang lại cho nhân loại hy vọng chữa nhiều bệnh mãn tính nan y mà chưa có biện pháp điều trị hiệu Trong kỷ 21, nhân loại đón đợi liệu pháp điều trị thay tế bào hay tế bào gốc trị liệu Các nghiên cứu thực nghiệm động vật chứng minh liệu pháp điều trị có nhiều chứng cho phép hy vọng vào triển vọng tế bào gốc người Tuy nhiên, công việc giai đoạn gặp khơng khó khăn kỹ thuật vấn đề liên quan đến đạo đức pháp lý Để biết rõ tính đa tế bào vai trò to lớn tính đa trước tiên cần tìm hiểu tế bào tế bào đa năng, gọi tế bào đa Để trả lời câu hỏi tìm hiểu số khái niệm tế bào gốc, tế bào đa năng, tế bào toàn 4.1 Khái niệm Tế bào gốc tế bào chưa biệt hóa, tự tái tạo (self renew) phân chia nhiều lần Trong điều kiện sinh lý, thực nghiệm định, tế bào gốc cảm ứng biệt hóa thành tế bào có chức chuyên biệt tế bào tim, tế bào tuyến tụy, tế bào da, tế bào máu, tế bào thần kinh,… 4.2 Phân loại tế bào gốc Có hai phương pháp phân loại theo nguồn gốc phân lập theo mức độ biệt hóa Theo nguồn gốc, tế bào gốc chia thành hai loại tế bào gốc phôi tế bào gốc trưởng thành Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell) lấy từ phôi, phôi thụ tinh ống nghiệm phôi chuyển cấy nhân Tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell) bao gồm loại: tế bào gốc trưởng thành tủy xương, tế bào gốc trưởng thành hệ thần kinh, tế bào gốc mô máu, tế bào tiền thân da, tế bào gốc tụy gan, tế bào gốc mô mỡ, cuống rốn nước Theo mức độ biệt hóa xếp tế bào gốc thành bốn loại: toàn (hay thủy tổ), vạn năng, đa đơn + Tế bào gốc toàn hay tế bào gốc thủy tổ (totipotent stem cells) Là tế bào có khả biệt hóa thành tất loại tế bào thể từ tế bào ban đầu Tế bào tồn có khả phát triển thành thai nhi, tạo nên thể sinh vật hoàn chỉnh Trứng thụ tinh (hợp tử) tế bào sinh từ lần phân chia tế bào trứng thụ tinh (giai đoạn - tế bào – 99 blastosomer) tế bào gốc tồn năng, có khả phân chia biệt hóa tất dòng tế bào để tạo nên thể sinh vật hồn chỉnh Các tế bào tồn có tiềm to lớn, chúng chuyên biệt hóa thành tế bào vạn mô cần thiết cho phát triển bào thai Quan trọng hơn, tế bào tồn biệt hóa khơng thành tế bào sinh vật mà thành tế bào ngồi phơi liên quan đến sinh vật Ví dụ: tế bào mầm người xem toàn chúng phát triển thành tế bào bên thể hay thành tế bào thai mà không trở thành thành phần bào thai phát triển Điều hướng quan trọng mở tranh cãi + Tế bào gốc vạn (pluripotent stem cells) Là tế bào có khả biệt hóa thành tất tế bào thể có nguồn gốc từ ba mầm phôi trong, ngồi Ba mầm phơi nguồn gốc tất loại tế bào chuyên biệt khác thể Khác với tế bào gốc tồn năng, tế bào gốc vạn khơng thể phát triển thành thai, không tạo nên thể sinh vật hồn chỉnh mà tạo nên tế bào, mô định Các tế bào gốc phôi lấy từ khối tế bào bên (inner cell mass) tế bào gốc vạn + Tế bào gốc đa (multipotent stem cells) Là tế bào có khả biệt hóa thành nhiều loại tế bào thể từ tế bào ban đầu Các tế bào tạo thành nằm hệ tế bào có liên quan mật thiết, ví dụ tạo nên tế bào máu (bao gồm hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu lympho…), tạo nên tế bào hệ thống thần kinh Thường tế bào gốc trưởng thành tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc thần kinh có tính đa năng; điều kiện định, chúng chuyển biệt hóa trở nên có tính vạn Hình 4.1 Tế bào gốc toàn năng, vạn đa (Azuara V., 2006) + Tế bào gốc đơn (mono/unipotential progenitor cells) 100 Tế bào gốc đơn năng, gọi tế bào