KIỂU GEN của SIÊU VI VIÊM GAN c ở VIỆT NAM

14:28, 21/10/2022 KIỂU GEN CỦA SIÊU VI VIÊM GAN C Ở VIỆT NAM Home Page | Tài liệu chuyên môn | Bạn cần biết hệ | Thông tin hội nghị | Liên   KIỂU GEN CỦA SIÊU VI VIÊM GAN C Ở VIỆT NAM Hồ Tấn Đạt, Phạm Thị Thu Thủy, Nguyễn Thanh Tịng, Nguyễn Bảo Tồn, Phan Hữu Bội Hồn, Nguyễn Bá Tịng, Nguyễn Thị Kiều Oanh, Đỗ Thị Thùy Trang Trung Tâm Y Khoa MEDIC, TP Hồ Chí Minh Tóm tắt   Kiểu gen siêu vi gây viêm gan C (HCV genotype) phân bố khác tùy theo vùng địa dư, châu lục hay nước có kiểu gen HCV vượt trội riêng Chúng tơi ứng dụng kỹ thuật LiPA để xác định tần suất kiểu gen HCV người Việt Nam bị viêm gan siệu vi C mãn tính Ngồi chúng tơi tìm hiểu mối liên hệ yếu tố quan trọng việc tiên lượng đáp ứng điều trị đặc hiệu kiểu gen HCV định lượng siêu vi C kỹ thuật Branched DNA Trong thời gian từ tháng 4/2004 đến tháng 1/2005, phòng xét nghiệm Trung Tâm Y Khoa MEDIC, thực LiPA cho 327 trường hợp Trong đó, nam chiếm 57,5%, nữ chiếm 42,5% với tuổi trung bình 47,90 ± 10,58 Chúng tơi xác định kiểu gen 1, 2: kiểu gen HCV chiếm 58,4%( 1: 5,8%; 1a: 6,4%; 1a/1b: 0,3%; 1b: 45,9%), kiểu gen 6( toàn 6a: 23,9% ) kiểu gen 13,1%(  2: 1,5%; 2a/2c: 11,6%) Chỉ có trường hợp kiểu gen 3b (0,3%) Có 14 trường hợp ( 4,3% ) khơng xác định kiểu gen HCV kỹ thuật LiPA,  tiếp tục thực kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) để xác định kiểu gen HCV (Hệ thống Trugene, Bayer) và  xác định tất kiểu gen 14 trường hợp đó: Kiểu gen : trường hợp; 1b: 2; 2a: 1; 2c: 1; 6a: Có 229 trường hợp thực định lượng siêu vi C máu Lượng siêu vi dao động từ 3.200 sao/ml (Copies/ml) đến 40.000.000 sao/ml, trung bình 6,46x106 ± 8,50x106 sao/ml Kiểu gen HCV 1, 2, có lượng siêu vi C 2x106 sao/ml 91, 18, 32 trường hợp; có lượng siêu vi C 2x106 copies/ml 46, 15, 27 trường hợp Qua chúng tơi nhận thấy khơng có khác có ý nghĩa lượng siêu vi C máu kiểu gen 1, 2, siêu vi C ( p> 0,05) Summary PREVALENCE OF HCV GENOTYPES IN VIETNAM www.drthuthuy.com/reseach/VNGenotype.html 1/11 14:28, 21/10/2022 KIỂU GEN CỦA SIÊU VI VIÊM GAN C Ở VIỆT NAM Hepatitis C virus (HCV) genotypes are distributed differently depending on geography and etiology of infection We studied the spectrum of HCV genotypes in Vietnamese patients The incidence of Hepatitis C virus isolates was found in clinical practice is of great clinical significance to the treatment of HCV infected patients as different subtypes may respond unequally to therapy In our study, we performed the LiPA to identify HCV genotype and to evaluate the prevalence of HCV genotype in Vietnamese patients, and comparison of serum virus loads among patients infected with Hepatitis C Virus genotypes 1, and A total of 327 HCV RNA positive patients were enrolled (Male 57.5%, female 42.5% with mean age of patients 47.90 ± 10.58 years ) from April 2004 to January 2005 At the same time, we collected 229 random serums in this group to perform Branched DNA for HCVRNA quantification The received results were genotypes and were the most common