định hướng đơn dòng hay tế bào đầu dòng (progenitor cells), tế bào gốc có khả biệt hóa theo dịng Ví dụ mẫu tiểu cầu, tế bào định hướng dòng lympho, tế bào định hướng dòng hồng cầu, dòng bạch cầu Trong điều kiện bình thường, tế bào gốc trưởng thành nhiều tổ chức biệt hóa có tính đơn biệt hóa thành dịng tế bào Khả biệt hóa theo dịng cho phép trì trạng thái sẵn sàng tự tái tạo mơ, thay tế bào mơ chết già cỗi tế bào mô 4.3 Đặc điểm sinh học 4.3.1 Tính vạn Tế bào gốc vạn năng, hay đa (pluripotent) có khả biệt hóa tất tế bào thể mà bình thường chúng phát sinh từ ba lớp phôi, trừ tế bào thai Để thẩm định tính đa tế bào, người ta tiến hành dùng tế bào gốc phơi (mES) để thẩm định tính đa với ba thử nghiệm sau: Thử nghiệm 1: tiêm mES vào khoang phơi nang (blastocyst) Sau đó, phơi nang chuyển vào tử cung mẹ giả Nếu mSE vạn năng, hệ khảm, chứa trộn lẫn mơ quan thu nhận từ mSE tế bào có sẵn phôi nang thu nhận Trong vài trường hợp, thai tạo hồn tồn từ mES Tuy nhiên, tế bào mSE tự hình thành thai tế bào ni phơi lại có từ nguồn gốc khác (Nagy cs, 1993) Thử nghiệm 2: tiêm mES vào tinh hoàn hay da, vỏ thận động vật khiếm khuyết miễn dịch Nếu có tính đa năng, sau tiêm tế bào bắt đầu hình thành khối u (teratoma) chứa mô khác phát sinh từ ba phôi Một số cấu trúc dày, lọai cơ, mô thần kinh, xương tóc hình thành chúng xếp cách rối loạn (Martine, 1981) Thử nghiệm 3: biệt hóa in vitro (Wiles, 1993) Sự biệt hóa tự phát xảy tế bào mES nuôi huyền phù khơng có tế bào feeder hay nhân tố ức chế bệnh bạch cầu (leukemia inhibitory factor - LIF) Chúng hình thành nhiều thể phơi (embryoid body) Nếu thể phôi bám đĩa nuôi, chúng biệt hóa thành nhiều kiểu mơ, khối u, 4.3.2 Tính tự làm Tế bào gốc mơ quần thể có khả tự làm Để đạt điều này, tế bào gốc phân chia thành tế bào gốc thay tế bào gọi TAC (transit amplifying cell), phân chia không đồng cách này, số lượng tế bào gốc giữ định 4.3.3 Tính mềm dẻo Tính mềm dẻo tế bào gốc trưởng thành khả tế bào gốc trưởng thành tạo kiểu tế bào biệt hóa mơ khác Các tế bào biệt hóa từ tính mềm dẻo thường có đặc điểm kiểu hình tế bào biệt hóa, biểu đặc điểm lên marker bề mặt 4.4 Những ứng dụng tính đa tế bào 4.4.1 Trong nghiên cứu 101 Để tìm hiểu tác nhân tham gia vào trình định tế bào, tức trình xác định hướng biệt hóa tế bào Ta biết đóng mở gene có vai trị quan trọng q trình này, nhiên cịn biết số lượng loại gene, tác nhân đóng, tác nhân mở Đây phương pháp quan trọng việc tạo cho tế bào qua thao tác gene phát triển thành thể Các thao tác gene thay gene gene khác, đánh bật gene, 4.4.2 Ghép tế bào gốc trị liệu (stem cell therapy) Là dùng tế bào gốc để thay thế, sửa chữa phần thể bị bệnh tổn thương tế bào khỏe mạnh Kỹ thuật gọi kỹ thuật ghép tế bào trị liệu (cell transplantation therapy) hay kỹ thuật thay tế bào trị liệu (cell replacement therapy) a Quy trình ứng dụng tế bào gốc trị liệu bao gồm bước: - Sản xuất dòng tế bào gốc: + Thu tế bào gốc: từ phôi từ tổ chức trưởng thành + Ni cấy tế bào gốc phịng thí nghiệm nhằm nhân lên số lượng - Với tế bào gốc phôi, cần nuôi cấy nhân tạo điều kiện mơi trường lý hóa thích hợp để định hướng biệt hóa thành tế bào mong muốn - Ghép tế bào gốc: đưa tế bào gốc vào khu vực tổn thương cần sửa chữa b Ứng dụng tế bào gốc trưởng thành điều trị Trên lâm sàng, tế bào gốc trưởng thành sử dụng điều trị bệnh tự miễn, tai biến mạch máu não, suy giảm miễn dịch, thiếu máu, nhiễm Estein-barr virus, tổn thương giác mạc, bệnh máu bệnh gan, tạo xương khơng hồn chỉnh, tổn thương tủy sống, liền vết thương da, điều trị ung thư (kết hợp với hóa chất xạ trị), u não, u nguyên bào võng mạc, ung thư buồng trứng, khối u đặc, ung thư tinh hoàn, đa u tủy, ung thư vú, u nguyên bào thần kinh, u lympho Non-Hodgkin, carcinoma tế bào thận, tái tạo tim sau đau tim, tiểu đường type I, tổn thương xương sụn, bệnh Parkinson,… c Ứng dụng tế bào gốc phơi điều trị Tuy có nhiều triển vọng, tế bào gốc phôi chưa dùng tế bào gốc trị liệu người Các bệnh điều trị ghép tế bào có nguồn gốc từ tế bào gốc phôi người bao gồm bệnh Parkinson, đái tháo đường, chấn thương tủy sống, suy tim… Vấn đề điều trị bệnh yêu cầu tế bào gốc phôi phải định hướng biệt hóa thành chủng loại tế bào đặc thù trước ghép Một ưu điểm dùng tế bào gốc phôi so với tế bào gốc trưởng thành tế bào gốc phơi có khả tăng sinh khơng giới hạn in vitro có khả sinh nhiều chủng loại tế bào định hướng biệt hóa Ưu tăng lên q trình ghép tế bào/mơ, tế bào gốc phơi khơng gây kích hoạt q trình 102 Là PCR có chương trình ln nhiệt có nhiệt độ bắt cặp giảm dần 10 hay 20 chu kỳ đầu, sau chu kỳ giảm 0,5-10C để đạt đến nhiệt độ bắt cặp thích hợp mồi (A) (B) (Trích dẫn Phạm Hùng Vân, 2009) Hình 3.6 (A) Chương trình luân nhiệt Touch-Down PCR với nhiệt độ bắt cặp giảm dần (B) Chương trình luân nhiệt Touch-Down PCR với nhiệt độ bắt cặp giảm bước f RT-PCR (reverse transcription PCR) Là phương pháp PCR mà nucleic acid đích cần phải phát RNA (ribonucleic acid) Để thực trước hết RNA đích phải phiên mã ngược thành cDNA sau dùng PCR để khuyếch đại trình tự đích cDNA cặp mồi đặc hiệu cho trình tự (A) (B) (Phạm Hùng Vân, 2009) Hình 3.7 (A) RT-PCR với giai đoạn RT dùng mồi đặc hiệu (B) RT-PCR với giai đoạn RT dùng mồi ngẫu nhiên 183 g Kỹ thuật PCR định lượng (real-time PCR) Là phương pháp khuyếch đại gene hai q trình khuyếch đại gene đọc kết thực ống hay giếng mẫu Kỹ thuật cho phép giảm thời gian chẩn đốn xét nghiệm khơng phải thực công đoạn chạy gene để phát sản phẩm khuyếch đại, đồng thời hạn chế vấy nhiễm hóa chất D Ứng dụng PCR Lập đồ gene; phân loại động, thực vật; kiểm tra huyết thống; chẩn đốn bệnh di truyền; phân tích mẫu DNA cổ; tách dòng gene; định kiểu gene đột biến chẩn đoán bệnh nhiễm trùng (Phạm Hùng Vân, 2009) E Cách thực đọc kết PCR bò sữa bị BLAD (Ribeiro L A ctv, 2000) Lấy mẫu máu: lấy 500 µl huyết tương bị sữa Holstein, Các bước thực hiện: - Rửa ba lần mẫu máu với ml dung dịch hòa tan gồm (0,32 M đường sucrose, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, mM MgCl2 1% Triton X- 100) Các tế bào bạch cầu tái lơ lửng 0,5 ml 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 1% Triton X-100 60ng/µl proteinase K - Dung dịch ủ 50ºC giờ, sau ủ 95ºC 15 phút, làm bất hoạt enzyme proteinase K DNA lưu trữ -20ºC sử dụng - Khảo nghiệm PCR: Khuếch đại phản ứng mẫu DNA lấy từ máu chuẩn bị với thể tích 25µl chứa: PCR đệm gồm (20 mM Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM KCl), 0,2 mM dNTPs, 0,5 đơn vị Taq polymerase DNA, 1,5 mM MgCl2, 200 nM, đoạn mồi trước, 5'CCCTGCCAGTCCAGCTGGACACC3' đoạn mồi ngược 5'CCACGCCCATCATTCTGGGGCAG3' 100 ng gene DNA Khuếch đại thực 35 chu kỳ (15 chu kỳ 94ºC 20 chu kỳ 69ºC) Sau lấy µl ủ với enzyme TaqI HaeIII, 1,5 65ºC 37ºC, tương ứng Sản phẩm phân tích 4% đường agarose ethidium bromide - Cách đọc kết