genotypes, followed by type and the rare genotype in alone patient Genotype was seen in 58.4% (Type 1: 5.8%; 1a: 6.4%; 1a/1b: 0.3%; 1b: 45.9%) while genotype 6a in 23.9%, genotype in 13.1% (Type 2: 1.5%; type 2a/2c: 11.6%) and genotype 3b was in 0.3%, fourteen samples (4.3%) were unclassified Then we performed sequencing based on 5’UT with Trugene system identified genotype (2 cases), 1b (2 cases), 2a (1 case), 2c (1 case), 6a (8 cases) but not typed by LiPA 229 patients had viral loads above 3,200 copies/ml (Range: 3,200 - > 40,000,000 copies/ml, with 6,46x10­6 ± 8,50x10­6 copies/ml ) HCV genotype 1, 2, which have quantity HCV RNA above 2x106 copies/ml were in 91, 18, 32 cases, and below 2x10­6 copies/ml were in 46, 15, 27 cases, respectively We observed that there’s no significant difference in virus load between patients infected with genotype 1, 2, (P>0.05) I Đặt vấn đề: Viêm gan siêu vi C (HCV) bệnh nguy hiểm triệu chứng lâm sàng thường mơ hồ, hậu bệnh để lại thường nặng nề như: 50%-80% chuyển qua mạn tính, có tới 20%-25% bệnh nhân mạn tính diễn tiến qua xơ gan ung thư gan 5,12,14,18,21,25,29 Do đó, chẩn đốn xác tác nhân HCV mục tiêu quan tâm hàng đầu bác sĩ, từ điều trị, theo dõi diễn tiến biến chứng bệnh, phòng ngừa lây lan HCV Cho đến nay, vấn đề điều trị đặc hiệu siêu vi gây viêm gan C nhiều khó khăn tốn mặt thời gian tiền bạc Đồng thời gần có lựa chọn thuốc đặc trị Interferon, mà tùy theo hệ thuốc làm www.drthuthuy.com/reseach/VNGenotype.html 2/11 14:28, 21/10/2022 KIỂU GEN CỦA SIÊU VI VIÊM GAN C Ở VIỆT NAM cho bệnh nhân phải gánh chịu thêm số khó khăn dùng thuốc chích tác dụng phụ thuốc1,6,18,19,21,27 Do đó, bệnh nhân có định điều trị đặc hiệu cho siêu vi viêm gan C trước bắt đầu điều trị phải làm xét nghiệm yếu tố quan trọng có vai trị tiên lượng cho thành công thời gian cần thiết điều trị kiểu gen siêu vi gây viêm gan C ( HCV genotype) định lượng siêu vi máu5,11,14,25; Và vài số khác SGOT, SGPT, siêu âm, … Kiểu gen HCV phân bố khác tùy theo vùng địa dư, châu lục hay nước có kiểu gen HCV vượt trội riêng4,5,7,8,10,12,15,27 Do đó, chúng tơi sử dụng kỹ thuật LiPA ( Là kỹ thuật sinh học phân tử) để xác định kiểu gen HCV người Việt Nam với mục đích phục vụ cho việc điều trị đặc hiệu khảo sát kiểu gen HCV chiếm chủ yếu người Việt Nam Bên cạnh đó, chúng tơi ứng dụng kỹ thuật bDNA để định lượng HCV máu thử tìm mối liên hệ kiểu gen HCV số lượng siêu vi C máu: Có hay khơng khác số lượng siêu vi C kiểu gen khác nhau1,3,7,9 Mục tiêu nghiên cứu là: (1) Xác định kiểu gen HCV người Việt Nam; (2) Đánh giá hiệu kỹ thuật LiPA việc xác định kiểu gen HCV người Việt Nam; (3) Khảo sát mối liên hệ kiểu gen HCV số lượng siêu vi C máu II Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu Các bệnh nhân Việt Nam chẩn đoán nhiễm HCV đến thực kiểu gen HCV định lượng HCV trung tâm y khoa MEDIC, từ tháng 04/2004 đến 1/2005 Có HCVRNA dương tính Phương pháp nghiên cứu 2.1 Thực LiPA Xác định HCVRNA: Kỹ thuật nested PCR (Khếch đại DNA đích PCR tổ) Ly trích RNA dựa theo qui trình Chomozynski: Ly trích RNA Phenol– chloroform Thực tổng hợp cDNA máy luân nhiệt Bio-Rad, theo chương trình sau: 25­oC/5 phút, 42­­oC/30 phút, 85oC/5 phút, Sau tiến hành phản ứng nested PCR máy luân nhiệt ( Bio-Rad), theo chu kỳ nhiệt sau : 95­­oC/5 phút; 94­­oC/ 30 giây, 70­­oC/30 giây, 20 chu kỳ; 94­­oC/30 giây, 55­­oC/30 giây, 72­­oC/ phút, 40 chu kỳ; 72­­oC cho 10 phút; Sau giữ 4­oC Chúng tơi sử dụng hóa chất thuốc thử sau để thực RT PCR: Enzym Reverse Transcriptase (Pharmacia), Enzym Taq polymerase (Pharmacia), dNTP (Pharmacia), Primer NP & OP ( Trên vùng 5’UT HCV, Bayer), MgCL2, MnCL2 Điện di phân tích kết thạch agarose 2%, kích thước sản phẩm PCR dài 240 cặp base (bp), chụp hình hệ thống Gel Doc Bio-Rad Thực trình lai sản phẩm PCR có ( Với Primer NP & OP có gắn Biotin www.drthuthuy.com/reseach/VNGenotype.html 3/11 14:28, 21/10/2022 KIỂU GEN CỦA SIÊU VI VIÊM GAN C Ở VIỆT NAM Bayer) với que (strip) thuốc thử LiPA Trên que có vạch gắn sẵn đoạn dị (Probes) chun biệt cho kiểu gen HCV, sau lai đọc kết theo bảng hướng dẫn  cung cấp nhà sản xuất (Bayer) 2.2 Định lượng HCV Kỹ thuật: Branched DNA( Khếch đại tín hiệu) Thuốc thử dùng cho kỹ thuật của  Bayer, hệ Thực máy System 340 bDNA Analyzer, Bayer 2.3 Men gan: SGOT, SGPT Kỹ thuật thực theo phương pháp động học (Kinetic), đo bước sóng l=360 nm Thuốc thử  hãng Waco, Nhật Thực máy Hitachi 747 2.4 Phương pháp nghiên cứu: Tiền cứu cắt ngang Thống kê: Phần mềm SPSS for Win, Ver 7.5 III Kết quả: Tổng HCV số có 327 trường hợp thực LiPA để xác định kiểu gen Tuổi nhỏ 19, lớn 79 với độ tuổi trung bình 47,90±10,58.  Nam có 188 trường hợp ( 57,5%) với độ tuổi trung bình 47,22±11,35; nữ có 139 trường hợp ( 42,5%) với độ tuổi trung bình 48,81±9,39 Kiểu gen HCV 327 trường hợp bệnh nhân Việt Nam Bảng Kiểu gen HCV 1a 1a/1b 1b 2a/2c 3b 6a Không định kiểu gen Tổng Số lượng 19 21 150 38 78 14 327 4,3% 100% Phần trăm Khảo sát HCVRNA(+) 5,8% 6,4% 0,3% 45,9% 1,5% 11,6% 0,3% 23,9% thay đổi men gan www.drthuthuy.com/reseach/VNGenotype.html 327 trường hợp nhiễm HCV có 4/11 14:28, 21/10/2022 KIỂU GEN CỦA SIÊU VI VIÊM GAN C Ở VIỆT NAM Sự thay đổi SGOT: Nhỏ 13, lớn 308 U/L, với giá trị trung bình 53,95±45,56 U/L Sự thay đổi SGPT: Nhỏ 10, lớn 390 U/L, với giá trị trung bình 53,31±51,15 U/L Bảng   Kiểu gen Kiểu gen Kiểu gen Kiểu gen Không định kiểu gen SGOT 61±52 U/L 42±34 U/L 121 U/L 45±32 U/L 36±18 U/L SGPT 60±58 U/L 41±41 U/L 115 U/L 46±38 U/L 35±23 U/L Tổng 229 trường hợp định lượng siêu vi C máu cộng có thực đồng thời kiểu gen HCV Tuổi nhỏ 19, lớn 77 với độ tuổi trung bình 47,92±10,56 Nam có 135 trường hợp (59%) với độ tuổi trung bình 47,49±11,44 Nữ có 94 trường hợp (41%) với độ tuổi trung bình 48,54±9,18 Bảng   ³  2x10­6  sao/ml 0.05): Kiểu gen nghĩa luợng siêu vi C nhiều kiểu gen & ngược lại7,9 Qua bảng cho ta thấy trị số trung bình độ lệch chuẩn (SD) số lượng siêu vi C kiểu gen 1, khác biệt rõ rệt.       