quả: Các đoạn mồi sử dụng để khuếch đại đoạn DNA 58 bp Các enzymee TaqI hạn chế sản phẩm PCR thành hai mảnh vỡ 26 32 bp động vật bình thường homozygote (hình 1, tất đường, ngoại trừ 5, 7, 18 22, hình, đường 1, 2, 3, 5) Dị hợp tử động vật cho ba mảnh vỡ 58, 26 32 bp (hình 1, đường 5, 7, 18 22) 184 Để xác nhận xuất đột biến CD18, mẫu ủ với enzyme HaeIII Các enzyme tác động sản phẩm PCR thành hai mảnh vỡ 49 bp cá thể bình thường thành ba mảnh 9, 19 30 bp động vật bị ảnh hưởng Dị hợp tử động vật có bốn mảnh 9, 19, 30 49 bp (Ribeiro L A ctv, 2000) 3.1.2.2 Kỹ thuật lai phân tử Southern blot  Khái niệm kỹ thuật lai phân tử Southern blot Theo Nguyễn Ngọc Hải (2007), kỹ thuật lai phân tử bắt cặp đoạn dò acid nucleic mạch đơn với mạch đơn acid nucleic khác từ mẫu Dựa nguyên tắc bắt cặp bổ sung nucleotide, bắt cặp xảy chuỗi nucleotide có trình tự bổ sung hồn tồn tương đồng xảy trường hợp tương đồng chuỗi phần triệu Điều định tính đặc hiệu phản ứng lai sở ứng dụng cho việc chẩn đốn phân biệt lồi vi sinh vật khác đột biến di truyền Kỹ thuật Southern blot Edward Southern phát minh năm 1970, cho phép nghiên cứu DNA gene, kiểm tra kết chuyển gene kiểm tra có mặt gene (1 trình tự DNA) gene tế bào 185 Hình 3.8 Nguyên tắc lai phân tử (Bùi Minh Trí, 2006)  Các bước Southern blot (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) - Đầu tiên cần tách chiết DNA gene tế bào, sử dụng enzyme giới hạn (RE) cắt phân tử DNA thành đoạn nhỏ, điện di gel agarose để tách đoạn DNA theo kích thước - Gây biến tính DNA (biến thành mạch đơn) gel dung dịch kiềm (thường dùng NaOH 0,5 M: MaCl 1,5 M), sau chuyển đoạn DNA từ gel lên màng lai sức mao dẫn (màng lai thường sử dụng màng nitrocellulose) Vị trí đoạn DNA gel giữ nguyên chuyển lên màng lai - Sử dụng mẫu dị (probe) có đánh dấu phóng xạ lai với đoạn DNA màng lai, tạo nên phân tử DNA lai Tiến hành lai phân tử cách cho vào hợp lai chuyên dụng lớp khoảng 0,2 – 0,4 cm dịch lai, chứa mồi có đánh dấu phóng xạ Đặt màng lai vào hộp lai nhiệt độ 650C/3 – giờ, sau thêm dịch lai với chế độ nhiệt 650C lắc nhẹ để tăng tốc độ phản ứng Rửa màng lai dung dịch SSC (NaCl, natri citrate nước) nhiệt độ 650C hai đến ba lần để loại bỏ mẫu dị khơng bắt cặp chun biệt với DNA cố định màng Sau rửa thấm khô giấy lọc sấy khơ 650C - Thực phóng xạ tự ghi (autoradiography) để định vị phân tử lai (DNA gene – mẫu dò) cách đặt phim nhạy cảm với tia phóng xạ áp sát màng lai Các phân tử lai (các mẫu dị có đánh dấu phân tử lai) tác động lên phim giây đọc kết lai qua chấm đen phim  Ứng dụng Southern blot Xác định diện, kích thước, số lượng sao, tính đồng dạng DNA phức hợp (phát gene đặc biệt gene nguyên vẹn) 186 Hình 3.9 Các bước kỹ thuật Southern blot http://meds.queensu.ca/qcri/flow/cri-fc-getstarted.htm 3.2 Bệnh viêm vú bò sữa 3.2.1 Khái niệm bệnh viêm vú Theo Chung Anh Dũng (2007), bệnh viêm vú phổ biến bò sữa, thơng thường 50% bị bị nhiễm khoảng 5% thể rõ triệu chứng lâm sàng, có hai loại bệnh viêm vú: - Viêm vú lâm sàng nhiễm trùng lộ rõ bầu vú thể triệu chứng qua mức độ thay đổi sữa (sữa bị vón, lỗng, màu sắc mùi khác thường); hình dạng bầu vú thay đổi (bầu vú sung huyết, sưng to…), vài trường hợp dẫn đến triệu chứng toàn thân (sốt, hay bỏ ăn…) - Viêm vú cận lâm sàng hay gọi viêm vú tiềm ẩn chưa có dấu hiệu viêm, nghĩa số lượng tế bào soma (Somatic cell counts- SCC) sữa cao khơng có bất thường rõ ràng sữa bầu vú Đối với trường hợp viêm vú tiềm ẩn lâm sàng thể nhẹ khó phát mắt thường thơng qua việc sờ khám bầu vú mà phát thơng qua số chẩn đốn phi lâm sàng như: Kiểm tra thử nghiệm CMT 187 (California Mastitis Test), đếm số lượng tế bào soma phát vi khuẩn để chẩn đoán bệnh viêm vú cận lâm sàng (Varatanovic N ctv, 2010) 3.2.2 Kỹ thuật sinh học chẩn đoán bệnh viêm vú 3.2.2.1 Phương pháp thử viêm vú CMT (California Mastitis Test) Theo Mellenberger R (2001), CMT xét nghiệm dùng để chẩn đoán bệnh viêm vú tiềm ẩn cách dùng thuốc thử Leucocytest (thành phần 10% Teepol 1/10.000 bột Bromo cresol)  Nguyên tắc Thuốc thử Leucocytest chất có hoạt tính bề mặt (làm thay đổi sức căng bề mặt), có đặc tính làm gel hóa sữa có chứa tế bào bạch cầu, dẫn đến thay đổi tính chất nhớt sữa Phản ứng gel hóa tự đánh giá theo cách bán định lượng theo mối tương quan với mức độ viêm nhiễm đặc hiệu bầu vú (Mellenberger R., 2001) Bảng 3.1 Giải thích kết CMT (Mellenberger R., 2001) Mức độ CMT Số lượng tế bào Kết luận Hỗn hợp đồng nhất, màu xám 100.000 Bình thường Hỗn hợp lợn cợn, màu xám ngã tím T 300.000 Nghi ngờ Sự vón cục bền nhìn thấy rõ, màu xám tím 900.000 Viêm vú tiềm ẩn Đóng vón dày thành đám nhớt, màu tím 2.700.000 Viêm vú tiềm ẩn 8.100.000 Viêm vú tiềm ẩn gần biểu lâm sang Hỗn hợp sữa thuốc thử Đóng vón dày giống lịng trắng trứng, màu tím đậm 188  Các bước tiến hành đọc kết CMT 1/ Vắt lấy sữa đầu từ núm vú (đánh dấu số thứ tự núm vú) 2/ Chỉ lấy ml sữa đầu từ núm vú 3/ Cho vào ô (đã chứa ml sữa) ml thuốc thử leucocytest 4/ Lắc hỗn hợp 5/ Xét nghiệm phải đọc Nếu bạn chờ đợi lâu, kết không đáng tin cậy Hình 3.10 Các bước tiến hành CMT http://www.dgz.be/ondersteuning/programmas_runderen/gezonmelk_cmt.asp 189 Mức độ Mức độ Mức độ Nghi ngờ Hình 3.11 Cách đọc kết CMT http://www.dgz.be/ondersteuning/programmas_runderen/gezonmelk_cmt.asp 3.2.2.2 Máy đếm tế bào (flow cytometer) a Khái niệm tế bào soma Theo Viện Chăn nuôi (2001), tế bào soma tế bào bình thường thể có số lượng thấp sữa Nếu số lượng tế bào soma tăng sữa điều khơng bình thường, điều dẫn đến chất lượng sữa bị giảm bò bị nhiễm trùng phía tuyến vú Số lượng tế bào soma (somatic cell counts- SCC) dùng để đánh giá chất lượng sữa Thành phần tế bào chủ yếu tổng số tế bào soma (SCC) tế bào bạch cầu số tế bào tuyến vú (tế bào biểu mô) Các tế bào biểu mơ phận bình thường thể, chúng bị bong lại tái sinh bình thường Tế bào 190 bạch cầu có vai trò bảo vệ thể để chống lại bệnh tật hỗ trợ việc xây dựng lại mô bào tuyến vú bị tổn thương Số lượng SCC đàn bị bình thường nhìn chung 200.000/ml, số lượng SCC 250.000-300.000/ml cho ta biết đàn bò bị viêm vú vi sinh vật b Máy phát viêm vú điện tử hay máy đo điện trở sữa Theo Chung Anh Dũng (2007), nhấn công tắc máy phát viêm vú khơng có sữa cốc đo, hình hiển thị số “1 0”, chứng tỏ pin kết nối tốt với dụng cụ khơng có thử nghiệm Cầm cốc đo đặt núm vú thùy vú muốn kiểm tra, vắt sữa trực tiếp vào cốc đo đến ngang vạch quy định cốc Sau ấn cơng tắc giữ 1-2 giây hình hiển thị số Nếu sử dụng loại máy điều chỉnh nhiệt độ, kết phải ghi nhận sau vắt sữa đầy cốc đo Dựa kết máy đo để đánh giá mức độ viêm vú (A) (B) Hình 3.12 (A) Máy đo điện trở sữa (B): Máy đếm tế bào soma (Nguồn: http://apsdairycell.apstherapy.fr/html/DairyCell%20info%20mastitis%202008 htmhttp://www.easterndairy.ca/management.html) c Nguyên tắc máy đếm tế bào Máy đếm tế bào