Sự thay đổi men gan ( SGOT, SGPT) Tăng men gan ( SGOT, SGPT) thường dấu hiệu tổn thương hoại tử tế www.drthuthuy.com/reseach/VNGenotype.html 8/11 14:28, 21/10/2022 KIỂU GEN CỦA SIÊU VI VIÊM GAN C Ở VIỆT NAM bào gan Sự thay đổi men gan nhiễm HCV thường khơng nhiều6,12,18,21, đa số giới hạn bình thường làm cho không lưu tâm bỏ sót bệnh khơng nghĩ đến nhiễm HCV Qua nghiên cứu 327 trường hợp nhiễm HCV, ghi nhận giá trị SGOT 53,95±45,56 U/L SGPT 53,31±51,15 U/L V Kết luận: Kiểu gen HCV chiếm nhiều nhất, thứ kiểu gen Việt Nam Tuy nhiên, cần nghiên cứu thêm kiểu gen 7, 8, kiểu gen hay gặp Đông Nam Á đáp ứng với điều trị đặc hiệu Trong nghiên cứu chưa thấy có mối liên quan số lượng siêu vi C kiểu gen HCV Với kỹ thuật LiPA: 4,3% không định kiểu gen HCV, tất trường hợp xác định kiểu gen kỹ thuật giải trình tự chuỗi, giải trình tự chuỗi có hiệu việc xác định kiểu gen HCV   REFERENCES Considering HCV treatment Know your genotype and viral load HCV Advocate June, 2003 Vol 6, issue www.hcvadvocate.org Decker et al Hepatitis C 1997: Essay and Expert Opinions on its Natural History, Epidermiology, Diagnosis and Therapy Abbott Diagnostics Division Detmer et al Accurate Quantification of Hepatitis C Virus (HCV) RNA from All HCV Genotypes by Using Branched- DNA Technology Journal Of Clinical Microbiology Vol.34, No Apr 1996, p 901-907 Dev et al Southeast Asian Patients With Chronic Hepatitis C: The Impact of Novel Genotypes and Race on Treatment Outcome Hepatology, Vol 36, No 5, 2002 Doris B Strader at al Diagnosis, management, and treatment of Hepatitis C AASLD practice guideline American Association for the Study of Liver Diseases, 2004 Hepatology, Vol 39 No 4, April 2004 E Jenny Heathcote et al Peginterferon Alfa-2a in patients with chronic hepatitis C and cirrhosis N Engl J Med 2000; 343: 1673-80 Eugene R Schiff et al New Perspectives in the Diagnosis of Hepatitis C Seminars in Liver disease Vol 19, Suppl 1, 1999 Genotypes Explained Hepatitis-central.com/hcv/genotype Hawkins et al Comparison of Plasma Virus Loads among Individuals Infected with Hepatitis C Virus (HCV) Genotypes 1, 2, and by Quantiplex HCV RNA Assay Versions and 2, Roche Monitor Assay, and an In-House Limiting Dilution Method Journal Of Clinical Microbiology Vol 35, No Jan 1997, p 187-192 10 Halfon et al Hepatitis C virus genotyping based on 5’ noncoding sequence analysis ( Trugene) Journal of clinical microbiology, May 2001, p 1771-1773, Vol 39, www.drthuthuy.com/reseach/VNGenotype.html 9/11 14:28, 21/10/2022 KIỂU GEN CỦA SIÊU VI VIÊM GAN C Ở VIỆT NAM No 11 Jean-Michel Pawlotsky et al Standardization of Hepatitis C Virus RNA Quantification Hepatology, Vol 32, No 3, 2000 12 Johannes Bircher et al Clinical Hepatology Second Edition Oxford University Press 1999 p 858-868, 903-922 13 Johnson Y N Lau et al Significance of serum hepatitis C virus RNA level in chronic hepatitis C The Lancet Vol 341: June 12, 1993 14 Lothar Thomas Clinical Laboratory Diagnostics, Use and Assessment of Clinical Laboratory Results TH- Books 1999 p 1273-1278 15 Mindie H Nguyen et al Epidemiology and treatment outcomes of patients with chronic hepatitis C