phân tích lượng lớn tế bào đơn Thiết bị gồm hệ thống thủy động học áp lực, chùm laser, mặt phẳng chặn tia laser/dòng tế bào, chuỗi máy dị ánh sáng phân tích số liệu Quá trình thu nhận số liệu sau: - Tế bào nhuộm thuốc tế bào (huỳnh quang), cho dòng tế bào vào máy đếm chảy theo ống nhỏ có lỗ cho tế bào qua Dòng tế bào qua vùng có tia laser để kích hoạt phẩm nhuộm huỳnh quang Tín hiệu huỳnh quang tiếp nhận hệ thống máy vi tính để phân tích tín hiệu từ tính số lượng tế bào 191 - Sau nhuộm tế bào tích điện tích khác bề mặt tế bào nên dùng từ trường điện để tách loại tế bào riêng biệt (Trần Thị Dân, 2005) Hình 3.13 Nguyên lý máy đếm tế bào http://meds.queensu.ca/qcri/flow/cri-fc-getstarted.htm 3.2.2.3 Kỹ thuật ELISA (Enzymee-linked immunosorbent assay) Theo Charlier J ctv (2005), dùng kỹ thuật ELISA để chẩn đốn phát bệnh viêm vú bị sữa Trong kỹ thuật ELISA người ta sử dụng enzyme đánh dấu thay cho chất đồng vị phóng xạ ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) kỹ thuật sinh hóa để phát kháng thể hay kháng nguyên mẫu xét nghiệm Hiện ELISA sử dụng nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học, nông nghiệp đặc biệt kiểm tra an toàn sản phẩm sinh học a Nguyên lý Theo Nguyễn Ngọc Hải (2007), số enzyme alkaline phosphatase hay peroxidase gắn kết với kháng thể cách không đặc hiệu, enzyme nhận biết nhờ vào phản ứng chúng với chất tương ứng, nhờ thơng qua enzyme nói để phát kháng thể gắn kết với chúng Hoạt tính xúc tác enzyme giải phóng oxy nguyên tử từ H2O2, oxy oxy hóa chất thị màu, làm thay đổi màu hỗn dịch Chất thị màu thay đổi chứng minh có mặt enzyme kết hợp kháng nguyên với kháng thể Như vậy, kỹ thuật ELISA gồm thành phần tham gia phản ứng: 192 - Kháng nguyên: thường gắn sẵn giá Hiện người ta thường sử dụng loại giá đĩa ELISA 96 giếng - Kháng thể cần xác định huyết - Conjugate phức hợp có gắn chất thị màu Kỹ thuật bao gồm hai bước: - Phản ứng miễn dịch học: kết hợp kháng nguyên kháng thể - Phản ứng hóa học: nhờ hoạt tính enzyme để giải phóng oxy nguyên tử oxy nguyên tử oxy hóa chất thị màu Chất thị thay đổi màu có nghĩa chứng minh có mặt enzyme chứng minh kết hợp kháng nguyên với kháng thể b Phân loại Có nhiều loại kỹ thuật ELISA dùng chẩn đoán: ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp, ELISA cạnh tranh,… Hình 3.14 Các bước Sandwich ELISA (http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/ELISA) Giải thích: (1) Phủ đĩa KT; (2) Thêm mẫu cần xác định KN KN (nếu có) gắn với KT; (3) kháng thể dùng để phát thêm vào kết hợp với KN; (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme KT thứ cấp gắn với KT dùng để phát hiện; (5) Thêm chất Enzyme làm biến đổi chất phát tín hiệu phát đo + Kỹ thuật ELISA trực tiếp Kháng nguyên gắn vào đáy giếng phản ứng sau phủ lên kháng thể đặc hiệu gắn enzyme ủ nhiệt độ thời gian thích hợp Sau rửa để loại bỏ kháng thể gắn enzyme (conjugate) không kết hợp với kháng nguyên cho vào giếng chất màu Đọc kết sau 10 phút quang phổ kế Có thể đọc kết theo hai trường hợp sau: + Nếu kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể có kết hợp kháng ngun kháng thể gắn enzyme (conjugate) không bị rửa trôi, giếng có diện enzyme Enzyme giải phóng oxy nguyên tử từ H2O2 (cho vào chất màu) để oxy hóa chất màu làm thay đổi màu hỗn dịch giếng 193 + Nếu kháng ngun khơng đặc hiệu với kháng thể không xảy kết hợp kháng nguyên – kháng