and genotypes to Reviews in Gastroenterological disorders Vol 4, suppl 1, 2004 16 Mindie H Nguyen et al High prevalence of novel genotypes in Vietnamese patients with chronic hepatitis C www.hcvadvocate.org/news/reports/DDW_2004/wednesday.htm 17 Nguyễn Thanh Hảo et al Genotýp virút viêm gan C Việt Nam Hội nghị chuyên đề bệnh gan mật Hội gan mật Hà Nội Tháng 4/2000 18 NIH Consensus Statement National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: Management of Hepatitis C: 2002-June 10-12, 2002 Hepatology, Vol 36, No 5, Suppl 2002 19 P Ferenci, MD Peginterferon alfa-2A (40 KD) (PegasysR) for the treatment of patients with chronic hepatitic C Int J Clin Pract., September 2003 Vol 57 No 20 P Trimoulet, H.J.A Fleury Genomic Characterization of Vietnamese HCV Isolates by a Novel Sequencing Mothod The 50th Annual Meeting & Postgraduate Courses of The AASLD November 5-9, 1999, Dallas, Texas USA 21 Sheila Sherlock & James Dooley Diseases of the Liver and Biliary System Elaventh Edition Blackwell Sciencen Ltd 2002 p 305-316 22 Sheraj Jacob et al Comparison of Quantitative HCVRNA Assays in Chronic Hepatitis C American Journal of Clinical Pathology Vol 107, No 3, March 1997 23 Sirirurg Songsivilai et al A Serotyping assay for Hepatitis C virus in Southeast Asia Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, September 1998, p 737 – 739, Vol 5, No 24 Stuyver et al Second-Generation Line Probe Assay for Hepatitis C Virus Genotyping Journal of clinical microbiology, Sept 1996, p 2259-2266 25 Thierry Poynard Hepatitis B and C, Management and Treatment Mertin Dunitz Ltd 2002 p 67-136 26 Trịnh Kim Ảnh et al Tình hình viêm gan virus B &  C bệnh viện Chợ Rẩy Mạng y khoa net 27 Update on hepatitis C infection Patient Care® Archive Medical Economics company at Montvale Mar 15, 2001 28 Yamada et al Efficacy of Interferon Alfa Therapy in Chronic Hepatitis C Patients Depends Primarily on Hepatitis C Virus RNA Level Hepatology Vol 22, No 5, 1995 29 Wilber J.C Manual of Clinical Microbiology 1995 Hepatitis C Virus, p 1050-1055 www.drthuthuy.com/reseach/VNGenotype.html 10/11 14:28, 21/10/2022 KIỂU GEN CỦA SIÊU VI VIÊM GAN C Ở VIỆT NAM   Home Page | Tài liệu chuyên môn | Bạn cần biết | Thông tin hội nghị | Liên hệ Copyright © 2005 Dr Phạm Thị Thu Thủy - Khoa gan - Trung tâm Y khoa Tp Hồ Chí Minh www.drthuthuy.com/reseach/VNGenotype.html 11/11 ... b? ?c Đồng thời gần c? ? lựa chọn thu? ?c đ? ?c trị Interferon, mà tùy theo hệ thu? ?c làm www.drthuthuy.com/reseach/VNGenotype.html 2/11 14:28, 21/10/2022 KIỂU GEN C? ??A SIÊU VI VIÊM GAN C Ở VI? ??T NAM cho... định kiểu gen HCV người Vi? ??t Nam với m? ?c đích ph? ?c vụ cho vi? ? ?c điều trị đ? ?c hiệu khảo sát kiểu gen HCV chiếm chủ yếu người Vi? ??t Nam Bên c? ??nh đó, chúng tơi ứng dụng kỹ thuật bDNA để định lượng HCV... tr? ?c tiếp dựa phân tích tr? ?c tiếp gen siêu vi C để x? ?c định kiểu gen siêu vi C (HCV genotype)2,15 Trư? ?c đây, phòng xét nghiệm chúng tơi c? ? th? ?c kỹ thuật miễn dịch x? ?c định type huyết siêu vi C