thể, conjugate bị rửa trơi giếng khơng có enzyme để giải phóng oxy nguyên tử từ H2O2 oxy hóa chất màu kết hỗn dịch giếng phản ứng khơng thay đổi màu Hình 3.15 Kỹ thuật ELISA trực tiếp (http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1194) + Kỹ thuật gián tiếp Về ngun tắc kỹ thuật gián tiếp khơng khác so với kỹ thuật trực tiếp kỹ thuật gián tiếp có tăng thêm bước phản ứng Conjugate kỹ thuật trực tiếp kháng thể đặc hiệu gắn enzyme, conjugate phản ứng gián tiếp kháng thể khác lồi kháng lại kháng thể có mặt huyết cần chẩn đoán Với phản ứng gián tiếp kháng thể đặc hiệu có hai chức năng: kháng thể kháng nguyên, hai kháng nguyên conjugate Khi đọc kết có hai trường hợp xảy ra, tương tự kỹ thuật ELISA trực tiếp: phản ứng dương tính màu hỗn dịch thay đổi ngược lại phản ứng âm tính màu hỗn dịch khơng thay đổi Hình 3.16 Kỹ thuật ELISA gián tiếp http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1194 + Kỹ thuật ELISA cạnh tranh 194 Hình 3.17 Kỹ thuật ELISA cạnh tranh http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1194 Trong ELISA cạnh tranh, conjugate kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên gắn bề mặt giếng Do có cạnh tranh kháng thể huyết conjugate trình gắn kết với kháng nguyên để hình thành phức hợp kháng nguyên- kháng thể, kháng nguyên- conjugate Phức hợp kháng nguyên- kháng thể phức hợp kháng nguyên- conjugate có màu đậm so với mơi trường ngược lại Tùy vào mức độ đậm nhạt màu (được đánh giá tỷ số chênh OD ánh sáng có độ dài sóng thích hợp) mà người ta xác định dương tính, âm tính hay nghi ngờ c Ứng dụng ELISA Phát kháng nguyên hay kháng thể kháng kháng nguyên d Cách thực kỹ thuật ELISA chẩn đốn bệnh viêm vú bị sữa Lấy mẫu sữa huyết thanh: mẫu sữa thu thập hàng tuần cần vô trùng trước vắt sữa Sữa (0,1 ml) cấy trực tiếp cừu máu agar ấp 18-24 h 370C xét nghiệm vi khuẩn Hoặc 10 ml sữa bị đơng lạnh -200C vịng sau thu huyết học để phân tích thêm Mẫu máu thu thập hàng tuần sau vắt sữa Huyết thu thập sau ly tâm (15 phút 2.000 vòng / phút) lưu trữ -200C pha loãng lần (vol / vol) với glycerol Đối với phương pháp ELISA, đĩa thí nghiệm gồm 96 giếng tráng 100 pl kháng nguyên Listeria monocytogenee ủ cacbonat-bicarbonate đệm (0,1 M, pH 9,6) Sau rửa với dung dịch PBS có bổ sung 0,1% (vol/vol) Tween 20 (Sigma Chemical Co) Sau rửa, giếng bão hòa với 150 pl PBS có bổ sung 0,5% (wt / vol) gelatin 370C để làm giảm hấp phụ khơng đặc hiệu Sau bổ sung chất thị màu đọc kết quang phổ (Bourry A ctv, 1996) 195 3.2.2.4 Một số phương pháp khác chẩn đốn viêm vú tiềm ẩn bị sữa a Kiểm tra thay đổi pH sữa Theo Chung Anh Dũng (2007), bình thường sữa bị có pH khoảng 6,5 đến 6,7 thường 6,6 nhiệt độ 25oC Khi pH cao 6,7 vú bị viêm, pH thấp 6,5 sữa có chứa sữa đầu hay sữa bị vi khuẩn lên men Để xác định pH sữa, sử dụng chất thị màu có khoảng chuyển màu phù hợp với pH thay đổi sữa, chất hay dùng là: Chất thị màu 7 Xanh methylen Màu vàng Màu xanh mạ Màu xanh Phenol Red Màu vàng gạch Màu đỏ vàng Màu đỏ thẩm b Dựa vào phương pháp thử cồn (ethanol 68%) Theo Chung Anh Dũng (2007), tỷ lệ sữa: cồn 1:1, cho ml sữa vào ống nghiệm khô, cho ml cồn, đảo nhẹ, quan sát cục vón dọc theo thành ống nghiệm, yêu cầu phải đảm bảo chất lượng nồng độ cồn đủ tiêu chuẩn (cồn ethanol 68% = 68 ml cồn ethanol 96% + 28 ml nước cất) Nếu thấy sữa bị kết tủa, đơng vón lợn cợn dọc theo thành ống nghiệm  nghi ngờ viêm vú c Dựa vào thời gian màu thuốc thử xanh methylen Mẫu sữa thử nghiệm điều kiện vô trùng, cho vào ống nghiệm 10 ml sữa, cho thêm vào 1ml blue methylen 5%, nút ống lại, lắc nhẹ cho dung dịch trộn sau đem ủ ấm 370C, quan sát đổi màu đọc kết (Chung Anh Dũng, 2007) Kết luận Ngày việc chẩn đốn bệnh thú y ngồi phương pháp thơng thường cịn có tiến khoa học ngành công nghệ sinh học đem lại hiệu cao Có nhiều ứng dụng kỹ thuật sinh học chẩn đốn bệnh bị sữa với độ xác cao, cụ thể: - Bệnh BLAD dùng kỹ thuật PCR, kỹ thuật lai phân tử Southern blot để phát gene đột biến gây bệnh - Bệnh viêm vú tiềm ẩn dùng phương pháp CMT, thử cồn, thử methylen, đo độ pH, máy kiểm tra viêm vú, máy đếm tế bào soma kỹ thuật ELISA 196 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Thị Dân, 2005 Công nghệ sinh học chăn nuôi gia súc Nhà xuất Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh Chung Anh Dũng, 2007 Quy trình chẩn đốn, phịng trị bệnh viêm vú bị sữa Viện Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp miền Nam Nguyễn Ngọc Hải, 2007 Công nghệ sinh học thú y Nhà xuất nông nghiệp Tp HCM Bùi Minh Trí, 2006 Bài giảng cao học mơn sinh học phân tử Phạm Hùng Vân, 2009 PCR real-time PCR vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học, chi nhánh Tp HCM 3-33 Tiếng nước Bourry A and Poutrel B., 1996 Bovine Mastitis Caused by Listeria monocytogenees: Kinetics of Antibody Responses in Serum and Milk After Experimental Infection Charlier J., Duchateau L., Vangroenweghe F., Claerebout E., Burvenich C et Vercruysse J., 2005 The effect of an experimentally induced acute mastitis on the test results of an Ostertagia ostertagi milk ELISA 136(2):161-5 Mellenberger R., 2001 California Mastitis Test (CMT) An Invaluable Tool for Managing Mastitis Ribeiro L A., Baron E E., Martinez M L and Coutinho L L., 2000 PCR screening and allele frequency estimation of bovine leukocyte adhesion defiency in Holstein and Gir cattle in Brazil Geneetics and Molecular Biology, 23, 4, 831-834 10 Ruegg P L et Reinemann D J., 2002 Milk Quality and Mastitis Tests University of Wisconsin, Madison 11 Varatanovic N., Podzo M., Mutevelic T., Podzo K., Cengic B., Hodzic A et Hodzic E., 2010 Use of caifornia mastitis test, somatic cells count and bacteriological findings in diagnostics of subclinical mastitis Biotechnology in Animal Husbandry 26 (1-2), p 65-74 Trang web http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1194 http://www.tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/ELISA http://www.meds.queensu.ca/qcri/flow/cri-fc-getstarted.htm http://www.dgz.be/ondersteuning/programmas_runderen/gezonmelk_cmt.asp http://www.ias-cnsh.org/TrangCh%e1%bb%a7/tabid/36/EntryID/11/Default.aspx http://www.meds.queensu.ca/qcri/flow/cri-fc-getstarted.htm 197 ... DNA mà DNA có sợi DNA methyl hóa Enzyme nhận biết methyl –CpG sợi DNA methyl hóa vị trí C sợi DNA đơn (Gruenbaum ctv, 1982; Bestor Ingram, 1983) Enzyme tham gia vào methyl hóa DNA: người, q trình. .. mặt nhân tố phiên mã hay chép DNA Do gọi bước suy tàn methyl hóa giai đoạn phơi dâu Q trình suy giảm kết thiếu vắng DNA methyl transferase, Dnmt1, suốt trình chép Bởi vậy, sau chép mạch DNA vừa... hóa thiết lập cho hệ 3.4 Các vấn đề cần quan tâm Sự tái lập trình ngồi nhân khơng phù hợp dẫn đến hậu bất thường nguy hiểm đến sức khỏe động vật chuyển nhân Phôi từ nguồn tế bào chuyển nhân phải